Возбудитель клещевого энцефалита: Клещевой энцефалит — Областная детская больница

из образцов сыворотки экстрагировали на QIAcube с помощью мини-набора для вирусной РНК QIAamp ^® (QIAGEN GmbH, Хильден, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. РНК из образцов мозга экстрагировали с помощью мини-набора RNeasy (QIAGEN GmbH, Хильден, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.Сразу после процесса экстракции РНК была обратно транскрибирована в кДНК с помощью случайных праймеров (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). Для обнаружения РНК TBEV была проведена собственная ПЦР с обратной транскриптазой (RT) в реальном времени в соответствии с Andreassen et al. (2012). ПЦР в реальном времени амплифицирует фрагмент из 54 пар оснований (п.н.), расположенный на гене оболочки TBEV. Положительный РНК-контроль («Соукуп») использовали в ПЦР в реальном времени [41]. В качестве отрицательного контроля использовали воду, свободную от нуклеаз.

Обнаружение антител к вирусу клещевого энцефалита

Образцы сыворотки ягнят были проанализированы на IgG ВКЭ с помощью коммерческого иммуноферментного анализа (ELISA, Enzygnost ^® Anti-TBE virus IgG, Siemens Healthcare, GmbH, Марбург, Германия) в соответствии с протоколом производителя с одной модификацией: конъюгат заменяли на меченное пероксидазой антитело против овечьих IgG (KPL, Гейтерсбург, США). Конъюгат IgG разводили 1: 50 000. Сыворотка овец, вакцинированных против ВКЭ вакциной TicoVac (Pfizer Ltd, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, UK), использовалась в качестве положительного контроля, а сыворотка овец, которые никогда не контактировали с клещами, использовалась в качестве отрицательного контроля [ 8].Все положительные и пограничные образцы из ELISA были дополнительно протестированы в тесте на нейтрализацию сыворотки (SNT), специфичном для TBEV, в Центре вирусологии Венского медицинского университета, как описано ранее [42].

Обнаружение

из образцов крови с ЭДТА экстрагировали на MagNA Pure 96 с помощью набора для ДНК MagNA Pure 96 и вирусного NA большого объема (Roche Molecular Systems, Inc. Базель, Швейцария) в соответствии с рекомендациями производителя.Для обнаружения A . phagocytophilum ДНК, метод количественной ПЦР в реальном времени проводили согласно Henningsson et al. 2015. Этот метод амплифицирует фрагмент гена gltA бактерии размером 64 п.н. [43]. Положительный А . phagocytophilum контроль и синтетическая плазмида (pAP-GltA, клонированная в pUC57, GenScript сотрудничества, Scotch plains, штат Нью-Джерси) были использованы в qPCR. В качестве отрицательного контроля использовали воду, свободную от нуклеаз.

Статистика

Все клинические и лабораторные данные были собраны в таблицах Microsoft Excel (2016) и переданы в Stata 14.2 для Windows (StataCorp, 4905 Lakeway Drive. College Station, Texas 77845) для статистического анализа. Качество данных и распределений было проанализировано с использованием таблиц и гистограмм. Первоначальный анализ включал многоуровневое моделирование линейной регрессии каждой из переменных непрерывного результата; ректальная температура, количество нейтрофилов, количество лимфоцитов, количество моноцитов, количественная ПЦР A . phagocytophilum и титр ВКЭ. Предикторами были «Группа» (воздействие) и «День» заражения, а переменной случайных эффектов — «Отдельные ягнята».Статистический анализ выполняли с 0 по 21 день после инокуляции TBEV и A . phagocytophilum . Остатки оценивались и визуализировались на квантильных графиках. p <0,05 считалось значимым. Дополнительные описательные статистические анализы были выполнены в Excel и GraphPad Prism версии 8.0.0 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).

Результаты

Часть первая: до и после инфицирования ВКЭ и

Ягнята в группах 1 и 3, которые были инокулированы ВКЭ, не имели клинических симптомов или лихорадки, а также имели кратковременную или необнаруживаемую вирусемию с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени на образцах сыворотки. На второй день после инфицирования ВКЭ четыре из пяти ягнят в группе 1 дали положительный результат на ВКЭ в сыворотке, тогда как в группе 3 у двух из пяти ягнят были положительные результаты. Один из пяти ягнят в группе 3 дал положительный результат на ВКЭ на четвертый день после инфицирования ВКЭ. Все образцы были отрицательными на шестой день и в течение всего эксперимента (таблица S1).Все образцы мозга, собранные у ягнят в конце эксперимента (42-й день), оказались отрицательными по ВКЭ с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (данные не показаны).

Результаты теста на нейтрализацию сыворотки показали, что ягнята, инокулированные ВКЭ (группы 1 и 3), вырабатывали нейтрализующие антитела к вирусу (рис. 1, таблица S1). У ягнят обнаруживались нейтрализующие антитела в сыворотке крови с шестого дня после инфицирования ВКЭ и на протяжении всего эксперимента. Не было обнаружено существенной разницы в среднем титре ВКЭ между группами 1 и 3 (p> 0.05).

Рис. 1. Средний реципрокный титр антител против TBEV у ягнят после инфицирования TBEV.

ВКЭ (ось Y) измеряли с помощью теста нейтрализации сыворотки в группах 1, 3 и 5 в дни от 0 до 21 после инокуляции TBEV (ось X). Группа 5 имела значительно более высокие средние значения титра ВКЭ, чем группы 1 и 3, обозначенные *. Стандартные отклонения (SD) показаны с помощью планок погрешностей. Группы, которые не были инокулированы вирусом клещевого энцефалита, не показаны на рисунке, и в них не вырабатывались нейтрализующие антитела к вирусу.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226836.g001

Все ягнята заражены A . phagocytophilum (группы 1, 2 и 3) развились лихорадка и клинические симптомы A . phagocytophilum (рис.2, таблица S1). У одной из ягнят была диагностирована пневмония, и она была умерщвлена ​​до окончания исследования в соответствии со стандартами защиты животных. А . phagocytophilum был обнаружен с помощью кПЦР во всех образцах крови со 2-го дня после инфицирования и на протяжении всего эксперимента (рис. 2, таблица S1).Нет существенной разницы в среднем A . Была обнаружена концентрация phagocytophilum между 1, 2 и 3 группами (p> 0,05). Кроме того, нет значительной разницы в средней ректальной температуре по сравнению с A . Обнаружена инфекция phagocytophilum между 1, 2 и 3 группами (p> 0,05).

Рис. 2. Средняя ректальная температура и средняя концентрация Anaplasma phagocytophilum у ягнят.

Средняя ректальная температура (ось Y) и средняя концентрация A . phagocytophilum в крови, измеренное с помощью кПЦР (количество копий на мкл (логарифмический), ось Y) каждой группы с 0 по 42 день после инокуляции (ось X). Пунктирная линия при 40 градусах Цельсия указывает на лихорадку. Вертикальная пунктирная линия на графике от A до D указывает на второй день контрольного заражения на 21 день. Вторая часть эксперимента (график E и F) завершилась на 21 день. Стандартные отклонения (SD) проиллюстрированы полосами ошибок.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226836.g002

Для гематологического анализа группа 2 имела значительно более высокое среднее количество моноцитов по сравнению с группами 1 и 3 (p <0.05). Не было обнаружено значительной разницы в среднем количестве нейтрофилов и лимфоцитов между группами 1, 2 и 3 (p> 0,05, рис. 3, таблица S1).

Рис. 3. Среднее количество нейтрофилов и моноцитов у ягнят в экспериментальном исследовании.

Среднее количество (ось Y) нейтрофилов (кружки) и моноцитов (квадраты) в эксперименте. Нормальное количество у овец составляет 0,8–5,0 (10 ⁹ клеток на литр) для нейтрофилов и <0,75 (10 ⁹ клеток на литр) для моноцитов.Вертикальная пунктирная линия на графике от A до D указывает на вторую контрольную пробу на 21 день. Стандартные отклонения (SD) проиллюстрированы полосами ошибок. Отсутствие конечных точек на некоторых планках ошибок на графике A связано с выбросами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226836.g003

Часть вторая: Коинфекция ВКЭ и

Ягнята группы 5, коинфицированные ВКЭ и A . phagocytophilum , клинических симптомов клещевого энцефалита не наблюдалось, а виремия была либо не обнаруживаемой, либо непродолжительной.У двух из пяти ягнят обнаруживалась РНК ВКЭ в сыворотке на второй день, а у одной из пяти — на четвертый и шестой день. Все образцы сыворотки дали отрицательный результат на РНК ВКЭ на восьмой день и в течение всего эксперимента. Как и в первой части настоящего исследования, у всех ягнят, инокулированных вирусом клещевого энцефалита, выработались нейтрализующие антитела против вируса клещевого энцефалита на 4-й и 8-й день после инокуляции (рис. 1, таблица S1).

У ягнят в группе 5 развились лихорадка и клинические признаки клещевой лихорадки, и бактерия была обнаружена с помощью количественной ПЦР со 2-го дня после заражения и на протяжении всего эксперимента (рис. 2, таблица S1).

Статистическое сравнение первой и второй части исследования

Значительно более высокий средний титр ВКЭ был обнаружен в группе 5, где ягнята были коинфицированы ВКЭ и A . phagocytophilum , по сравнению с группой 1, которая получила инфекцию ВКЭ в день 0, и A . phagocytophilum на 21-е сутки (р <0,05). Аналогичным образом, группа 5 имела значительно более высокий средний титр ВКЭ по сравнению с группой 3, которая была инфицирована A . phagocytophilum на 0 день и ВКЭ на 21 день (p <0,05). Нет различий в отношении вирусемии между пре-, пост- и коинфекцией ВКЭ и A . Обнаружено phagocytophilum .

Не было обнаружено существенной разницы в средней ректальной температуре по сравнению с A . phagocytophilum или средняя концентрация A . phagocytophilum в образцах крови между группами 1, 2, 3 и 5 (p> 0,05).

Для гематологического анализа было обнаружено значительно более высокое среднее количество моноцитов после инокуляции A . phagocytophilum в группе 1 (21–42 сутки) и 3 (сутки 0–21) по сравнению с группой 5 (сутки 0–21). Аналогично, после прививки ВКЭ в группе 1 (0–21 день) было обнаружено значительно большее среднее количество моноцитов, чем в группе 5 (день 0–21). Не было обнаружено значительной разницы в среднем количестве нейтрофилов и лимфоцитов между A . phagocytophilum инфицированных групп в части 1 и части 2, однако в группе 1 было обнаружено значительно более высокое среднее количество нейтрофилов по сравнению с группой 5 в дни от 0 до 21 после инокуляции TBEV (p <0,05, таблица S1).

Обсуждение

Отсутствует информация о ветеринарных аспектах ВКЭ. Это исследование было направлено на изучение инфекции ВКЭ и сочетанной инфекции ВКЭ и A . phagocytophilum у ягнят. Все ягнята, инфицированные ВКЭ, вырабатывали нейтрализующие антитела против вируса клещевого энцефалита, не проявляя никаких клинических симптомов клещевого энцефалита, и имели очень короткую виремию.Значительно более высокий средний титр ВКЭ был обнаружен в группе, коинфицированной ВКЭ и A . phagocytophilum по сравнению с другими группами. Эти результаты указывают на то, что коинфекция ВКЭ и A . phagocytophilum у ягнят может стимулировать более высокий ответ антител против TBEV по сравнению с однократным инфицированием TBEV или предшествующим инфицированием A . phagocytophilum . Однако причина этого неизвестна.

На значительную разницу в титре антител против TBEV могло повлиять различие пола ягнят в первой части (бараны) и второй части (овцы).Предыдущее исследование A . phagocytophilum у лабораторных мышей обнаружило, что инфицированные самцы мышей увеличили A . phagocytophilum ДНК-нагрузка и количество инфицированных нейтрофилов [44]. В настоящем исследовании не было обнаружено значительных различий в среднем A . phagocytophilum ДНК-нагрузка, но значительно более высокое среднее количество нейтрофилов было обнаружено в группе 1 по сравнению с группой 5 после инфицирования TBEV. Хотя виремия ВКЭ была низкой или не выявлялась, различия по полу могли повлиять на титры ВКЭ и количество нейтрофилов.Однако инфицирование ВКЭ ягнят разного пола и возраста не выявило каких-либо различий в клинических симптомах (неопубликованные данные).

В нашем исследовании было обнаружено, что среднее количество моноцитов в группе 2 было значительно выше, чем во всех других группах, инфицированных A . phagocytophilum . Кроме того, в группах 1 и 3 было значительно более высокое среднее количество моноцитов по сравнению с группой 5. Было обнаружено, что моноциты играют важную роль в борьбе с A . phagocytophilum [45], а также способствовать клеточному иммунному ответу на TBEV [46, 47]. Значительно более высокое среднее количество моноцитов было обнаружено в группе 1 (дни от 0 до 21), чем в группе 5 (дни от 0 до 21) после инфицирования TBEV. Эти результаты могут указывать на то, что при однократном заражении A . phagocytophilum или TBEV (группы 1 и 3), развивается более высокий клеточно-опосредованный иммунный ответ по сравнению с коинфекцией TBEV и A . phagocytophilum (группа 5).Однако не было обнаружено значительных различий в средней бактериальной нагрузке A . phagocytophilum , ни клинические симптомы ягнят.

Результаты нашего исследования согласуются с предыдущими исследованиями и вместе они указывают на то, что ВКЭ редко приводит к симптоматическому заболеванию овец [17, 18, 39]. Коинфекция LIV и A . phagocytophilum , как известно, вызывает тяжелые заболевания у овец [36]. В нашем исследовании коинфекция A . phagocytophilum и ВКЭ, по-видимому, не влияли на клинические симптомы у ягнят, хотя LIV генетически тесно связан с ВКЭ [48]. Отсутствие клинических случаев КЭ у овец может быть связано с плохой репликацией вируса в клетках овцы [39].

Недавнее экспериментальное исследование ВКЭ и LIV у овец, проведенное Mansfield et al. (2016), не обнаружили клинических симптомов инфекции ВКЭ, хотя был установлен нейтрализующий ответ антител [39]. Аналогичные результаты были получены в текущем исследовании.Исследование Mansfield et al. (2016), обнаружили, что низкий титр антител после инфицирования ВКЭ, вероятно, является отражением низкой вирусной нагрузки у овец, инфицированных ВКЭ. Сопоставимые результаты были получены в этом исследовании, в котором у некоторых ягнят была обнаружена низкая виремия через несколько дней после инокуляции вируса клещевого энцефалита. Хотя была обнаружена низкая и непродолжительная виремия, существует известная возможность передачи вируса клещевого энцефалита через пищевые продукты, что показывает, что у жвачных животных вирусная инфекция развивается после инфицирования ВКЭ [2–5, 49–52]. Кроме того, экспериментальное исследование на козах выявило виремию ВКЭ продолжительностью до 19 дней [53].Причина длительного периода виремии, обнаруженного у коз по сравнению с овцами, неизвестна, но это может указывать на то, что козы более восприимчивы к инфекции ВКЭ, чем овцы, или что существуют различия в патогенности вирусных штаммов.

Таким образом, настоящее исследование показывает, что все ягнята, инфицированные вирусом клещевого энцефалита, вырабатывали нейтрализующие антитела против вируса клещевого энцефалита без проявления каких-либо клинических симптомов клещевого энцефалита. Значительно более высокий средний титр ВКЭ был обнаружен в группе, коинфицированной ВКЭ и A . phagocytophilum по сравнению с другими группами. В будущих экспериментальных исследованиях на домашних жвачных животных следует рассмотреть другие и, возможно, более вирулентные штаммы ВКЭ, чтобы подтвердить эффекты коинфекции с использованием животных того же пола.

Вспомогательная информация

S1 Таблица. Данные о ректальной температуре, гематологических переменных, результатах ПЦР вируса клещевого энцефалита и

Сокращения в таблице S1:

ПЦР ВКЭ: полимеразная цепная реакция в режиме реального времени на вирус клещевого энцефалита (0 = отрицательный, 1 = положительный)

TBEV ELISA: иммуноферментный анализ клещевого энцефалита (0 = отрицательный, 1 = положительный)

Титр ВКЭ: титр клещевого энцефалита по тесту нейтрализации сыворотки

Wbc: лейкоциты

руб .: эритроциты

Hgb: Гемоглобин

Hct: гематокрит

MCV: средний объем ячейки

MCH: средний клеточный гемоглобин

RDV: Ширина распределения эритроцитов

HDW: ширина распределения гемоглобина

Нейтрофилы:

Лимп: лимфоциты

Моно: Моноциты

Eos: эозинофилы

Baso: Базофилы

LUC: большие неокрашенные клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0226836.s001

(XLSX)

Благодарности

Авторы благодарны сотрудникам Норвежского университета естественных наук в Санднесе за всю помощь во время исследования. Искренняя благодарность Камилле Элм и Анне Ангел за любезно предоставленные метод количественной ПЦР, положительный контроль и плазмиду для обнаружения Anaplasma phagocytophilum , доктору Кристиану Бёре за предоставление положительной контрольной РНК ВКЭ («Soukup»), профессору Ф.X. Heinze за любезно предоставленный штамм Hochosterwitz, Benedikte N. Pedersen за участие в культивировании вируса и за критическое прочтение и предложения к рукописи, Alaka Lamsal за помощь во время подготовки этого исследования и Sveinung Eskeland за помощь во время подготовки этого исследования и для изготовления фигур.

Ссылки

1. 1. Линдквист Л., Вапалахти О. Клещевой энцефалит. Ланцет. 2008. 371 (9627): 1861–71.
2. 2.Balogh Z, Ferenczi E, Szeles K, Stefanoff P, Gut W., Szomor KN, et al. Вспышка клещевого энцефалита в Венгрии из-за потребления сырого козьего молока. Журнал вирусологических методов. 2010. 163 (2): 481–5. pmid: 19836419
3. 3. Caini S, Szomor K, Ferenczi E, Szekelyne Gaspar A, Csohan A, Krisztalovics K и др. Клещевой энцефалит, передающийся через непастеризованное коровье молоко в западной Венгрии, сентябрь — октябрь 2011 г. Европейский надзор: бюллетень Europeen sur les maladies transmissies = Европейский бюллетень инфекционных болезней.2012; 17 (12).
4. 4. Гресикова М., Секеева М., Ступалова С., Нечас С. Эпидемия клещевого энцефалита, передаваемого из овечьего молока, в Словакии. Интервирология. 1975. 5 (1–2): 57–61. pmid: 1237478
5. 5. Хольцманн Х., Аберле С.В., Стиасны К., Вернер П., Мишак А., Зайнер Б. и др. Клещевой энцефалит от употребления козьего сыра в горном регионе Австрии. Возникающие инфекционные заболевания. 2009. 15 (10): 1671–3. pmid: 19861072
6. 6. Худописк Н., Корва М., Джанет Э., Симетингер М., Гргич-Витек М., Губенсек Дж. И др.Клещевой энцефалит, связанный с потреблением сырого козьего молока, Словения, 2012 г. Новые инфекционные заболевания. 2013. 19 (5): 806–8. pmid: 23697658
7. 7. Марковинович Л., Косанович Личина М.Л., Тешич В., Воеводич Д., Владусич Лючич I, Книвальд Т. и др. Вспышка клещевого энцефалита, связанная с потреблением сырого козьего молока и сыра, Хорватия, 2015 г. Инфекция. 2016; 44 (5): 661–5. pmid: 27364148
8. 8. Полсен К.М., Стуен С., дас Невес К.Г., Сухель Ф., Гурунг Д., Соленг А. и др.Вирус клещевого энцефалита коров и непастеризованное коровье молоко из Норвегии. Зоонозы и общественное здоровье. 2019; 66 (2): 216–22. pmid: 30593734
9. 9. Cisak E, Wojcik-Fatla A, Zajac V, Sroka J, Buczek A, Dutkiewicz J. Распространенность вируса клещевого энцефалита (TBEV) в образцах сырого молока, взятых случайным образом от коров, коз и овец в восточной Польше. Анналы аграрной и экологической медицины: ААЭМ. 2010. 17 (2): 283–6. pmid: 21186771
10. 10. Кайзер Р. Клещевой энцефалит: клинические проявления и прогноз у взрослых.Wiener medizinische Wochenschrift (1946). 2012. 162 (11–12): 239–43. pmid: 22695809
11. 11. Рузек Д., Авшич Зупанк Т., Борд Дж., Чрдл А., Эйер Л., Карганова Г. и др. Клещевой энцефалит в Европе и России: обзор патогенеза, клиники, терапии и вакцин. Antiviral Res. 2019; 164: 23–51. pmid: 30710567
12. 12. Klimes J, Juricova Z, Literak I, Schanilec P, Trachta e Silva E. Распространенность антител к клещевому энцефалиту и флавивирусам Западного Нила и клинические признаки клещевого энцефалита у собак в Чешской Республике.Ветеринарная карта. 2001. 148 (1): 17–20. pmid: 11200400
13. 13. Лешник MW, Кирц GC, Thalhammer JG. Клещевой энцефалит (КЭ) у собак. Международный журнал медицинской микробиологии: IJMM. 2002; 291 Прил. 33: 66–9.
14. 14. Райнер Б., Фишер А., Годде Т., Мюллер В. Клиническая диагностика собачьего клещевого энцефалита (КЭ): вклад анализа спинномозговой жидкости (ЦСЖ) и титров антител ЦСЖ. Zentralblatt Fur Bakteriologie — Международный журнал медицинской микробиологии, вирусологии, паразитологии и инфекционных заболеваний.1999. 289 (5–7): 605–9. https://doi.org/10.1016/S0934-8840(99)80016-4
15. 15. Клаус С., Хоругель У., Хоффманн Б., Бир М. Инфекция, вызванная вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) у лошадей: клинические и лабораторные данные и эпидемиологические исследования. Ветеринарная микробиология. 2013. 163 (3–4): 368–72. pmid: 23395291
16. 16. Сусс Дж., Гелпи Е., Клаус С., Багон А., Либлер-Тенорио Е. М., Будка Х и др. Клещевой энцефалит у обезьян, подвергшихся естественному воздействию (Macaca sylvanus). Возникающие инфекционные заболевания.2007. 13 (6): 905–7. pmid: 17553233
17. 17. Бом Б., Шаде Б., Бауэр Б., Хоффманн Б., Хоффманн Д., Циглер Ю. и др. Клещевой энцефалит у естественно инфицированной овцы. BMC ветеринарные исследования. 2017; 13 (1): 267. pmid: 28830430
18. 18. Баго З., Баудер Б., Колодзейек Дж., Новотны Н., Вайссенбок Х. Клещевой энцефалит у муфлона (Ovis AMMUSIMON). Ветеринарная карта. 2002. 150 (7): 218–20. pmid: 11878442
19. 19. Randolph SE. Передача клещевых патогенов от клещей к совместному кормлению: устойчивая парадигма Милана Лабуды.Клещи и клещевые болезни. 2011. 2 (4): 179–82. pmid: 22108009
20. 20. Jaenson TG, Hjertqvist M, Bergstrom T., Lundkvist A. Почему увеличивается число случаев клещевого энцефалита? Обзор ключевых факторов, вызывающих рост заболеваемости КЭ у людей в Швеции. Паразиты и векторы. 2012; 5: 184. pmid: 22937961
21. 21. Вальденстром Дж., Лундквист А., Фальк К.И., Гарпмо Ю., Бергстром С., Линдегрен Г. и др. Мигрирующие птицы и вирус клещевого энцефалита. Возникающие инфекционные заболевания.2007. 13 (8): 1215–8. pmid: 17953095
22. 22. Hasle G, Bjune G, Edvardsen E, Jakobsen C, Linnehol B, Roer JE, et al. Перенос клещей перелетными воробьиными птицами в Норвегию. J Parasitol. 2009. 95 (6): 1342–51. pmid: 19658452
23. 23. Тонтери Э., Йокелайнен П., Матала Дж., Пусениус Дж., Вапалахти О. Серологические доказательства заражения вирусом клещевого энцефалита лосей и оленей в Финляндии: дозорные для циркуляции вируса. Паразиты и векторы. 2016; 9: 54. pmid: 26825371
24. 24.Randolph SE, Miklisova D, Lysy J, Rogers DJ, Labuda M. Случайность совпадений: характер заражения клещами на грызунах способствует передаче вируса клещевого энцефалита. Паразитология. 1999. 118 (Pt 2): 177–86.
25. 25. Лабуда М., Наттолл П.А., Козуч О., Елецкова Е., Уильямс Т., Зуффова Е. и др. Невиремическая передача вируса клещевого энцефалита: механизм выживания арбовирусов в природе. Experientia. 1993. 49 (9): 802–5. pmid: 8405306
26. 26.Лабуда М., Козуч О., Зуффова Е., Елецкова Е., Привет Р.С., Наттолл П.А. Передача вируса клещевого энцефалита между клещами, питающимися специфическими иммунными естественными хозяевами-грызунами. Вирусология. 1997. 235 (1): 138–43. pmid: 9300045
27. 27. Фогги А. Исследования возбудителя клещевой лихорадки овец. Журнал патологии и бактериологии. 1951; 63 (1): 1–15. pmid: 14832686
28. 28. Фоли Дж. Э., Фоли П., Джеккер М., Свифт П. К., Мэдиган Дж. Э. Гранулоцитарный эрлихиоз и заражение клещами горных львов в Калифорнии.Журнал болезней дикой природы. 1999. 35 (4): 703–9. pmid: 10574529
29. 29. Стуен С., Бергстрём К. Серологическое исследование инфекции гранулоцитарной эрлихией у овец в Норвегии. Acta veterinaria Scandinavica. 2001; 42 (3): 331. pmid: 11887393
30. 30. Туоми Дж. Экспериментальные исследования бычьей клещевой лихорадки. 1. Клинические и гематологические данные, некоторые свойства возбудителя и гомологичный иммунитет. Acta patologica et microbiologica Scandinavica. 1967. 70 (3): 429–45.pmid: 5625578
31. 31. Woldehiwet Z. Уклонение от иммунитета и подавление иммунитета, вызываемые Anaplasma phagocytophilum, возбудителем клещевой лихорадки жвачных животных и гранулоцитарного анаплазмоза человека. Ветеринарный журнал (Лондон, Англия: 1997). 2008. 175 (1): 37–44. pmid: 17275372
32. 32. Стуен С., Харденг Ф., Ларсен Х.Дж. Устойчивость молодых ягнят к клещевой лихорадке. Исследования в области ветеринарии. 1992. 52 (2): 211–6. pmid: 1585079
33. 33. Grova L, Olesen I, Steinshamn H, Stuen S.Распространенность инфекции Anaplasma phagocytophilum и влияние на рост ягненка. Acta veterinaria Scandinavica. 2011; 53: 30. pmid: 21569524
34. 34. Diuk-Wasser MA, Vannier E, Krause PJ. Коинфекция клещевыми возбудителями Ixodes: экологические, эпидемиологические и клинические последствия. Тенденции паразитологии. 2016; 32 (1): 30–42. pmid: 26613664
35. 35. Кьелланд В., Полсен К.М., Роллум Р., Дженкинс А., Стуен С., Соленг А. и др. Вирус клещевого энцефалита, Borrelia burgdorferi sensu lato, Borrelia miyamotoi, Anaplasma phagocytophilum и Candidatus Neoehrlichia mikurensis у клещей Ixodes ricinus, собранных с рекреационных островов на юге Норвегии.Клещи и клещевые болезни. 2018; 9 (5): 1098–102. pmid: 29678403
36. 36. Рид HW, Бакстон Д., Пау I, Броди Т.А., Холмс PH, Уркхарт GM. Ответ овец на экспериментальную сопутствующую инфекцию клещевой лихорадкой (Cytoecetes phagocytophila) и вирусом лупингвина. Исследования в области ветеринарии. 1986. 41 (1): 56–62. pmid: 3764102
37. 37. Томас В., Ангуита Дж., Бартольд С.В., Фикриг Э. Коинфекция Borrelia burgdorferi и возбудителя гранулоцитарного эрлихиоза человека изменяет иммунные реакции мышей, патогенную нагрузку и тяжесть артрита Лайма.Инфекция и иммунитет. 2001. 69 (5): 3359–71. pmid: 11292759
38. 38. Гордон В.С., Браунли А., Уилсон Р., Маклауд Дж. Исследования в Лупинг-Иллинойсе. (Энцефаломиелит овец.) Журнал сравнительной патологии и терапии. 1932; 45: 106-40.
39. 39. Мэнсфилд К.Л., Джонсон Н., Баньярд А.С., Нуньес А., Бейлис М., Соломон Т. и др. Врожденный и адаптивный иммунный ответ на клещевую флавивирусную инфекцию у овец. Ветеринарная микробиология. 2016; 185: 20–8. pmid: 26931387
40. 40.Стюен С., Бергстром К., Петровец М., Ван де Поль I, Шульс Л. М.. Различия в клинических проявлениях, гематологических и серологических ответах после экспериментального заражения генетическими вариантами Anaplasma phagocytophilum у овец. Клинико-диагностическая лабораторная иммунология. 2003. 10 (4): 692–5. pmid: 12853406
41. 41. Андреассен А., Джоре С., Кубер П., Дудман С., Тенгс Т., Исаксен К. и др. Распространенность вируса клещевого энцефалита у нимф клещей в зависимости от климатических факторов на южном побережье Норвегии.Паразиты и векторы. 2012; 5: 177. pmid: 22
    7
42. 42. Stiasny K, Holzmann H, Heinz FX. Характеристики ответов антител при прорыве в вакцинацию против клещевого энцефалита. Вакцина. 2009. 27 (50): 7021–6. pmid: 19789092
43. 43. Henningsson AJ, Hvidsten D, Kristiansen BE, Matussek A, Stuen S, Jenkins A. Обнаружение Anaplasma phagocytophilum у клещей Ixodes ricinus из Норвегии с использованием анализа ПЦР в реальном времени, нацеленного на ген цитратсинтазы анаплазмы gltA.BMC микробиология. 2015; 15: 153. pmid: 26231851
44. 44. Naimi WA, Green RS, Cockburn CL, Carlyon JA. Дифференциальная восприимчивость самцов и самок лабораторных мышей к инфекции Anaplasma phagocytophilum. Тропическая медицина и инфекционные болезни. 2018; 3 (3). pmid: 30274474
45. 45. Блом К., Куапио А., Сандберг Дж. Т., Варнайте Р., Михаэльссон Дж., Бьоркстрем Н. К. и др. Клеточно-опосредованные иммунные ответы и иммунопатогенез вирусной инфекции клещевого энцефалита человека.Границы иммунологии. 2018; 9: 2174. pmid: 30319632
46. 46. Северо М.С., Стивенс К.Д., Коцифакис М., Педра Дж. Х. Anaplasma phagocytophilum: обманчиво простая или просто обманчивая? Будущая микробиология. 2012; 7 (6): 719–31. pmid: 22702526
47. 47. Цой К.С., Скорпион Д.Г., Дамлер Дж. С.. Связывание Anaplasma phagocytophilum с toll-подобным рецептором (TLR) 2, но не с TLR4, активирует макрофаги для ядерной транслокации ядерный фактор-каппа B. Журнал инфекционных болезней.2004. 189 (10): 1921–5. pmid: 15122530
48. 48. Грицун Т.С., Лашкевич В.А., Гулд Э.А. Клещевой энцефалит. Противовирусные исследования. 2003. 57 (1-2): 129–46. pmid: 12615309
49. 49. Коль И., Козуч О., Елецкова Е., Лабуда М., Залудко Ю. Семейная вспышка алиментарного клещевого энцефалита в Словакии, связанная с естественным очагом инфекции. Европейский журнал эпидемиологии. 1996. 12 (4): 373–5. pmid: 88

50. 50. Ригер М.А., Нублинг М., Кайзер Р., Тиллер Ф.В., Хофманн Ф.[Клещевой энцефалит, передающийся через сырое молоко — каково значение этого пути заражения? Исследования в эпидемическом регионе Юго-Западной Германии. Gesundheitswesen. 1998. 60 (6): 348–56. pmid: 9697358
51. 51. Кербо Н., Донченко И., Куцарь К., Василенко В. Вспышка клещевого энцефалита в Эстонии связана с сырым козьим молоком, май-июнь 2005 г. Европейский надзор: бюллетень Europeen sur les maladies transventions = Европейский бюллетень инфекционных болезней. 2005; 10 (6): E050623 2. pmid: 16783104
52. 52.Kriz B, Benes C, Daniel M. Пищевая передача клещевого энцефалита в Чешской Республике (1997–2008 гг.). Эпидемиология, микробиология, иммунология: casopis Spolecnosti pro epidemiologii and mikrobiologii Ceske lekarske spolecnosti JE Purkyne. 2009. 58 (2): 98–103.
53. 53. Балог З., Эгид Л., Ференци Э., Бан Э, Сомор К. Н., Такач М. и др. Экспериментальное заражение коз вирусом клещевого энцефалита и возможности предотвращения передачи вируса через сырое козье молоко.Интервирология. 2012; 55 (3): 194–200. pmid: 21325791

Вирус клещевого энцефалита — обзор

Клещевой энцефалит

Вирус клещевого энцефалита классифицируется как один вид в группе клещевых флавивирусов млекопитающих и далее подразделяется на три подтипа: дальневосточный (ранее RSSE), сибирский ( ранее западно-сибирский) и европейский (ранее ЦВЕ). Есть свидетельства того, что эти три подтипа вируса имеют перекрывающиеся географические области.

Три подтипа вируса клещевого энцефалита, а также другие родственные клещевые комплексные вирусы млекопитающих передаются через Голарктику, с некоторыми доказательствами их распространения из азиатского источника. ^70,161 Дальневосточный подтип передается на востоке России, в Корее, Китае и некоторых частях Японии и странах Балтии; европейский подтип и родственные ему вирусные штаммы обнаружены в Скандинавии, Европе и восточных государствах бывшего Советского Союза; а сибирский подтип встречается во всех эндемичных по КЭ районах России (см.рис.155-1D). Географические распределения совпадают в Восточной Европе, где могут быть изолированы как сибирский, так и дальневосточный подтипы. ⁵⁰ Вирус Лупинг Болл обнаружен на Британских островах, а вирус Повассан обнаружен в Северной Америке и Северной Азии. Близкородственные клещевые флавивирусы включают вирусы энцефалита турецких и испанских овец, обнаруженные в южной Европе, и три вируса, вызывающих геморрагическую лихорадку — KFDV в Индии, вирус Alkhurma (который является подтипом KFDV) в Саудовской Аравии и Египте и Омский вирус геморрагической лихорадки в Сибири. ^54,162

КЭ был признан во всей Европе, за исключением Португалии и стран Бенилюкса, но эндемичная передача наиболее интенсивна в Австрии, регионах Швеции, Швейцарии, Словении, Чешской Республики, Эстонии, Литвы, Латвии и России. В этих странах уровень заболеваемости среди невакцинированного населения приближается к 20 на 100 000 человек, но риск очень очаговый. В Австрии национальные программы вакцинации снизили заболеваемость до менее 1 на 1 миллион. ¹⁶³ Спорадические случаи зарегистрированы из Франции, Лихтенштейна, Швеции, Швейцарии, Италии и Греции. На Дальнем Востоке случаи клещевого энцефалита чаще всего возникают среди людей, работающих или проживающих в лесных районах России, Кореи, северного Китая и острова Хоккайдо, Япония. Новые модели, основанные на факторах окружающей среды и спутниковых данных, предполагают, что изменение климата частично является причиной увеличения заболеваемости в Европе. ¹⁶⁴ Продольные исследования показывают, что вирус сейчас циркулирует на больших высотах в Чешской Республике и Швейцарии.

Вирусы передаются горизонтально между клещами и позвоночными, а зимой — вертикально через клещи и латентными инфекциями у животных, находящихся в спячке. Вирус передается трансовариально и трансстадиально, от яйца к личинке, нимфе и взрослой особи, поэтому клещи на всех стадиях, а также самцы и самки передают инфекции животным и людям. Кроме того, похоже, что вирус может передаваться между клещами, когда они питаются кожей одного и того же хозяина, через инфицированные ретикулоэндотелиальные и воспалительные клетки хозяина без необходимости в виремии хозяина. ¹⁶⁵ Личинки и нимфальные клещи питаются в основном птицами и мелкими млекопитающими, а взрослые клещи питаются более крупными млекопитающими, такими как косуля, олени, домашние козы, овцы, коровы, собаки, кошки и люди. Человеческие инфекции являются случайными в цикле передачи. Движение животных может распространять клещей и вирус в новые очаги.

В пределах ареалов Ixodes ricinus и Ixodes persulcatus, основных переносчиков клещей европейских и дальневосточных плюс сибирских подтипов, соответственно, и дополнительно Ixodes ovatus и Haemaphysalis spp., которые являются переносчиками в Японии и Корее, соответственно, клещи локально распространены в защищенных микроместообитаниях с высокой влажностью и умеренными температурами и могут быть найдены на высоте до 2100 м. Исследования ландшафтной экологии охарактеризовали экотоны лесов для полей или лугов, невысоких лиственных деревьев и кустарников с толстым пологом как биотопы с высоким риском, которые коррелируют с очагами заболеваний человека. ¹⁶⁶ Очаги передачи обычно очень стабильны, но подвержены изменениям в окружающей среде человека и, возможно, изменению климата. ¹⁶⁷ В Центральной Европе случаи заболевания происходят с апреля по ноябрь, пик приходится на июнь и июль, а в октябре — вторичный рост. Изменение климата привело к резким изменениям в распределении видов Ixodes . клещевые векторы и передача КЭ. ^168-171

Случаи заболевания возникают в основном среди взрослых в возрасте от 20 до 50 лет, с преобладанием мужчин, что отражает профессиональное воздействие в лесном хозяйстве и сельском хозяйстве. Тем не менее, дети, играющие на открытом воздухе, и люди с профессиональным опытом во время пеших прогулок, сбора ягод или грибов также могут подвергаться риску, в зависимости от местоположения и сезона.Однако риск для большинства людей с краткосрочным воздействием невелик. Среди американских солдат, дислоцированных в Центральной Европе, не было зарегистрировано ни одного случая заболевания, а уровень сероконверсии был низким (от 0,1% до 0,4%). ¹⁷² Болезнь Лупинг — это в основном редкое профессиональное заболевание ветеринаров, пастухов и мясников. ¹⁷³

Вирус клещевого энцефалита устойчив при кислом pH, и потребление непастеризованного молока или молочных продуктов от инфицированных коз, овец или коров ранее составляло от 10% до 20% случаев в некоторых частях Центральной Европы.Было высказано предположение о том, что вирус Повассан может передаваться через сырые молочные продукты в Соединенных Штатах. ¹⁷⁴ Убой или разделка инфицированных животных или мяса является основным путем передачи вируса людям, вызывающим заражение вирусом клещевого энцефалита, а также при вспышках вируса Alkhurma. ¹⁷⁵ Инфекция также была передана от инфицированных клещей, перенесенных в домохозяйства на фомитах.

Помимо вируса клещевого энцефалита, I. ricinus также передает несколько видов Borrelia spp.ответственны за болезнь Лайма (а также Anaplasma phagocytophilum, Babesia microti, и несколько видов Rickettsia ), а также наблюдаются двойные инфекции клещей и людей. Однако в зонах повышенного риска болезнь Лайма встречается гораздо чаще, чем другие болезни. Это различие отражает низкую долю инфицированных вирусом клещей (от 0,1% до 5%) и 10-кратный более высокий уровень заражения клещами боррелиями в одном и том же месте. Это различие может быть результатом кратковременности виремии у животных-хозяев, которая дает возможность заражения клещами всего в течение нескольких дней; Напротив, стойкие боррелиозные инфекции грызунов повышают вероятность заражения клещами во время кормления.Аналогичная ситуация имеет место в Соединенных Штатах, где Ixodes scapularis передает болезнь Лайма, бабезиоз, анаплазмоз человека и генотип вируса Повассан, представленный вирусом оленьего клеща. ¹⁷⁶ Однако клещи Ixodes cookei (основной переносчик вируса Повассан) и I. scapularis несколько различаются по диапазону хозяев, что может дополнительно ограничивать возможности пересечения циклов передачи вируса и боррели.

Наличие антител против вируса клещевого энцефалита у овец в Тунисе, Северная Африка | BMC Veterinary Research

Вирус клещевого энцефалита у собак — это проблема? | Паразиты и переносчики

Границы | Обнаружение антител против вируса клещевого энцефалита и других флавивирусов в зоологической коллекции в Словении

Введение

Зоопарки — это районы, где различные экзотические виды животных обитают в непосредственной близости, обычно в контакте с дикими животными, а также с людьми (смотрители зоопарка и посетители).Мониторинг инфекционных заболеваний — одна из важнейших частей ветеринарной помощи в зоологических коллекциях, позволяющая обнаруживать возможные новые патогены и обеспечивать безопасность животных и посетителей. Смесь различных хозяев, резервуаров и патогенов может использоваться как дозорный для скрининга возникающих инфекционных заболеваний (1–3). Клещевой энцефалит (КЭ) — одно из самых серьезных флавивирусных заболеваний человека в Европе и Азии. Возбудитель вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) имеет положительный геном одноцепочечной РНК и является членом группы клещевых флавивирусов (род Flavivirus , семейство Flaviviridae ) (4, 5).ВКЭ передается при укусе инфицированного клеща или, в редких случаях, через сырые молочные продукты от инфицированных млекопитающих (6). Вирус циркулирует между клещами-переносчиками и некоторыми их хозяевами, в основном оленями и мелкими млекопитающими, такими как грызуны и насекомоядные, в то время как только мелкие млекопитающие считаются компетентными резервуарами вируса (5). В Европе КЭ — одна из самых распространенных флавивирусных инфекций центральной нервной системы, эндемичная для нескольких стран. Словения входит в число европейских стран с самыми высокими показателями заболеваемости КЭ (8.1–18,6 случаев на 100 000 населения за последнее десятилетие) (7). Накопленные данные подчеркивают растущий потенциал ВКЭ, способы отбора вариантов вируса, адаптации к клещевым переносчикам и грызунам-хозяевам с возможными серьезными последствиями для клинического заболевания. TBEV имеет огромное географическое распространение, включая как минимум 34 страны (8). ВКЭ — самый важный возбудитель арбовирусной инфекции в Европе, вызывающий неврологические симптомы. Заболеваемость этой болезнью значительно возросла за последние десятилетия, и тем временем наблюдаются некоторые изменения в пространственном распределении случаев КЭ.Поэтому важно распознавать распространение эндемичных территорий, применять профилактические меры. Молекулярные результаты показывают, что вирус может обнаруживаться в органах грызунов в течение более длительного периода времени, что указывает на длительное заражение вирусом грызунов-хозяев. Таким образом, грызунов можно использовать в качестве полезного индикатора циркуляции ВКЭ в районе (9). Некоторые арбовирусы из семейства Flaviviridae — , например, TBEV — присутствуют в Словении в течение многих лет (10). Другие вирусы, такие как вирус Западного Нила (WNV) и вирус Усуту (USUV), были представлены только недавно (11).Целью этого исследования был скрининг антител против вируса клещевого энцефалита у животных зоопарка и на основе его перекрестной реактивности выявление некоторых других возможных флавивирусов (WNV, USUV).

Материалы и методы

Забор крови и серологическое исследование

Исследование проводилось в зоопарке Любляны, который является единственной крупной коллекцией животных зоопарка в Словении. С 2006 по 2018 год здесь проживало от 480 до 560 животных, принадлежащих к 130–160 видам. В те годы все образцы, полученные в результате обычных клинических исследований, хранились и замораживались.Все клинические процедуры выполнялись в соответствии со стандартными операционными протоколами (СОП) с учетом безопасности человека и животных. В общей сложности 874 образца сыворотки 96 видов животных были протестированы на антитела к TBEV с помощью иммуноферментных анализов (ELISA, EIA TBEV Ig, TestLine Clinical Diagnostic, Брно, Чешская Республика). Обследование проводилось в соответствии с инструкциями производителя. Все ELISA-положительные образцы были подтверждены тестом на нейтрализацию вируса (VNT) при микромодификации с витальным окрашиванием по методу, описанному ранее (12).Вкратце, 100 мкл рабочего разведения вируса смешивали и инкубировали с равной частью тестируемой сыворотки и добавляли к той же части суспензии клеточной культуры. Планшеты инкубировали в 5% CO ₂ при 37 ° C. VNT выполняли с TBEV (штамм Hypr) и одновременно с WNV (WNV Strain Line 2) и USUV (австрийский штамм). Вирусы выращивали на мозге сосущих лабораторных мышей в возрасте 1-3 дней. Суспензию линии клеток почек свиньи (PS) использовали в качестве клеточного субстрата для TBEV VNT.Суспензию клеточной линии почки обезьяны (CV-1) использовали в качестве клеточного субстрата для WNV VNT и USUV VNT. Рабочее разведение для обеих клеточных линий составляло 600000 клеток / мл. В тесты был включен контроль токсичности сыворотки, а также специфические положительные и отрицательные контрольные сыворотки. Результатом VNT является титр нейтрализации вируса (VN), который является обратной величиной самого высокого разведения образца, которое все еще способно нейтрализовать цитопатический эффект более чем на 50% (TCID50). Пробы были отмечены как положительные, если титр VN> 4 (12).

Результаты

Антитела к ВКЭ были обнаружены с помощью ELISA у 3,9% (34/874) животных зоопарка, 4% (30/753) у млекопитающих, 5% (4/86) у птиц и 0% у рептилий ( n ). = 34) и земноводных ( n = 1). Антитела к ВКЭ были обнаружены методом VNT в 10 образцах сыворотки (один горный козел, четыре домашних овцы, четыре муфлона и одна рыжая лисица). Антитела к WNV и USUV были обнаружены с помощью VNT у сипухи ( Tyto alba ) с титром 128, положительным для обоих вирусов.Остальные образцы были отрицательными. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 . Результаты серологического исследования животных зоопарка на наличие антител к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ), проверенных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с подтверждением положительных проб тестом нейтрализации вируса (ВНТ).

Обсуждение

Флавивирусы становятся все более важными патогенами в Европе за последние несколько десятилетий. ВКЭ, вызывающий инфекции центральной нервной системы у людей, вызывает проблемы со здоровьем в Европе и Азии.Этот вирус в основном передается через укусы клещей, однако сырые молочные продукты также могут быть источником инфекции (13, 14). В 2018 г. в странах ЕС было зарегистрировано 3092 случая КЭ (15). В последние годы КЭ возник в ранее не пораженных регионах (например, в Нидерландах), а количество случаев увеличилось вдвое в Словакии, Литве и Хорватии (15). Из-за отсутствия эффективного лечения клещевого энцефалита иммунизация против клещевого энцефалита и предотвращение укусов клещей имеют ключевое значение для предотвращения этой инфекции (16).

Заболеваемость ВКЭ в Словении отслеживалась с помощью ОТ-ПЦР в период с 2005 по 2006 год у клещей и людей (9). Общая распространенность ВКЭ среди 4777 клещей, собранных за эти 2 года, составила 0,47%. В аналогичном исследовании, проведенном в соседней Хорватии, частота ВКЭ составила 1,1% у клещей и 1,6% — в образцах селезенки дикой лисы ( Vulpes vulpes ) и благородного оленя ( Cervus elpahus ) (17). Кроме того, частота инфицирования клещей, обнаруженная с помощью ОТ-ПЦР, достоверно коррелировала с заболеваемостью клещами в отдельных районах.Метод секвенирования подтвердил генетическую корреляцию между ВКЭ у собранных клещей и словенскими пациентами, инфицированными ВКЭ. Исследование, проведенное на грызунах в тот же период, показало, что в различных регионах Словении с помощью иммунофлуоресцентного анализа обнаруживается в среднем 5,9% антител против вируса клещевого энцефалита (9). Результаты варьировались в зависимости от вида грызунов и региона отлова. Общая распространенность была сопоставима с результатами нашего исследования (3,9%). Удивительно, но распространенность 0% была обнаружена в 82 образцах от трех видов грызунов ( Myodes glareolus, A.flavicollis и A. sylvaticus ) в нашем исследовании. Это можно объяснить высокой корреляцией заболеваемости в зависимости от выбранных территорий, упомянутых в исследованиях выше. Это может также свидетельствовать о том, что высокая изменчивость видов-дозорных увеличивает возможность идентификации целевого патогена. В аналогичном исследовании на грызунах, проведенном в Швейцарии в 2006 и 2007 годах, сыворотки 333 грызунов были исследованы с очень похожей общей распространенностью 3,9%. В некоторых регионах распространенность достигла 9.9%, тогда как у других распространенность была 0%, как и в нашем исследовании. Образцы сыворотки от 1014 кабанов и 758 косуль были проверены на антитела к флавивирусу с использованием метода конкурентного ELISA (cELISA) в период с 2009 по 2014 год во Франции (18). Значительно более высокая заболеваемость флавивирусами была обнаружена у кабанов (5,6%), чем у косуль (2,1%). Распределение также было выше, чем ожидалось, по сравнению с человеческими случаями. Это открытие подтвердило потенциальную пользу дикой природы для мониторинга инфекционных заболеваний.В Чешской Республике образцы сыворотки 133 животных 69 различных видов животных из пяти зоологических коллекций, расположенных в разных регионах, были оценены на предмет выявления антител к ВКЭ (19). Два копытных из одного зоопарка оказались серопозитивными в районе, эндемичном по ВКЭ. Это говорит о том, что мониторинг инфекционных заболеваний, эндемичных в проверенных районах, играет решающую роль в выборе надлежащей горячей точки для размещения дозорных животных, чтобы повысить вероятность перехвата патогенов. Этот момент также был подчеркнут в другом исследовании (1).Результаты нашего исследования также показали, что 9 из 10 TBEV-положительных образцов сыворотки в анализе VNT были обнаружены у альпийских горных козлов, домашних овец и муфлонов, которые тесно связаны между собой. Скрининг инфекционных болезней с зоонозным потенциалом является важным мероприятием для профилактики здоровья людей и животных. Вирус клещевого энцефалита является эндемическим заболеванием в Словении, тогда как вирус Западного Нила и вирус Усуту являются патогенами, которые только совсем недавно были занесены в словенский регион (11).В нашем исследовании образцы только одного животного, сипухи ( Tyto alba ), были положительными на антитела к ВЗН, а также к УННВ. Похоже, что обоими вирусами было одновременное заражение, потому что у обоих вирусов был высокий титр VNT (128). Более того, положительный образец был собран осенью 2018 года, когда оба вируса (WNV и USUV) были завезены в Словению, причем первые подтвержденные случаи были зарегистрированы у людей и животных. Хотя известно, что USUV, в частности, вызывает клинические заболевания и смерть у чувствительных птиц, таких как совы, положительная сипуха не показала клинических признаков и была все еще жива через 26 месяцев после сбора положительного образца.Кроме того, при рассмотрении динамики серологической распространенности образцы в нашем исследовании были собраны с 2006 по 2018 год, при этом 33 из 34 положительных образцов на КЭ были обнаружены с 2014 по 2018 год. За последние 2 года нашего исследования 24 образца дали положительный результат. , что может свидетельствовать о распространении эндемической инфекции в районы, ранее не подвергавшиеся воздействию вируса клещевого энцефалита. Последующее сравнительное исследование грызунов и животных зоопарка в ближайшем будущем могло бы подчеркнуть полезность и важность различных дозорных животных для мониторинга зоонозных заболеваний.Расхождение между некоторыми нашими результатами ELISA на TBEV и результатами VNT на TBEV может быть результатом небольшого объема образца, что является распространенной проблемой при получении образцов во время рутинных клинических процедур. Присутствие WNV в Европе известно на протяжении десятилетий. Передача вируса связана с орнитофильными комарами. Дикие птицы — важный естественный усиливающий хозяин для вируса, тогда как люди, лошади и некоторые другие млекопитающие считаются тупиковыми хозяевами. Серологические исследования певчих птиц в Словении показали 3.7% -ная распространенность антител к ВЗН в отобранных образцах, обнаруженных с помощью методов непрямой иммунофлуоресценции (20–22). В ходе ПЦР-исследования образцов хищных птиц и сов из Словении, собранных в период с 1995 по 2013 год, не было обнаружено ни одной положительной птицы (22). В недавнем исследовании из Словении пул Culex sp. В 2018 г. была обнаружена положительная реакция на комаров с помощью ОТ-ПЦР, а в 2017 и 2019 гг. — отрицательная. Дозорное исследование образцов сыворотки собак подтвердило наличие антител к ВЗН с помощью непрямого иммунофлуоресцентного исследования в 1.8 и 4,3% проб, собранных в 2017 и 2018 годах соответственно (23).

Принимая во внимание зоонозный потенциал вышеупомянутых вирусов, регулярный надзор и регулярный скрининг зоологических коллекций могут быть вариантом для улучшения видов животных, находящихся в ведении дозорного эпиднадзора. Пригодность зоологических коллекций в качестве эпидемиологических станций обсуждалась в прошлом (1–3). Виды животных-дозорных будут восприимчивы к болезням, с быстрой сероконверсией, и будут по-прежнему находиться под наблюдением контролирующих органов (1).Животные зоопарка охватывают широкий спектр различных видов с различной восприимчивостью к болезням. В случае WNV и USUV главными хозяевами являются дикие птицы, а главными переносчиками — комары. Однако WNV также был изолирован от других млекопитающих; например, Apodemus flavicollis, Clethrionomys glaerolis , сторожевые мыши и хомяки, Lepus europaeus , верблюды, лошади, собаки и люди в энзоотических очагах (24). Это говорит о том, что выбор подходящей горячей точки для размещения животных-дозорных имеет решающее значение для увеличения вероятности перехвата патогенов (1).

Скрининг USUV у птиц из четырех различных зоологических коллекций в Швейцарии, Австрии и Венгрии показал разные результаты в зависимости от географического положения и связанной с этим смертности. В Швейцарии и Вене в трех разных зоопарках была выявлена ​​распространенность 5–9% антител к USUV, тогда как все животные, протестированные в венгерском зоопарке, были серологически отрицательными (25). Несмотря на то, что возбудители КЭ, ЛЗН и УЗНВ очень близки, их динамика и, следовательно, дежурный целевой скрининг сильно различаются.Клещи являются переносчиками ВКЭ. Типичны их региональная распространенность, а также устойчивая эпидемиологическая ситуация в определенных локусах. USUV и WNV, передаваемые комарами, вызвали периодические вспышки с беспрецедентной динамикой, вероятно, связанные с изменением климата и другими факторами, и медленным внедрением в такие страны, как Словения, где обе болезни не были эндемичными. Эти особые условия создают уникальные условия, такие как зоопарки с различными животными с известными историями, хорошее ветеринарное обслуживание и установленный мониторинг инфекционных заболеваний во всех таксонах, подходящие эпидемиологические станции для скрининга появляющихся патогенов.В недавнем исследовании 120 различных видов млекопитающих из 10 различных зоологических коллекций Испании были оценены на предмет воздействия флавивирусов в период с 2002 по 2019 год. При использовании аналогичных методов присутствие флавивируса было обнаружено в 3,3% исследованных образцов (3).

Наше исследование было основано на простом серологическом исследовании наличия ВКЭ у животных зоопарка. Однако, учитывая наши результаты и представленные литературные данные, следует рассмотреть дальнейшие возможные выводы и будущие исследования, влияющие на здоровье человека и животных, в частности роль зоопарков как возможных эпидемиологических станций.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено. Все образцы были собраны в качестве вторичного интереса сотрудниками зоопарка во время клинических процедур, операций и ежегодных медицинских осмотров или у грызунов, включенных в программу борьбы с вредителями. Не было выдано никакого этического одобрения.Все процедуры с животными были одобрены Национальным этическим комитетом и Администрацией Республики Словения по безопасности пищевых продуктов, ветеринарии и защите растений (номер разрешения 34401-7-2016-5, 31 января 2017 г.). Уход и лечение животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и международными законами и политиками (Директива 2010/63 / ЕС о защите животных, используемых в научных целях).

Авторские взносы

PK отвечал за концептуализацию, исследование, обработку данных, подготовку первоначального черновика, а также за написание-рецензирование и редактирование.JR отвечал за концептуализацию, подготовку первоначального черновика, проверку и редактирование, расследование и надзор. МК занималась программным обеспечением, администрированием проектов и визуализацией. PP отвечал за методологию, исследования и обработку данных. TA-Z занималась концептуализацией, проверкой, разработкой программного обеспечения, а также написанием, рецензированием и редактированием. Е.Б. отвечал за концептуализацию, методологию, программное обеспечение, ресурсы, подготовку первоначального проекта, проверку и редактирование, надзор и привлечение финансирования.KS участвовал в методологии, валидации, формальном анализе, а также в написании-рецензировании и редактировании. Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Это исследование было поддержано внутренним грантом Университета ветеринарных наук Брно (FVHE / Literák / ITA2020).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарны руководству и смотрителям зоопарка Любляны за их поддержку этого исследования и их помощь в сборе образцов. Мы также хотели бы выразить нашу благодарность Хане Зелена, которая отвечала за тест на нейтрализацию вируса, который проводился в Национальной справочной лаборатории по арбовирусам Института общественного здравоохранения Остравы, Чешская Республика. Мы хотели бы поблагодарить Словенское исследовательское агентство (P4-0092 на факультете ветеринарной медицины) за их помощь.

Сокращения

с. s, малая выборка; ТС, токсичная сыворотка.

Список литературы

1. Комар Н. Эпиднадзор за вирусом Западного Нила с использованием сторожевых птиц. Ann N Y Acad Sci. (2001) 951: 58–73. DOI: 10.1111 / j.1749-6632.2001.tb02685.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Кабальеро-Гомес Дж., Кано-Терриза Д., Леколлине С., Карбонелл М.Д., Мартинес-Вальверде Р., Мартинес-Невадо Е. и др. Доказательства воздействия зоонозных флавирусов на млекопитающих в зоопарках Испании и их потенциальную роль в качестве дозорных видов. Vet Microbiol. (2020) 247: 108763. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2020.108763

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Grard G, Moureau G, Charrel RN, Lemasson JJ, Gonzalez JP, Gallian P, et al. Генетическая характеристика клещевых флавивирусов: новый взгляд на эволюцию, патогенетические детерминанты и таксономию. Вирусология. (2007) 361: 80–92. DOI: 10.1016 / j.virol.2006.09.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5.Мэнсфилд К.Л., Джонсон Н., Фиппс Л.П., Стивенсон Дж. Р., Фукс А.Р., Соломон Т. Вирус клещевого энцефалита — обзор зарождающегося зооноза. J Gen Virol. (2009) 90: 1781–94. DOI: 10.1099 / vir.0.011437-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Хольцманн Х., Аберле С.В., Стиасны К., Вернер П., Миссчак А., Зайнер Б., Нетцер М. и др. Клещевой энцефалит от употребления козьего сыра в горном регионе Австрии. Emerg Infect Dis. (2009) 15: 1671–3.DOI: 10.3201 / eid1510.0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Кнап Н., Корва М., Долиншек В., Секирник М., Трилар Т., Авшич-Люпанц Т. Особенности инфицирования вирусом клещевого энцефалита у грызунов в Словении. Vector Borne Zoonotic Dis. (2012) 12: 236–42. DOI: 10.1089 / vbz.2011.0728

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Дурмиши Э., Кнап Н., Саксида А., Трилар Т., Дух Д., Авшич-Люпанц Т. Распространенность и молекулярная характеристика вируса клещевого энцефалита у клещей Ixodes ricinus , собранных в Словении. Vector Borne Zoonotic Dis. (2011) 11: 659–64. DOI: 10.1089 / vbz.2010.0054

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Рачник Я., Славец Б., Довч А., Жлабравец З., Задравец М., Сернел Т. и др. Detekcija virusa Zahodnega Nila pri sivi vrani ( Corvus cornix ) против Словении. Обнаружение Западного Нила у свободноживущей падальщика ( Corvus Cornix ) в Словении. Slov Vet Res. (2019) 56: 160–1.

12. Zelená H, Januska J, Raszka J.Микромодификация теста нейтрализации вируса с витальным окрашиванием в 96-луночном планшете и его использование в диагностике вирусных инфекций Tahyna. Epidemiol Mikrobiol Imunol. (2008) 57: 106–10.

PubMed Аннотация | Google Scholar

13. Худописк Н., Корва М., Джанет Э., Симетингер М., Гргич-Витек М., Губеншек Я. и др. Клещевой энцефалит, связанный с потреблением сырого козьего молока, Словения, 2012 г. Emerg Infect Dis. (2013) 19: 806. DOI: 10.3201 / eid1905.121442

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Марковинович Л., Личина М.К., Тешич В., Войводич Д., Лучич И.В., Книвальд Т. и др. Вспышка клещевого энцефалита, связанная с употреблением сырого козьего молока и сыра, Хорватия, 2015 г. Инфекция. (2016) 44: 661–5. DOI: 10.1007 / s15010-016-0917-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Бойкевич Э., Точиловски К., Сулик А. Клещевой энцефалит — обзор современной эпидемиологии, клинических симптомов, ведения и профилактики. Przeg Epidemiol. (2020) 74: 316–25. DOI: 10.32394 / pe.74.24

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Ruzek D, upanc TA, Borde J, Chrdle A, Eyer L, Karganova G, et al. Клещевой энцефалит в Европе и России: обзор патогенеза, клиники, терапии и вакцин. Antiviral Res. (2019) 164: 23–51. DOI: 10.1016 / j.antiviral.2019.01.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17.Емершич Л., Дедек Д., Брнич Д., Прпич Дж., Яницки З., Керос Т. и др. Обнаружение и генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), полученного от клещей, удаленных от красных лисиц ( Vulpes vulpes ) и выделенных из образцов селезенки благородного оленя ( Cervus elaphus ) в Хорватии. Ticks Tick Borne Dis. (2014) 5: 7–13. DOI: 10.1016 / j.ttbdis.2012.11.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Bournez L, Umhang G, Faure E, Boucher JM, Boué F, Jourdain E, et al.Воздействие вирусов Усуту и ​​клещевого энцефалита на диких копытных во Франции в 2009–2014 годах: свидетельства невыявленной циркуляции флавивирусов десять лет назад. Вирусов. (2020) 12:10. DOI: 10.3390 / v12010010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Ширмарова Дж., Тиха Л., Головченко М., Салат Дж., Грубхоффер Л., Руденко Н. и др. Распространенность Borrelia burgdorferi вируса чувствительности и клещевого энцефалита среди животных зоопарков в Чешской Республике. Ticks Tick Borne Dis. (2014) 5: 523–7. DOI: 10.1016 / j.ttbdis.2014.03.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Рачник Ю. Эпидемиологическое исследование птичьего гриппа и вируса Западного Нила у птиц в Словении (докторская диссертация). Любляна: Университет Любляны (2008 г.).

Google Scholar

21. Рачник Й., Зорман-Ройс О., Трилар Т., Еловшек М., Дух Д., Довч А. и др. Демонстрация антител к вирусу Западного Нила у диких птиц в Словении.In: VIII Симпозиум дней птицы 2009. Пореч, Хорватия, 25-28 марта 2009 г. . Загреб: Hrvatski Veterinarski Institut, Centar za Peradarstvo (2009). п. 69–71.

22. Рачник Дж., Славец Б., Задравец М., Зорман Ройс О. Мониторинг вируса Западного Нила у диких птиц в Словении. Rad HAZU Med Sci. (2013) 39: 89–93.

Google Scholar

23. Кнап Н., Корва М., Ивович В., Калан К., Еловшек М., Сагадин М. и др. Вирус Западного Нила в Словении. Вирусов. (2020) 12: 720. DOI: 10.3390 / v12070720

CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Бучебнер Н., Ценкер В., Венкер С., Стейнмец Х.В., Сос Э., Люсси Н. и др. Низкая распространенность вируса Усуту в четырех зоологических садах в Центральной Европе. BMC Vet Res. (2013) 9: 1–7. DOI: 10.1186 / 1746-6148-9-153

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) — AnimaLabs ©

Описание продукта

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ)

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является возбудителем клещевого энцефалита (КЭ), потенциально смертельной неврологической инфекции, поражающей людей и животных.ВКЭ является представителем рода Flavivirus в семействе Flaviviridae. Выделяют три основных подтипа вируса: европейский, сибирский и дальневосточный. Переносчиками ВКЭ являются клещи Ixodes ricinus и Ixodes persiculatus.

Проба: ЦСЖ, 0,5 мл ЭДТА-кровь

Режимы трансмиссии

Вирус клещевого энцефалита передается через укусы клещей и при употреблении непастеризованного козьего молока.

Клинические признаки

Известно, что вирус клещевого энцефалита сначала реплицируется в месте заражения, а затем в лимфатических узлах, дренирующих место заражения.Репликация вируса в дренирующих лимфатических узлах сопровождается развитием плазменной виремии. Гематогенное распространение позволяет инфицировать различные органы, особенно ретикуло-эндотелиальную систему (селезенка, печень и костный мозг), и именно во время этой фазы вирус также проникает через гематоэнцефалический барьер и проникает в центральную нервную систему (ЦНС). где вирусная репликация вызывает воспаление, лизис и клеточную дисфункцию. Инкубационный период обычно составляет 7–14 дней. Симптомы во время начального короткого лихорадочного периода могут включать усталость, головную боль и боль в шее, плечах и пояснице, сопровождающиеся высокой температурой и рвотой.За этим часто следует бессимптомный период продолжительностью 2–10 дней, и если болезнь прогрессирует до неврологического поражения, это приводит ко второй фазе, характеризующейся острыми симптомами со стороны ЦНС с высокой температурой. Инфекция ЦНС может проявляться в мозговых оболочках (воспаление вызывает менингит), паренхиме головного мозга (вызывая энцефалит), спинном мозге (миелит), нервных корешках (радикулит) или любой их комбинации. По сравнению с людьми, домашние животные, инфицированные ВКЭ, обычно протекают бессимптомно.

Профилактика

Активная вакцинация — наиболее эффективный метод профилактики вируса клещевого энцефалита, поскольку современные вакцины доказали свою безопасность и эффективность от 95 до 99%.

Прогноз

Прогноз зависит от возраста пациента, но выздоровление, как правило, затруднено. Смертность для европейского, дальневосточного и сибирского подтипов составляет 1-2%, 20-40% и 2-3% соответственно.

Распространенность

Наблюдался рост заболеваемости КЭ, в среднем 8755 зарегистрированных случаев КЭ в год в Европе и России.

Список литературы

Мэнсфилд, К.Л., Джонсон, Н., Фиппс, Л.П., Стивенсон, Дж. Р., Фукс, А. Р., Соломон, Т. (2009). Вирус клещевого энцефалита — обзор зарождающегося зооноза. J Gen Virol 90, 1781–1794.

Wicki, R., Sauter, P., Mettler, C., Natsch, A., Enzler, T., Pusterla, N., Kuhnert, P., Egli, G., Bernasconi, M., Lienhard, R. , и другие. (2000). Исследование швейцарской армии в Швейцарии для определения распространенности Francisella tularensis, представителей геногруппы Ehrlichia phagocytophila, Borrelia burgdorferi sensu lato и вируса клещевого энцефалита у клещей.Европейский журнал клинической микробиологии и инфекционных заболеваний 19, 427–432.

Сравнение полных геномов вируса клещевого энцефалита из горных альпийских регионов и регионов с меньшей высотой

Для всех штаммов TBEV-EU, включенных в исследование, были сгенерированы полные геномные последовательности. Филогенетическое древо, основанное на нуклеотидных последовательностях, не показало доказательств общего происхождения горных штаммов (рис. 1). Штаммы вирусов D15_33, K2 и HB171_11 имели самое близкое филогенетическое родство друг с другом, несмотря на то, что происходили с разных высот и мест сбора, удаленных друг от друга на 200 км.

Филогенетическое дерево полных геномов нескольких штаммов TBEV-Eu. Полные геномы были амплифицированы в три ампликона ДНК, покрывающих весь геном [15]. Для секвенирования использовалась платформа Illumina MiSeq и набор реагентов MiSeq V3 (Illumina, Inc., Сан-Диего, США) в соответствии с инструкциями производителя. Сборка производилась с помощью программы Spades v.3.12. Для филогенетического сравнения были выбраны доступные полногеномные последовательности TBEV-Eu, опубликованные в базе данных NCBI GenBank.Дерево было сгенерировано с использованием метода максимального правдоподобия, и для статистической поддержки было реализовано 1000 бутстрапов [16,17,18,19]. Штаммы, использованные в этом исследовании, выделены красным (альпийские регионы) и синим (более низкие высоты). b Таблица, содержащая метаданные для штаммов ВКЭ, использованных в анализе.

В таблице 1 сравнивались различные штаммы в отношении нуклеотидных изменений / аминокислотных различий. Этот анализ показывает, что штамм K2 больше всего отличается от штамма NE_1 / 7 (Neudoerfl) с 219 нуклеотидными изменениями (показаны курсивом ), тогда как штаммы D15_569 и D17_1044 показывают наименьшие различия (показаны жирным шрифтом ).Что касается замен аминокислот, наибольшая разница в 40 замен аминокислот наблюдается между штаммами K2 и D17_1989 (выделено курсивом , ), а наименьшая разница в аминокислотах наблюдается между штаммами HB171_11 и BaWa16_303 только с 19 заменами аминокислот (указано в ). Жирный ).

Все десять аминокислотных последовательностей выровняли и проанализировали на предмет замен.Не было обнаружено общих аминокислотных замен, отличающих альпийский штамм от низинного. Все вирусные белки анализировали отдельно. Капсидный белок показал до двух индивидуальных изменений в аминокислотной последовательности. Белок prM / M показал до двух индивидуальных изменений в последовательности, причем только штамм HB171_11 имел несинонимичное изменение T141I. Штамм D14_97 показал четыре аминокислотных изменения в последовательности Е-гена, два из которых были гетерологичными и могли влиять на поверхностный заряд вирусной мембраны.Другие несинонимичные изменения были обнаружены в штамме D15_569 с L459S, штамме D17_1989 с Y130H и K2 с A83T. Y130H уже коррелировал с повышенной нейроинвазивностью у мышей с иммунодефицитом [20].

Белок NS1 показал до двух индивидуальных аминокислотных изменений. Штамм D17_1044 показал несинонимичную замену неполярного I127T, K2 на один из P103S и HB171_11 A41T. По сравнению с его длиной наиболее изменчивым белком был NS2A. Три штамма D15_33, K2 и HB171_11 показали одинаковую синонимичную замену V41I, а штаммы D17_1044 и D17_1989 имели замену I53M.Последнее примечательно, поскольку оба принадлежат к двум разным генетическим кластерам и имеют другую замену в своем белке NS3.

В аминокислотном выравнивании NS2B могут быть идентифицированы два несинонимичных изменения для штаммов D15_569 и HB171_11. Для NS3 было обнаружено до трех индивидуальных замен, и три штамма (D15_33, D18_1133 и K2) показали несинонимичные изменения. NS4A показал одну замену в трех вирусах, при этом только замена Gly100 на серин в штамме D17_1044 не была синонимична.Три штамма (D17_1989, K2 и HB171_11) имели до двух индивидуальных замен в белке NS4B.

NS5 показал до четырнадцати аминокислотных замен в диапазоне от одного до семи индивидуальных изменений. Вирус с наибольшим количеством индивидуальных изменений — штамм D17_1044, за которым следует штамм D17_1989.

Штаммом вируса с наименьшим количеством индивидуальных аминокислотных изменений был штамм D18_1133 с 23% изменениями в их аминокислотной последовательности. За ним последовал штамм D14_97 с 33,3% индивидуальных изменений.Штамм вируса с наибольшими индивидуальными изменениями был HB171_11 с 48%.

Следовательно, филогенетический анализ часто приводит к плохой статистической поддержке и требует очень осторожной интерпретации. Сравнение наших штаммов ВКЭ подтверждает это наблюдение, поскольку генетическое различие десяти штаммов ВКЭ в нашем исследовании составляло всего 0,028 замен на сайт. За последние два десятилетия наблюдается явный сдвиг в распространении вируса клещевого энцефалита с более низких высот на более высокие. Пока неясно возможное влияние на геномные характеристики ВКЭ.Одна из рабочих гипотез заключалась в том, что репликация вируса должна адаптироваться к суровым условиям окружающей среды. Следовательно, эти штаммы могут демонстрировать определенные специфические изменения в своих геномах в ответ на условия, в которых они находились в регионах с большей высотой. Другое объяснение состоит в том, что каждый штамм из горной местности произошел от общего предка, адаптированного к условиям гор. После дальнейшего распространения они могли образовывать новые природные очаги. Кроме того, изменение климатических и, следовательно, эко-эпидемиологических условий на больших высотах может привести к улучшению условий для репликации ВКЭ у клещей.

Нам не удалось найти общий специфический генетический признак, присущий всем штаммам из районов на высоте более 500 м над уровнем моря. Согласно филогенетическому анализу, каждый штамм вируса, вероятно, был занесен индивидуально в свое местоположение и обнаружил благоприятные условия окружающей среды (возможно, из-за изменений климата). Мы наблюдали некоторые аминокислотные изменения, описанные в статье Formanová et al. [21] во всех восьми штаммах вируса (а именно Ile167V, E127D, V201I и G206R).Кроме того, T33S был обнаружен в HB171_11 и D17_1989, а I53M — в D17_1044 и D17_1989. Кроме того, мы не смогли определить тесную филогенетическую связь между горными разновидностями. Фактически, штамм D15_33 был генетически наиболее близок к штаммам нижних высот HB171_11 и K2 в нашем анализе. Это еще один показатель того, что вновь появившиеся штаммы случайно попадают в новые районы.

NS2A, как утверждается, участвует в сдвиге между упаковкой РНК и репликацией РНК [22, 23], его высокая вариабельность может быть причиной разной скорости репликации и инфекционности разных штаммов ВКЭ.То же самое может относиться к высокой вариабельности NS2B, белка, который предположительно участвует в модуляции проницаемости мембраны во время инфекции [24]. Чтобы подтвердить или опровергнуть эту гипотезу, необходимо провести дальнейшие эксперименты.

Поскольку мы не смогли найти никаких намеков, указывающих на конкретные генетические характеристики штаммов ВКЭ, обитающих на больших высотах, мы предполагаем, что другие причины новой модели распределения ответственны за появление альпийского распространения ВКЭ.

Как показано Rubel et al.в [25] Альпы претерпели серьезный климатический сдвиг с 1876 года. Можно предположить, что этот сдвиг способствует трансформации альпийской среды и, следовательно, может измениться распределение видов переносчиков и животных-хозяев.