Вирус клещевого энцефалита: Клещевой вирусный энцефалит

Вирус клещевого энцефалита, IgM

Антитела класса IgM к вирусу клещевого энцефалита – это специфические противовирусные белки-иммуноглобулины, вырабатываемые иммунной системой в ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита и свидетельствующие о текущей инфекции.

Результат исследования – полуколичественный.

Синонимы русские

Антитела класса IgM к вирусу клещевого энцефалита (Encephalitis virus), иммуноглобулины класса M к вирусу клещевого энцефалита.

Синонимы английские

Anti-arboviral Encephalitis IgM, Encephalitis Virus Antibodies, IgM, Tick-borne encephalitis virus IgM (TBE virus IgM).

Метод исследования

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Единицы измерения

Ед/мл (единица на милилитр)

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Клещевой энцефалит – это сезонное (весенне-летнее) вирусное заболевание, передающееся в основном с укусом клещей; поражает преимущественно центральную нервную систему.

Возбудитель клещевого энцефалита относится к арбовирусам, семейству флавивирусов, и подразделяется на три подвида: дальневосточный, центральноевропейский и сибирский. Основной переносчик энцефалита – иксодовые клещи. Кроме того, он передается через птиц, грызунов и хищников. Инкубационный период в среднем составляет 3-7 суток. Клинические проявления болезни разнообразны. Выделяют лихорадочную, менингеальную, менингоэнцефалитическую, полиомиелитическую и полирадикулоневритическую формы заболевания. Возможно длительное вирусоносительство в виде латентной, персистентной или хронической инфекции.

В ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита или на вакцинацию против этого вируса иммунной системой вырабатываются специфические противовирусные антитела – белки-иммуноглобулины. Уже при первых симптомах заболевания в крови появляются иммуноглобулины класса M. Их уровень достигает максимума через 3,5-4,5 недели с момента инфицирования и затем постепенно в течение нескольких месяцев снижается.

Для чего используется исследование?

• Для подтверждения диагноза «клещевой энцефалит» (как текущего, так и недавно перенесенного заболевания).
• Как часть дифференциальной диагностики при поражении центральной нервной системы (инфекционных менингитах и энцефалитах другого происхождения, эпилепсии, асептическом менингите, тромбозе артерий или вен головного мозга, инсульте, внутричерепном кровоизлиянии, фебрильных судорогах, ВИЧ-инфекции, цистицеркозе, саркоидозе, сифилисе, карциноматозе мозговых оболочек, паранеопластическом энцефаломиелите и др.).

Когда назначается исследование?

При подозрении на текущий или перенесенный клещевой энцефалит.

Что означают результаты?

Референсные значения

Результат: отрицательный.

Концентрация: 0 — 100 Ед/мл.

Причины положительного результата

• Ранние стадии клещевого энцефалита (при этом IgG к вирусу клещевого энцефалита не выявляются). В таком случае рекомендуется повторить исследование через 7-10 дней.
• Текущий или недавно перенесенный клещевой энцефалит (в сочетании с положительным тестом на IgG к вирусу клещевого энцефалита) при условии, что не проводилась вакцинация против клещевого энцефалита.
• Недавно проведенная вакцинация против клещевого энцефалита.

Причины отрицательного результата

• Отсутствие недавнего инфицирования и, соответственно, иммунного ответа на вирус клещевого энцефалита (если IgG тоже не выявляются).
• Наличие активного иммунитета вследствие недавно перенесенной инфекции или успешной вакцинации (если тест на IgG к вирусу клещевого энцефалита положительный).
• Слабый иммунный ответ (или его отсутствие) на клещевой энцефалит из-за нарушений иммунной системы (если IgG к вирусу клещевого энцефалита не выявляются).

Что может влиять на результат?

Наличие перекрестно-реагирующих антител к другим возбудителям рода флавивирусов (вируса лихорадки Западного Нила, вируса японского энцефалита и др.).

Вирус клещевого энцефалита, IgG

Антитела класса IgG к вирусу клещевого энцефалита – это специфические противовирусные белки-иммуноглобулины, вырабатываемые иммунной системой в ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита и свидетельствующие о текущей либо перенесенной инфекции или об успешной вакцинации.

При положительном результате указывается концентрация обнаруженных антител, а также титр.

Синонимы русские

Антитела класса IgG к вирусу клещевого энцефалита (Encephalitis virus), иммуноглобулины класса G к вирусу клещевого энцефалита.

Синонимы английские

Anti-arboviral Encephalitis IgG, Encephalitis Virus Antibodies, IgG, Tick-borne encephalitis virus IgG (TBE virus IgG).

Метод исследования

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Единицы измерения

Ед/мл (единица на миллилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Клещевой энцефалит – это сезонное (весенне-летнее) вирусное заболевание, передающееся в основном с укусом клещей; поражает преимущественно центральную нервную систему.

Возбудитель клещевого энцефалита относится к арбовирусам, семейству флавивирусов, и подразделяется на три подвида: дальневосточный, центральноевропейский и сибирский. Основной переносчик энцефалита – иксодовые клещи. Кроме того, он передается через птиц, грызунов и хищников. Инкубационный период в среднем составляет 3-7 суток. Клинические проявления болезни разнообразны. Выделяют лихорадочную, менингеальную, менингоэнцефалитическую, полиомиелитическую и полирадикулоневритическую формы заболевания. Возможно длительное вирусоносительство в виде латентной, персистентной или хронической инфекции.

В ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита или на вакцинацию против этого вируса иммунной системой вырабатываются специфические противовирусные антитела – белки-иммуноглобулины. Иммуноглобулины класса G возникают в крови спустя неделю после появления первых симптомов, достигают максимума через 1,5-2,5 месяца с момента инфицирования и сохраняются на протяжении всей жизни, обеспечивая стойкий иммунитет.

Для чего используется исследование?

• Для подтверждения диагноза «клещевой энцефалит» (как текущего, так и недавно перенесенного заболевания).
• Чтобы оценить иммунитет после перенесенного клещевого энцефалита или после вакцинации против него.
• Как часть дифференциальной диагностики при поражении центральной нервной системы (инфекционных менингитах и энцефалитах другого происхождения, эпилепсии, асептическом менингите, тромбозе артерий или вен головного мозга, инсульте, внутричерепном кровоизлиянии, фебрильных судорогах, ВИЧ, цистицеркозе, саркоидозе, сифилисе, карциноматозе мозговых оболочек, паранеопластическом энцефаломиелите и др.).

Когда назначается исследование?

• При подозрении на текущий или перенесенный клещевой энцефалит.
• При проведении вакцинации против клещевого энцефалита.

Что означают результаты?

Референсные значения

Концентрация: 0 — 100 Ед/мл.

Результат: отрицательный.

Причины положительного результата

• Наличие активного иммунитета вследствие ранее перенесенной инфекции или вакцинации (если тест на IgM к вирусу клещевого энцефалита отрицательный).
• Текущий или недавно перенесенный клещевой энцефалит (в сочетании с положительным тестом на IgM к вирусу клещевого энцефалита) при условии, что не проводилась вакцинация.
• Недавно проведенная вакцинация против вируса клещевого энцефалита.

Четырехкратное нарастание титра IgG-антител в парных сыворотках (в остром периоде инфекции и периоде выздоровления), а также повышение уровней IgG и IgM указывает на наличие клещевого энцефалита. Повышение титра IgG после введения вакцины свидетельствует о ее успешности.

Причины отрицательного результата

• Отсутствие недавнего инфицирования и, соответственно, иммунного ответа на вирус (если IgM к вирусу клещевого энцефалита не выявляются). Если есть подозрение на инфекцию, целесообразно назначить повторные анализы на IgM и IgG через 7-10 дней.
• Ранние стадии клещевого энцефалита (если уровень IgM повышен).
• Слабый иммунный ответ (или его отсутствие) на клещевой энцефалит вследствие нарушений иммунной системы (если IgM к вирусу клещевого энцефалита не выявляются).

Что может влиять на результат?

Наличие перекрестно-реагирующих антител к другим возбудителям рода флавивирусов (вирус лихорадки Западного Нила, вирус японского энцефалита и др.).

Клещевой вирусный энцефалит и его профилактика

Клещевой энцефалит и его профилактика — это важнейшие темы в весенний и летний периоды для любителей активного отдыха на природе. Однако в последнее время укусы иксодовых клещей отмечаются в массовом порядке и в центрах крупных городов. Эти кровососущие насекомые прекрасно себя чувствуют в полосах озеленения, городских парках, скверах и аллеях.

Маленький и с виду безобидный клещ может вызвать опасное заболевание — клещевой вирусный энцефалит. Эта инфекционная болезнь проявляется лихорадкой, интоксикацией и поражением центральной нервной системы.

Как обезопасить себя от этого недуга? Что делать, если произошло заражение? Какие есть способы лечения?

Энцефалит и клещ

Переносят энцефалит клещ собачий в Европе и клещ таежный в Сибири и на Дальнем Востоке. Зараженный клещ сохраняет вирус всю жизнь.

Инфекция быстро погибает при нагревании, действии ультрафиолетового облучения. Может долго сохранять активность в необработанном молоке. Считается, что болезнь, вызванная дальневосточным подтипом вируса, протекает тяжелее.

Заболевание клещевой энцефалит

Вирус клещевого энцефалита содержится в слюне насекомого. Передача его человеку или животному происходит в момент укуса. Следует отметить, что даже если клеща удалить сразу после того, как он прицепился, риск заболеть все равно остается. Заболевание клещевой энцефалит развивается в течение 2 — 3 недель.

Возможно заражение и при раздавливании клеща на коже — через небольшие кожные ранки и микротравмы вирус быстро проникнет в кровоток.

Можно подцепить недуг и при употреблении некипяченого козьего или овечьего молока, так как коз и овец клещ инфицирует очень часто. В этом случае могут возникнуть семейные вспышки болезни.

Признаки и симптомы клещевого энцефалита

Обычно в месте присасывания клеща не возникает никаких изменений. Инкубационный (скрытый) период длится от 2 до 21 дней. Признаки энцефалита появляются спустя это время.

Когда вирус проникает в кровь, то появляются симптомы энцефалита, напоминающие грипп: усталость, утомляемость, слабость, снижение аппетита, может быть ломота в костях, повышение температуры. Это так называемая лихорадочная форма болезни. Считается, что она протекает достаточно легко, не оставляя последствий.

В мозг вирус попадает через гематоэнцефалический барьер. Если это происходит, то к лихорадке добавляются неврологические симптомы клещевого энцефалита.

Болезнь клещевой энцефалит головного мозга

Болезнь клещевой энцефалит поражает клетки головного мозга. Тяжесть поражения нервной системы определяет проявления и прогноз болезни. Если воспалены мозговые оболочки, то клещевой энцефалит протекает в менингеальной форме. В таком случае к лихорадочным проявлениям присоединяются резкая головная боль, светобоязнь, напряжение затылочных мышц. Считается, что эта форма также может протекать без последствий.

Клещевой энцефалит: последствия и осложнения

При поражении нервных клеток мозга развивается очаговые формы заболевания энцефалит головного мозга. Именно они являются наиболее опасными, так как могут оставить тяжелые осложнения клещевого энцефалита или привести к летальному исходу. Впоследствии возможно нарушение двигательных функций, расстройство памяти, нередко люди становятся инвалидами. Осложнения клещевого энцефалита могут привести к инвалидности.

Лечение клещевого энцефалита проводится только в больнице, как правило, в отделении интенсивной терапии. Своевременное направление в стационар может улучшить прогноз заболевания!

Вакцинация против клещевого энцефалита

Самая надежная мера защиты — это вакцинация против клещевого энцефалита, иными словами, прививка. Обязательной вакцинации подлежат люди, работающие в очагах риска по энцефалиту: геологи, лесники, охотники и так далее.

Прививки могут проводиться как по плановой, так и по экстренной схеме. Чтобы сформировать иммунитет к началу сезона, первую дозу вакцины вводят осенью, вторую зимой.

Экстренная прививка от клещевого энцефалита

Экстренная схема прививки от клещевого энцефалита (две инъекции с интервалом в две недели) проводится в том случае, если человек приехал в очаг, распространения клещевого энцефалита внезапно.

Опасный период — весна и лето. В другие сезоны экстренная профилактика энцефалита не проводится. Через год привитые вакцинируются повторно.

Если человек не привит, но клещ его все-таки укусил, то профилактически ему вводится доза иммуноглобулина. Поэтому при присасывании клеща обязательно надо обращаться к медицинским работникам!

Собираемся в поход

Впрочем, без особой необходимости места обитания клещей лучше избегать, особенно в мае — июне. А если уж вы собрались в лес, то ходите проторенными тропами, не залезая в чащу. Надевайте одежду с длинными рукавами. Штаны заправляйте в носки, носите высокие сапоги. Не пренебрегайте головным убором.

Чтобы клещей было легче заметить, лучше подходит светлая одежда. По возвращении из леса одежду и тело надо осмотреть.

Выкручиваем клеща

Удалять клеща можно маникюрным пинцетом или нитью, обвязав ее вокруг головы паразита. Клещ удаляется раскачивающие — выкручивающими движениями. Важно не раздавить клеща. Иногда выкрутить насекомое помогает растительное масло, капните пару капель на место присасывания.

Ранку можно обработать любым дезинфицирующим раствором (йодом, зеленкой, спиртом). Клеща после удаления надо отвезти в медицинское учреждение на анализ.

Справка

После укуса клеща, зараженного вирусом энцефалита, необходимо в течение 3 дней провести экстренную профилактику. Ввести противоклещевой иммуноглобулин в дозе 1 мл на 10 кг веса или принимать йодантипирин по соответствующей схеме. Осложнения энцефалита настолько опасны, что лучше подстраховаться заранее.

 

А вот прививаться от клещевого энцефалита после укуса клеща не только поздно, но и противопоказано. Если человек уже получил вирус, который находится в инкубационном периоде, ему еще добавляется вирус (хоть это и убитая вакцина), могут быть осложнения. Вакцинироваться против клещевого энцефалита необходимо до сезона активности клещей. Если раньше клещевой энцефалит в основном был распространен на Дальнем Востоке и в Сибири, то сейчас и в европейской части России. Здесь люди находятся в группе риска, поскольку раньше этого заболевания не было, а, следовательно, и иммунитет не выработался. Последствия энцефалита в этом случае могут быть непредсказуемыми.

 

Меры профилактики клещевого энцефалита

Отсутствие антител через несколько дней после профилактического введения противоклещевого иммуноглобулина, в том случае, если правильно проведено лабораторное обследование, говорит, прежде всего, о неадекватной дозе иммуноглобулина. Доза рассчитывается следующим образом: 1 мл на 10 кг веса. Стройной худенькой женщине и крупному мужчине требуется совершенно разная доза. Существуют и другие экстренные меры профилактики клещевого энцефалита.

Принимать йодантипирин или другой препарат, использование которого возможно для экстренной профилактики от клещевого энцефалита, через 7 дней после укуса поздно. Крайний срок — 5 дней.

Самая эффективная защита от энцефалита — это вакцинация, конечно, проведенная заранее.

В апреле—мае наступает пик численности клещей. Клещи летать не умеют, зато могут подниматься по кустам, высокой траве, а также успешно планировать с порывом ветра, ориентируясь на запах человека, который они чувствуют за 10—15 метров. Поэтому вдоль тропинок клещей всегда больше, чем в глубине леса или парка.

Собираясь в лес, желательно надевать рубашку с плотно прилегающими манжетами, которую заправляют в брюки, а брюки — в носки, на голове туго повязывают косынку.

Сезон активности клещей — май — сентябрь, но многое зависит от погодных условий. Бывает, что клещи становятся активными с апреля.

Вакцинация состоит из трех инъекций, курс рассчитан на год, но уже после двух первых инъекций можно рассчитывать на то, что в организме выработался достаточный уровень антител.

Интервал между первой и второй инъекциями должен быть не меньше месяца (от месяца до пяти), поэтому начинать вакцинацию нужно в феврале—марте. Третью прививку делать через год после первой, то есть в следующем феврале — марте. Ревакцинация проводится однократной прививкой 1 раз в 3 года.

Нужно заметить, что вакцинация от энцефалита не входит в Национальный календарь профилактических прививок, поэтому о себе придется позаботиться самим.

Если одеться правильно, то до кожи клещ не доберется.

Присосаться клещ может только в определенных местах. Он ищет тонкую кожу (за ушами, под грудью, на шее, на сгибе локтя, в паху, на талии). Укус его похож на глаз — в центре располагается темное пятно, потом следуют белый круг и высыпания по краям.

Не забывайте: после выхода из леса нужно внимательно осмотреть себя и свою одежду. Клеща можно принести домой также с букетом цветов, грибами, в шерсти собак.

Характеристика вируса клещевого энцефалита европейского субтипа, циркулирующего на территории Сибири | Козлова

1. King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.J. Lefkowitz E.B. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Elsevier Academic Press; 2012.

2. Злобин В.И., Демина Т.В., Беликов С.И., Бутина Т.В., Горин О.З., Адельшин Р.В. и др. Генетическое типирование штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа уровней гомологии фрагмента гена белка оболочки. Вопросы вирусологии. 2001; 46: 17 — 22.

3. Злобин В.И., Демина Т.В., Мамаев Л.В., Бутина Т.В., Беликов С.И., Горин О.З. и др. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е. Вопросы вирусологии. 2001; 46: 12 — 16.

4. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Козлова И.В., Верхозина М.М., Ткачев С.Е., Дорощенко Е.К. и др. Генотипы 4 и 5 вируса клещевого энцефалита: особенности структуры геномов и возможный сценарий их формирования. Вопросы вирусологии. 2012; 57 (4): 13 — 19.

5. Kim S.Y., Yun S.M., Han M.G., Lee I.Y., Lee N.Y. et al. Isolation of tick-borne encephalitis viruses from wild rodents, South Korea. Vector Borne Zoonotic Dis. 2008; 8 (1): 7 — 13.

6. Yun S.M., Kim S.Y., Han M.G., Jeong Y.E., Yong T.S., Lee C.H. et al. Analysis of the envelope (E) protein gene of tick-borne encephalitis viruses isolated in South Korea. Vector Borne Zoonotic Dis. 2009; 9 (3): 287 — 293.

7. Верхозина М.М., Козлова И.В., Демина Т.В., Джиоев Ю.П. Молекулярно-эпидемиологическая и эколого-географическая характеристика вируса клещевого энцефалита в Восточной Сибири. В кн.: Инфекции, передаваемые иксодовыми клещами в Сибирском регионе. Новосибирск: СО РАН; 2011; 30: 84 — 107.

8. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 2013; 30: 2725 — 2729.

9. Pletnev A.G., Yamshikov V.F., Blinov V.M. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus. Virology. 1990; 174: 250 — 263.

10. Reed L., Muench H.A. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. Am. J. Hyg. 1938; 27: 493 — 497.

11. Pogodina V.V., Savinov A.P Variation in the pathogenicity of viruses of the tick-borne encephalitis complex for different animal species. I. Experimental infection of mice and hamsters. Acta virologica. 1964; 8: 424 — 434.

12. Овчинникова Э.А., Карпович Л.Г., Левкович Е.Н. Изучение терморезистентности штаммов вируса комплекса клещевого энцефалита, обладающих различной нейровирулентностью для лабораторных животных. Вопр. вирусол. 1967; 5: 607.

13. Adelshin R.V., Melnikova O.V., Karan L.S., Andaev E.I., Balakhonov S.V. Complete Genome Sequences of Four European Subtype Strains of Tick-Borne Encephalitis Virus from Eastern Siberia, Russia. Genome Announc. 2015; 3 (3). pii: e00609-15. doi: 10.1128/genomeA.00609-15.

14. Weidmann M., Frey S., Freire C.C., Essbauer S. et al. Molecular phylogeography of tick-borne encephalitis virus in central Europe. J. Gen. virol. 2013; 94: 2129 — 2139.

15. Demina T.V., Dzhioev Yu.P., Verkhozina M.M., Kozlova I.V., Tkachev S.E., Plyusnin A. et al. Genotyping and characterization of the geographical distribution of tick-borne encephalitis virus variants with a set of molecular probes. Journal of Medical Virology. 2010; 82: 965 — 976.

16. Yun S.M., Song D.G., Choi W., Park W.I. et al. Prevalence of tick-borne encephalitis virus in ixodid ticks collected from the Republic of Korea during 2011 -2012. Osong Public Health Res. Perspect. 2012; 3 (4): 213 — 221.

17. G umann R., R ek D., M hlemann K., Strasser M., Beuret C.M. Phylogenetic and virulence analysis of tick-borne encephalitis virus field isolates from Switzerland. J. Med Virol. 2011; 83 (5): 853 — 863.

18. Adelshin R.V., Melnikova O.V., Trishina Y.N., Andaev E.I. Tick-borne encephalitis virus isolates features from natural foci of Pribaikalie (Eastern Siberia, Russia). J. Dis. Epidemiol. 2015; 1 — 4.

19. Suss J. Epidemiology and ecology of TBE relevant to the production of effective vaccines. Vaccine. 2003; 21 (1): 19 — 35.

20. Wojcik-Fatla A., Cisak E., Zajac V., Zwolinski J., Dutkiewicz J. Prevalence of tick-borne encephalitis virus in Ixodes ricinus and Dermacentor reticulates ticks collected from the Lublin region (eastern Poland). Ticks Tick Borne Dis. 2011; 2 (1): 16 — 19.

21. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Козлова И.В. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. Иркутск: РИО ВСНЦ СО РАМН; 2003: 272.

22. Jaaskelainen A.E., Tonteri E., Sironen T., Pakarinen L., Vaheri A., Vapalahti O. European subtype tick-borne encephalitis virus in Ixodes persulcatus ticks. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17 (2): 323 — 325.

23. Якименко В.В., Ткачев С.Е., Макенов М.Т., Малькова М.Г., Любенко А.Ф., Рудакова С.А. и др. О распространении вируса клещевого энцефалита европейского субтипа в Западной Сибири и на Алтае. Дальневосточный журнал инфекц. патологии. 2015; 27: 29-35.

24. Kozuch O., Nosek J., Chmela E., Uvizl M., Bolek S. The ecology if the virus of tick-borne encephalitis in the natural foci in the Olomouc district. Cesk. Epidemiol. Mikrobiol. Immnol. 1976; 25 (2): 88 — 96.

25. International Catalogue of Arboviruses. 3rd Edition. Karabatsos N (Eds). American Society of Tropical Medicine and Hygiene, San Antonio, TX, USA. 1985.

26. Achazi K., R ek D., Donoso-Mantke O., Schlegel M., Ali Hanan Sheikh, Wenk M. et al. Rodents as Sentinels for the Prevalence of Tick-Borne Encephalitis Virus. Vector-borne and zoonotic diseases. 2011; 11 (6): 641 — 647.

Клещевой энцефалит Статьи

« Назад

Ни для кого не секрет, что из 18 административных территорий Санкт-Петербурга 6 являются эндемичными по клещевому энцефалиту, в том числе и Красносельский район, следовательно, для жителей нашего района не обязательно выезжать загород, чтобы встретиться с клещом.

Одно из наиболее опасных заболеваний, передающихся через укус клеща, является — клещевой энцефалит. Клещевой энцефалит — это вирусная инфекция, характеризующаяся лихорадкой, интоксикацией, поражением центральной и периферической нервных систем. Инфекция опасна часто развивающимися осложнениями, такими как: парез, паралич с инвалидизацией пострадавших. В тяжелых случаях возможен летальный исход.

К заражению клещевым энцефалитом восприимчивы все люди, независимо от возраста и пола. Чаще болеют лица в возрасте 20-40 лет и дети младше 14 лет. 

Инфицирование человека вирусом клещевого энцефалита происходит при присасывании клещей. Передача вируса клещевого энцефалита  происходить в первые минуты присасывания клеща к человеку, в момент впрыскивания клещом слюны обладающей обезболивающим эффектом. Так же возможно заражение через пищеварительный тракт при употреблении сырого молока коз, коров, зараженных клещевым энцефалитом. Следует помнить, что вирус сохраняется в непастеризованном молоке до 7 дней. После кипячения молоко безопасно. 

Сезонный подъем заболеваемости приходится на весну (май–июнь) и конец лета (август–сентябрь). 

На территории РФ зарегистрировано 4 широко используемые взаимозаменяемые вакцины гарантированного качества, они способны защитить человека не менее чем в 95% случаев. В СПб ГБУЗ «Городская поликлиника №91» используется вакцина Энцевир. Вакцина Энцевир представляет собой очищенную концентрированную стерильную взвесь инактивированного вируса клещевого энцефалита, полученную на культуре клеток куриных эмбрионов.

Следует помнить, что вакцина предназначена для защиты от клещевого энцефалита, а не от всех болезней, переносимых клещами.

Вакцинироваться против клещевого энцефалита лучше начинать осенью  (в октябре-ноябре), когда клещи впадают в спячку, а население все реже посещает лесопарковую зону. 

Для формирования иммунитета достаточно 2 прививок с интервалом в 1 мес. В дальнейшем для поддержания напряженности иммунитета необходимо прививаться раз в три года.

Противопоказаниями к вакцинации являются:

• Острые инфекционные и обострение хронических заболеваний – прививки проводят не ранее, чем через 3-4 недели после выздоровления;
• Тяжелые пищевые аллергические реакции (особенно на белок куриных яиц), лекарственные вещества,
• Онкологические заболевания, бронхиальная астма, системные заболевания соединительной ткани;
• Тяжелая реакция (повышение температуры выше 40 С, в месте введения вакцины – отек, гиперемия более 8 см в диаметре) или осложнение на предыдущую дозу вакцины;
• Беременность.

Вакцинироваться можно во всех поликлиниках объединения, в прививочных кабинетах. Прививочные кабинеты СПб ГБУЗ «Городская поликлиника №91» работают ежедневно по графику (кроме субботы и воскресенья). 

Врач эпидемиолог
Валиева Е.М.

Комментарии

Комментариев пока нет

ГБУЗ ЛО «Тихвинская МБ» — Клещевой энцефалит

Также вирус хорошо переносит низкую температуру (даже — 1750 С), при — 1500 С сохраняет жизнеспособность до года, а при — 600 С — неопределенно долго. Клещи, которые могут быть переносчиками энцефалита, живут на территории России повсеместно в лесных и лесостепных зонах. Год от года вспышки болезни отмечаются в различных регионах. Клещи в нашем регионе — переносчики нескольких заболеваний: клещевого энцефалита, боррелиоза (болезни Лайма), туляремии, эрлихиозов. Преобладающие в наших широтах «клещ таежный» и «клещ лесной» настолько коварны, что распределили свои атаки по месяцам. Например, клещ таежный возбуждается с начала мая и до середины июня, а затем ему на смену приходит лесной собрат, который будет сидеть в засаде до середины августа. Активность клещей носит цикличный характер, который повторяется примерно каждые три года.
Источники заражения
Как явствует из названия, чаще всего заражение происходит при укусе клеща, однако возможно заражение и при употреблении в пищу сырого молока или недостаточно прожаренного мяса больных животных.
Заболевшие клещевыми болезнями не заразны для окружающих.
Чем проявляется?
Клещевой энцефалит начинается внезапно, спустя 1-30 дней от укуса клеща, с озноба, быстрого повышения температуры тела до 38-39°С, сильной головной боли, боли во всем теле, разбитости, слабости, тошноты. Лицо и глаза больного краснеют. С 3-5 дня болезни появляются признаки поражения нервной системы: судороги, бред, нарушение движений.
Больной клещевым энцефалитом должен быть немедленно помещен в инфекционную больницу, где ему будет проведено интенсивное лечение.
Что делать?
Если клещ все-таки присосался, необходимо немедленно обратиться в ближайшее медицинское учреждение (инфекционное отделение, приемное отделение стационара, поликлинику, ФАП), где Вам будет оказана медицинская помощь и даны необходимые рекомендации. Если нет возможности сразу обратиться в медицинское учреждение, необходимо самостоятельно аккуратно удалить присосавшегося клеща. Для этого обильно смажьте клеща растительным маслом или вазелином и через минуту, захватив пинцетом головку клеща (находится в глубине ранки), вытащите насекомое, аккуратно выкрутив против часовой стрелки.
Ранку обработайте йодом. Если часть клеща осталась в коже, обратитесь к врачу, так как клещ должен быть удален полностью.
Удалённого клеща или его фрагменты необходимо сохранить (поместить в герметично закрывающуюся пробирку (флакон) с небольшим кусочком чуть влажной ваты) и направить в лабораторию с соблюдением требований «холодовой цепи».
Там клеща исследуют и определят, был ли он заразен. Чем раньше будет начато лечение энцефалита, тем больше шансов на благополучный исход.
Профилактика
В случае с клещевыми болезнями работает правило: легче предупредить, чем лечить. Отправляясь в лес, на дачу, на рыбалку, позаботьтесь о себе:

• Надевайте вещи с длинными рукавами, плотными манжетами, воротниками, брюки заправляйте в сапоги, обязательно захватите шапочку или косынку.
• Пользуйтесь отпугивающими клещей и других насекомых жидкостями, аэрозолями, мазями.
• Старайтесь держаться подальше от кустарников и высокой травы, так как именно там любят прятаться клещи.
• При возвращении их леса внимательно осмотрите свое тело, особенное внимание нужно уделить излюбленным местам присасывания клещей: границе волосистой части головы, естественным складкам кожи (подмышки, ягодицы).
• •Кроме обычных мер предосторожности от укусов клещей — закрытой одежды, осматривания себя после загородных прогулок, необходимо помнить, что не следует пить сырое козье молоко и есть термически не обработанные продукты из него (сыр, творог, сметану) — они могут быть заражены инфекцией.
• Не надо везти из леса цветы, в которых могут притаиться клещи. Необходимо тщательно осматривать своих домашних питомцев за городом и на даче — укусив их, клещи могут переползти на хозяев и детей, которые часто с ними играют.

Также рекомендуем использовать для отпугивания паразитов не репеллентные, а акарицидные средства — они наносятся только на одежду: брусок-карандаш «Претикс», «Пикник-антиклещ», «Рефтамид-таежный», «Фумитокс-антиклещ», «Торнадо-антиклещ», «Гардекс» и др.. При этом, при покупке средства обращайте внимание, чтобы на нем была надпись «от клещей», а не «от насекомых» — клещи к ним не относятся.
Если вы вынуждены длительное время находиться в лесу или живете в месте распространения энцефалитного клеща,  по виду деятельности или роду занятий связаны с пребыванием в природных стациях, лучше всего сделать прививку от клещевого энцефалита. Последняя прививка должна быть произведена не позднее, чем за 14 дней до начала сезона активности клещей.
Будьте  внимательны и осторожны!

Администрация ГБУЗ ЛО «Тихвинская МБ».
Врач-эпидемиолог Гринько А.А.

Генотипирование возбудителей клещевого энцефалита и лихорадки Кемерово в таежных клещах, собранных в Республике Коми | Карташов

1. Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Микрюкова Т.П., Кононова Ю.В., Чаусов Е.В., Локтев В.Б. Возбудители инфекционных заболеваний в организме таежного клеща на территории Республики Коми // Дезинфекционное дело. 2012. № 1. С. 52—55.

2. Глушакова Л.И., Корабельников И.В., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Микрюкова Т.П., Кононова Ю.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Карташов М.Ю., Чаусов Е.В., Локтев В.Б., Егорова Ю.И. Выявление возбудителей заболеваний в Ixodes persulcatus на территории Республики Коми // Сибирский медицинский журнал. 2012. T. 111, № 4. С. 88—91.

3. Микрюкова Т.П., Чаусов Е.В., Коновалова С.Н., Кононова Ю.В., Протопопова Е.В., Карташов М.Ю., Терновой В.А., Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Локтев В.Б. Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита в клещах Ixodes persulcatus в северо-восточном регионе Европейской части России // Паразитология. 2014. T. 48, № 2. С. 131—149.

4. Сафонова М.В., Дедков В.Г., Гмыль А.П., Карганова Г.Г., Сперанская А.С., Неверов А.Д., Федонин Г.Г., Валдохина А.В., Пимкина Е.В., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А. Изучение генетического разнообразия вируса Кемерово // Национальные приоритеты России. 2016. № 4 (22). C. 96—100.

5. Dai X., Shang G., Lu S., Yang J., Xu J. A new subtype of eastern tick-borne encephalitis virus discovered in Qinghai-Tibet Plateau, China. Emerg. Microbes Infect., 2018, vol. 74, no. 7. doi: 10.1038/s41426-018-0081-6

6. Dedkov V.G., Markelov M.L., Gridneva K.A., Bekova M.V., Gmyl A.P., Kozlovskaya L.I., Karganova G.G., Romanova L.Iu., Pogodina V.V., Yakimenko V.V., Shipulin G.A. Prevalence of Kemerovo virus in ixodid ticks from the Russian Federation. Ticks Tick-Borne Dis., 2014, vol. 5, no. 6, pp. 651—655. doi: 10.1016/j.ttbdis.2014.04.017

7. Dilcher M., Hasib L., Lechner M., Wieseke N., Middendorf M., Marz M., Koch A., Spiegel M., Dobler G., Hufert F.T., Weidmann M. Genetic characterization of Tribec virus and Kemerovo virus, two tick-transmitted human-pathogenic Orbiviruses. Virology, 2012, vol. 423, no. 1, pp. 68—76. doi: 10.1016/j.virol.2011.11.020

8. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-born encephalitis viruses from Europe and Asia. J. Gen. Virol., 1999, vol. 80 (Pt.1), pp. 179-185. doi: 10.1099/0022-1317-80-1-179

9. Grard G., Moureau G., Charrel R.N., Lemasson J.J., Gonzalez J.P., Gallian P., Gritsun T.S., Holmes E.C., Gould E.A., de Lam-ballerie X. Genetic characterization of tick-borne flaviviruses: new insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy. Virology, 2007, vol. 361, no. 1, pp. 80-92. doi: 10.1016/j.virol.2006.09.015

10. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-born encephalitis. Antiviral Res., 2003, vol. 57, no. 1-2, pp. 129-146. doi: 10.1016/S0166-3542(02)00206-1

11. Hubalek Z., Rudolf I. Tick-borne viruses in Europe. Parasitol. Res., 2012, vol. 111, no. 1,pp. 9-36. doi: 10.1()()7/s()()436-()12-291()-1

12. Kumar S., Stecher G., Tamura K. (2015) MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for Bigger Datasets. Mol. Biol. Evol, 2015, vol. 33, no. 7, pp. 1870-1874. doi: 10.1093/molbev/msw054

13. Major L., Linn M.L., Slade R.W., Schroder W.A., Hyatt A.D., Gardner J., Cowley J., Suhrbier A. Ticks associated with Macquarie island penguins carry arboviruses from four genera. PLoS One, 2009, vol. 4, no. 2. doi: 10.1371/journal.pone.0004375

14. Mikryukova T.P., Moskvitina N.S., Kononova Y.V., Korobitsyn I.G., Kartashov M.Y., Tyuten’kov O.Y., Protopopova E.V., Romanenko V.N., Chausov E.V., Gashkov S.I., Konovalova S.N., Moskvitin S.S., Tupota N.L., Sementsova A.O., Ternovoi V.A., Loktev V.B. Surveillance of tick-borne encephalitis virus in wild birds and ixodes ticks in Tomsk city and its suburbs (Western Siberia). Ticks and Tick-Borne Dis., 2014, vol. 5, no. 2, pp. 145—151. doi: 10.1016/j.ttbdis.2013.10.004

15. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., the UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics, 2012, vol. 28, no. 8, pp. 1166—1167. doi: 10.1093/bioinformatics/bts091

16. Tkachev S.E., Tikunov A.Y., Babkin I.V., Livanova N.N., Livanov S.G., Panov V.V., Yakimenko V.V., Tantsev A.K., Taranenko D.E., Tikunova N.V. Occurrence and genetic variability of Kemerovo virus in Ixodes ticks from different regions of Western Siberia, Russia and Kazakhstan. Infect. Genet. Evol, 2017, vol. 47, pp. 56—63. doi: 10.1016/j.meegid.2016.11.007

17. Tokarevich N.K., Tronin A.A., Blinova O.V., Buzinov R.V., Boltenkov V.P., Yurasova E.D., Nurse J. The impact of climate change on the expansion of Ixodes persulcatus habitat and the incidence of tick-borne encephalitis in the north of European Russia. Glob. Health Action, 2011, no. 4: 8448. doi: 10.3402/gha.v4i0.8448

18. Tokarevich N., Tronin A., Gnativ B., Revich B., Blinova O., Evengard B. Impact of air temperature variations on the ixodid ticks habitat and tick-borne encephalitis incidence in the Russian Arctic: the case of Komi Republic. Int. J. Circumpolar. Health, 2017, vol. 76, no. 1:1298882. doi: 10.1080/22423982.2017.1298882

Вирус клещевого энцефалита задерживает индукцию интерферона и скрывает свою двухцепочечную РНК во внутриклеточных мембранных везикулах

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) — один из самых распространенных арбовирусов в Европе и Азии. У людей он может вызывать тяжелый энцефалит с уровнем смертности до 30% и неврологическими последствиями у 30–60% выживших (19, 23, 35, 45). Естественный путь заражения — укус инфицированного клеща или употребление инфицированных молочных продуктов.В регионах Европы, где вирус TBEV является эндемическим, от 0,5 до 5% клещей переносят вирус, но в некоторых регионах России это число может достигать 40% (8, 19). ВКЭ принадлежит к семейству Flaviviridae из рода Flavivirus . Таксономически этот вид был недавно разделен на четыре типа вирусов, а именно: вирус Лупинга, западный ВКЭ, восточный ВКЭ и вирус энцефалита турецких овец (17). По неизвестным причинам симптомы заболевания зависят от штамма и варьируются от бессимптомной инфекции до тяжелого энцефалита и менингита (8).Несмотря на то, что существует эффективная вакцина против ВКЭ, число случаев заболевания растет и в настоящее время составляет около 10 000 в год (8, 67). Несмотря на огромное медицинское значение ВКЭ, многие аспекты инфекции и патогенеза остаются нерешенными, поэтому далеко. Например, взаимодействие ВКЭ с системой врожденного иммунитета, в частности с системой противовирусного интерферона I типа (IFN) (альфа / бета IFN [IFN-α / β]), недостаточно охарактеризовано, хотя TBEV служил модельной системой. в ранних пионерских исследованиях IFN (70).IFN синтезируются и секретируются инфицированными клетками и заставляют соседние клетки экспрессировать противовирусные факторы. Тканевые клетки распознают вирусную инфекцию преимущественно внутриклеточными путями (50). Молекулы вирусной сигнатуры, такие как двухцепочечная РНК (дцРНК) или РНК, несущие 5′-трифосфатную группу, выявляются рецепторами распознавания цитоплазматических патогенов (PRR) (55, 57, 80). Активированные PRR запускают сигнальную цепь, которая в конечном итоге приводит к фосфорилированию фактора транскрипции IFN-регуляторного фактора 3 (IRF-3) (24), члена семейства IRF, и фосфорилированный IRF-3 перемещается в ядро, где инициирует IFN. -β синтез мРНК.Секретируемые IFN связываются с рецептором, который присутствует практически во всех клетках-хозяевах, и активируют их. Передача сигналов IFN через так называемый путь JAK / STAT инициирует транскрипцию более 300 IFN-стимулированных генов (ISG), которые ингибируют размножение вирусов на уровне транскрипции, трансляции, репликации генома, сборки и выхода и стимулируют последующие адаптивные иммунные Для некоторых флавивирусов, включая вирус гепатита C (HCV), вирус Западного Нила (WNV) и вирус денге (DENV), известно, что устранение инфекции хозяином зависит от системы IFN (12 , 16, 34, 38, 62).Следовательно, эти вирусы экспрессируют генные продукты, которые препятствуют индукции, передаче сигналов или действию IFN, подобно тому, что известно для других вирусов (2, 11, 30, 51, 52, 58). Для ВКЭ, однако, неизвестны ни детали индукции IFN, ни потенциальные стратегии борьбы с IFN, за заметным исключением белка NS5, который ранее был идентифицирован как ингибитор IFN-зависимой передачи сигналов (3, 76). Здесь мы сравнили три разных западных штамма ВКЭ на предмет их способности индуцировать IFN.Мы наблюдали, что активация IRF-3 и индукция IFN-β не были полностью отменены, но существенно задерживались после заражения, и что индукция IFN различными штаммами была строго связана со степенью репликации вирусной РНК. Более того, мы не смогли идентифицировать конкретный продукт вирусного гена, который мог бы объяснить препятствие активации IRF-3. Скорее, вирусная дцРНК оказалась в значительной степени недоступной для цитоплазматического обнаружения, скорее всего, потому, что ВКЭ перестраивает компартменты внутриклеточной мембраны и реплицируется внутри них.Таким образом, TBEV, по-видимому, полагается на стратегию пассивного ускользания, чтобы избежать преждевременной индукции IFN.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы, клетки и вирусы.

Стрептолизин-O (SL-O), поли (I: C) и брефельдин A (BFA) были приобретены у Sigma. Микрокристаллическая целлюлоза Avicel RC / CL была приобретена в FMC BioPolymer. Клетки Simian Vero B4 и Vero E6, клетки карциномы легких человека (A549), клетки эмбриональных почек человека (293T), клетки почек детенышей хомячка (BHK-21) и эмбриональные фибробласты мыши (MEF) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM ) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS).Человеческие клетки 293T, трансгенные по гену люциферазы светлячка, управляемому промотором Mx1 (любезно предоставлены Джорджем Кохсом) (28), размножали в DMEM с добавлением 5% FCS и 0,5 мкМ G418. Штаммы ВКЭ (Neudörfl, Hypr и Absettarov) и клон 13 штамма вируса лихорадки Рифт-Валли размножали в клетках Vero B4 или Vero E6, соответственно, в условиях лаборатории биобезопасности 3 (BSL-3).

Плазмидные конструкции.

Репортерная плазмида люциферазы светлячка (FF-Luc) для мониторинга активации промотора IFN-β (p-125Luc) была любезно предоставлена ​​Такаши Фудзита, Институт вирусных исследований, Университет Киото, Киото, Япония (81).Контрольная плазмида pRL-SV40 (Promega) содержит ген люциферазы Renilla (Ren-Luc) под контролем конститутивного промотора вируса обезьяны 40 (SV40). Плазмиды экспрессии кДНК, кодирующие каждый компонент вирусного полипротеина, были сконструированы с использованием стандартных методов клонирования ПЦР. Полимераза KOD Hot Start (Novagen), рестрикционные ферменты и ДНК-лигаза Т4 (Fermentas) использовались в соответствии с рекомендациями производителей. кДНК из клеток, инфицированных TBEV Hypr (71), использовали в качестве матрицы, и продукты ПЦР, кодирующие различные белки-предшественники TBEV, клонировали в эукариотический вектор клонирования pI.18 (любезно предоставлено Джимом Робертсоном, Национальный институт биологических стандартов и контроля, Хартфордшир, Великобритания). Все плазмиды были секвенированы для обеспечения правильности, и последовательности олигонуклеотидных праймеров доступны по запросу.

Вирусная инфекция и трансфекция дцРНК.

Монослои клеток, выращенных в 12-луночных планшетах, инкубировали с вирусами в течение 1 ч при 37 ° C с использованием Opti-MEM (Invitrogen). Инокулят вируса удаляли, добавляли 1 мл DMEM-2% FCS и инкубацию продолжали при 37 ° C.Для трансфекции клеток дцРНК получали 5 мкг поли (I: C) с 5 мкл липосом Metafectene (Biontex) в 200 мкл Opti-MEM в соответствии с инструкциями производителей. После 15 мин инкубации смесь дцРНК-липосома по каплям наносили на клетки без изменения среды.

Экстракция РНК и ОТ-ПЦР в реальном времени.

Полную клеточную РНК экстрагировали в указанные моменты времени после инфицирования (p.i.) с использованием набора Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel) в соответствии с рекомендациями производителя.Аликвоты от 600 нг до 1 мкг РНК использовали для синтеза кДНК с помощью набора для обратной транскрипции (RT) Quantitect (Qiagen). Уровни мРНК человеческого γ-актина, IFN-β, ISG15, ISG56, интерферон-индуцируемого белка 10 (IP-10) и RANTES определялись с помощью проверенных праймеров QuantiTect (Qiagen) и набора QuantiTect SYBR green RT-PCR (Qiagen) с помощью прибора LightCycler 1.5 (Roche). Вирусные РНК были обнаружены с использованием ранее описанных зондов TaqMan для TBEV (65) и вируса лихорадки долины Рифт (5) и набора для ПЦР зондов QuantiFast (Qiagen).Сигналы индуцибельных клеточных мРНК или вирусных РНК были нормализованы по сигналу мРНК γ-актина.

Титрование вирусов.

Титры вирусов определяли с помощью фокусообразующего анализа (47). Клетки BHK-21 высевали в 96-луночные чашки и инфицировали 10-кратным серийным разведением TBEV или клона 13 в общем объеме 50 мкл Opti-MEM. Через 1 ч инокулят удаляли и добавляли 100 мкл верхнего слоя, содержащего 1,25% Avicel RC / CL, 1 × DMEM и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов (TBEV) или 24 часов (клон 13) перед фиксацией клеток 3% параформальдегидом, растворенным в фосфатно-солевом буфере (PBS).Клетки были проницаемы с помощью PBS, содержащего 0,5% тритона X-100 и 20 мМ глицина. Вирусные очаги были обнаружены с использованием первичных мышиных антител, направленных против белка Е TBEV (моноклональная антисыворотка 1493 [53]) или белка клона 13 N (поликлональная антисыворотка [20]), разведенных 1: 1000 и 1: 800, соответственно, в PBS с добавлением с 10% FCS и 0,05% Tween 80. Вторичные антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (Dako), разводили 1: 2000 в PBS с добавлением 10% FCS-0,05% Tween 80.Очаги антиген-положительных клеток выявляли с помощью субстрата пероксидазы TrueBlue (KPL, Gaithersburg, MD), как описано ранее (47).

IFN анализов.

Общее количество IFN в клеточных супернатантах измеряли с использованием клеток 293T, стабильно экспрессирующих ген люциферазы светлячка под контролем промотора Mx1 мыши (репортерные клетки Mx1-luc) (28). Клеточные супернатанты собирали и вирусные частицы удаляли с использованием спин-колонок Amicon с пределом отсечения 100 кДа (Millipore) в соответствии с инструкциями производителя.Отсутствие инфекционных вирусных частиц проверяли анализом бляшек. Репортерные клетки Mx1-luc высевали в 48-луночные чашки и через 24 часа обрабатывали отфильтрованными супернатантами, разведенными 1:10 в DMEM-5% FCS. Через 16 часов после инкубации клетки лизировали пассивным буфером для лизиса (Promega) и измеряли активность люциферазы с помощью люминометра Sirius (система обнаружения Бертольда). Чувствительность анализа составляла от 0,5 до 5 Ед / мл IFN-β и определялась по стандартной кривой. Для определения соотношения между внутриклеточным и внеклеточным IFN использовали иммуноферментный анализ (ELISA), специфичный для человеческого IFN-β (PBL). InterferonSource).Уровень внутриклеточного белка IFN-β измеряли в лизатах клеток, обработанных буфером, содержащим 0,5 M NaCl, 5 мМ EDTA, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,6) и 1% Triton X-100 (59), а также количество внеклеточного IFN-β определяли непосредственно в клеточных супернатантах.

Иммунофлуоресцентный анализ.

Клетки выращивали на покровных стеклах до 30-50% конфлюэнтности, инфицировали и инкубировали в течение указанного времени. Клетки фиксировали 3% параформальдегидом, повышали проницаемость 0,5% Triton X-100, растворенным в PBS, и трижды промывали PBS, содержащим 1% FCS.Первичные антитела разводили в PBS, содержащем 1% FCS. Белок Е ВКЭ детектировали с использованием мышиных моноклональных антител 1493, разведенных 1: 1000 (53), белок N клона 13 обнаруживали с помощью мышиных поликлональных антител, разведенных 1: 500 (20), и дцРНК выявляли с помощью мышиных моноклональных антител J2. (English & Scientific Consulting, Ширак, Венгрия) разбавить 1: 200. Кроличьи поликлональные антисыворотки использовали для обнаружения IRF-3 (BD ​​Biosciences Pharmingen) и тубулина (Abcam) в разведении 1: 200 и 1: 500 соответственно.Для чувствительного обнаружения дцРНК или IRF-3 сигнал флуорофора визуализировали с использованием системы амплификации тирамидного сигнала (TSA) -цианин 3 (Cy3) (Perkin-Elmer). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч покровные стекла трижды промывали PBS и затем обрабатывали вторичным антителом козы против Cy2 мыши, конъюгированным в разведении 1: 200. Клетки снова трижды промывали PBS и устанавливали с использованием раствора Fluorsave (Calbiochem). Окрашенные образцы клеток исследовали с помощью конфокального микроскопа Zeiss.

Проницаемость плазменной мембраны.

SL-O использовался для избирательной проницаемости плазматической мембраны (7, 9). Сначала клетки промывали буфером для пермеабилизации (125 мМ ацетат калия, 25 мМ HEPES [pH 7,2], 10 мМ глюкоза, 2,5 мМ ацетат магния, 10 мМ NaCl, 1,8 мМ CaCl ₂ и 5 мМ EGTA) и обрабатывали 1 ед. / Мл SL-O в буфере для проницаемости в течение 15 мин на льду. SL-O смывали буфером для пермеабилизации и клетки инкубировали при 37 ° C в течение 5 мин с предварительно нагретым буфером для пермеабилизации с последующей стадией дополнительной промывки PBS и фиксации 3% параформальдегидом, растворенным в PBS.Иммунодетекцию специфических антигенов проводили, как описано выше.

Анализ димеризации IRF-3.

Клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40, ингибиторы протеаз и ингибиторы фосфатазы; инкубируют на льду 10 мин; и затем центрифугировали при 4 ° C в течение 5 мин при 10,000 × g . Затем аликвоту 7 мкг белка разделяли электрофорезом в течение 2 ч при 60 мА в 7,5% неденатурирующем полиакриламидном геле с 1% дезоксихолатом в катодном буфере (26).Белки переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) (Amersham) с последующей инкубацией в буфере для насыщения (PBS, содержащий 5% обезжиренного сухого молока и 0,05% твин). Мембраны инкубировали в течение ночи с поликлональным антителом FL-425 против IRF-3 (Santa Cruz Biotechnology), разведенным 1: 1000 в буфере для насыщения, а затем трижды промывали 0,05% PBS-Tween с последующей инкубацией с вторичным антителом, конъюгированным с HRP. После трех дополнительных стадий промывки детектирование проводили с использованием набора для хемилюминесценции SuperSignal West Femto (Pierce).

Вестерн-блоттинг.

Клетки лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации (50 мМ Трис [pH 7,4], 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,25% дезоксихолат натрия, 0,05% SDS), содержащем ингибиторы протеазы (полный ингибитор протеазы; Roche) и ингибиторы фосфатазы. (Коктейль с ингибиторами фосфатазы II; Calbiochem). Всего 10 мкг белка отделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембрану Immobilon-P (Millipore) с последующей инкубацией в буфере для насыщения (PBS, содержащий 5% обезжиренного сухого молока и 0.05% Твин). Мембрану сначала инкубировали в течение 1 ч с первичными антителами и трижды промывали 0,05% PBS-Tween с последующей инкубацией с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Pierce). После дополнительных трех стадий промывки детектирование проводили с использованием набора SuperSignal West Femto (Pierce). Используемые первичные антитела были направлены против фосфорилированного eIF2α (альфа-субъединица эукариотического фактора инициации 2) (кроличьи поликлональные анти-Ser51, разведенные 1: 200; Biosource), eIF2α (мышиные моноклональные, разведенные 1: 1000; Cell Signaling), TBEV E (мышиные моноклональный, разведенный 1: 5000) и актин (кроличий поликлональный антиактин, разведенный 1: 5000; Sigma).

Переходные трансфекции и анализы репортерных генов.

Субконфлюэнтные монослои клеток 293T, выращенных в 12-луночных чашках, трансфицировали 0,25 мкг репортерной плазмиды p125-luc (ген FF-Luc под контролем промотора IFN-β), 0,025 мкг контрольной плазмиды pRL-SV40 (Ren-Luc ген под контролем промотора SV40) и 0,5 мкг экспрессионной плазмиды с нанофектином (PAA) в соответствии с рекомендациями производителя. Через 24 часа после трансфекции клетки инфицировали клоном 13 при множественности инфицирования (MOI) 5.Через 16 ч p.i. клетки собирали и лизировали в 100 мкл буфера для пассивного лизиса (Promega). Аликвоту лизата в 10 мкл использовали для измерения активности FF-Luc и Ren-Luc, как описано производителем набора для двойного люциферазного анализа (Promega), и активность измеряли с помощью люминометра Sirius (система обнаружения Бертольда).

ЭМ.

клеток 293T высевали на чашки диаметром 10 см и инфицировали штаммом Hypr TBEV (MOI 5). Клетки либо не обрабатывали, либо обрабатывали BFA (2.8 нг / мл) через 12 ч. Через 24 часа после инъекции клетки обрабатывали модифицированным фиксатором Ито (2,5% формальдегида, 0,1% глутаральдегида, 0,03% тринитрофенола и 0,03% CaCl ₂ в 0,05 М какодилатном буфере [pH 7,2]) (54) в течение 1 часа при комнатной температуре. температуры, промывали 0,1 М какодилатным буфером, соскребали, гранулировали (10 мин при 10,000 × г ) и выдерживали при 4 ° C до дальнейшей обработки. Осадки параллельных клеток обрабатывали либо для обычной просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ), либо для иммуно-ЭМ. Для трансмиссии ЭМ к гранулам добавляли 1% OsO ₄ в 0.1 M какодилатный буфер в течение 1 ч при комнатной температуре, окрашенный en bloc 2% водным уранилацетатом (20 мин при 60 ° C), обезвоженный в этаноле с последующим добавлением пропиленоксида и залитый в Poly / Bed 812 (Polysciences). Ультратонкие срезы вырезали на ультрамикротоме Reichert-Leica Ultracut S, помещали на непокрытые медные сетки и окрашивали цитратом свинца. Для иммуно-ЭМ осадки клеток окрашивали en bloc 2% водным уранилацетатом (20 мин при 60 ° C), обезвоживали 75% этанолом и заливали в смолу LR White (Electron Microscopy Sciences [EMS], Hatfield, PA).Ультратонкие срезы были вырезаны на том же ультрамикротоме и помещены на сетки, покрытые никелем Formvar-углеродом. Сетки инкубировали сначала с каплями блокирующего буфера (0,1% BSA и 0,01 M глицин в 0,05 M трис-буферном физиологическом растворе [TBS]), а затем с антителом против дцРНК J2 (0,5 мг / мл), растворенным в соотношении 1:10 в буфере для разведения. (1% BSA в 0,05 M TBS) сначала в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4 ° C. После промывки в блокирующем буфере сетки инкубировали с вторичным антителом (козий антимышиный IgG / IgM, конъюгированный с 10-нм коллоидным золотом) (Aurion, каталожный номер 25169; EMS), разведенный 1:20 в буфере для разведения, в течение 1 ч при комнатной температуре. температура.После промывки сначала в блокирующем буфере, затем в TBS, а затем в дистиллированной воде сетки фиксировали в 2% водном растворе глутаральдегида, промывали, окрашивали 2% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и исследовали с помощью электроники Philips 201 или CM-100. микроскоп на 60 кВ.

ОБСУЖДЕНИЕ

ВКЭ вызывает эпидемии острого энцефалита в лесных районах Европы и Азии. Болезнь имеет характерное двухфазное течение: сначала неспецифическая гриппоподобная фаза продолжительностью примерно 5 дней, затем 7-дневный период очевидного выздоровления и вторая, специфическая фаза, часто сопровождающаяся тяжелыми неврологическими симптомами (35).Предполагается, что причиной энцефалита является CD8 ⁺ Т-клеточная иммунопатология, а также чрезмерная воспалительная реакция и прямое повреждение вирусом (22, 60). Однако только около 20-30% инфекций вступают во вторую фазу и приводят к полномасштабному заболеванию (35, 45). Для вируса Лангата, связанного с ВКЭ, а также для других энцефалитических флавивирусов известно, что предварительная обработка клеток с IFN типа I могут препятствовать размножению вируса (3, 34). Таким образом, ожидалось, что ВКЭ нарушает активацию системы IFN, т.е.например, индукция IFN для эффективного распространения в организме хозяина. Наши результаты показывают, что ВКЭ не полностью блокирует индукцию транскрипции промотора IFN-β, но значительно замедляет ее. Отсроченное начало транскрипции IFN приводит к позднему синтезу биологически активных IFN. ИФН не измерялся в супернатантах клеток, инфицированных ВКЭ, даже при сроке до 24 ч p.i. Измеримая продукция IFN инфицированными клетками происходила между 24 часами p.i. и 48 часов в день, когда уже были продуцированы большие количества инфекционных частиц ВКЭ.Таким образом, TBEV, по-видимому, использует стратегию «побега», чтобы избежать противовирусного воздействия системы IFN. Это согласуется с ранее опубликованными данными для WNV, где было показано, что начало ответа IFN происходит на поздней стадии инфекции (15). Более того, для вируса гриппа A in vivo ранее было продемонстрировано, что ускоренное размножение вируса является вирусной стратегией, позволяющей превзойти ответ IFN (18). Наши попытки идентифицировать конкретный белок TBEV, ответственный за задержку индукции IFN, не увенчались успехом.Аналогичным образом для WNV ранее было показано, что инфицированные клетки могут нормально активировать IRF-3 в ответ на суперинфекцию вируса Сендай, что также является аргументом против наличия активного механизма ингибирования индукции цитоплазматического IFN этим флавивирусом (15). Однако необходимо добавить, что WNV способен ингибировать индукцию IFN эктопической дцРНК, скорее всего потому, что вирусный ген NS1 ингибирует Toll-подобный рецептор 3, IFN-активирующую PRR, которая распознает дцРНК во внеклеточной фазе (64, 79). .Кроме того, ранее было показано, что белок NS2A KUNV, который является вариантом WNV, непосредственно подавляет индукцию IFN (36, 37). Однако в отношении ВКЭ ни NS1, ни NS2A, ни NS2B не оказывали очевидного ингибирующего действия на индукцию IFN. Хотя мы не можем исключить существование антагониста IFN, который ускользнул от нашего внимания, наш вывод о том, что никакая вирусная дцРНК не может быть иммунодетектирована за пределами внутренних мембран, подтверждает модель, согласно которой ВКЭ полагается на сокрытие своей дцРНК в мембранных компартментах. Следовательно, для внутриклеточных PRR доступ к этому важному маркеру патогена ограничен.Важно, что большинство, если не все вирусы с геномом РНК с положительной цепью, такие как TBEV, перестраивают цитоплазматические мембраны для формирования вирусных фабрик (1, 10, 39, 48). Более того, известно, что эти вирусы продуцируют значительные количества дцРНК в течение своего жизненного цикла (32, 49, 56, 68, 74, 78). Для некоторых вирусов ранее было показано, что вирусная дцРНК действительно изолирована внутри индуцированных вирусом мембранных структур (32, 39, 75). Тем не менее, многие из них экспрессируют специфические факторы, ингибирующие индукцию IFN (57, 69, 73).Возможные объяснения этого несоответствия заключаются в том, что эти вирусы уязвимы для обнаружения PRR на ранней стадии инфекции, когда реорганизация мембраны еще не завершена, или что везикулы могут разрываться. КЭЭ также, по-видимому, обнажает определенные количества биологически активной дцРНК на поздних этапах инфицирования. В этом контексте следует отметить, что одной молекулы дцРНК достаточно, чтобы вызвать ответ IFN при определенных условиях (46), и что, по крайней мере, для коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) была обнаружена дцРНК вне компартментов вирусной мембраны ( 32).Коронавирус SARS экспрессирует набор антагонистов индукции IFN (69), которые вместе полностью блокируют активацию IRF-3 в инфицированных клетках (66). TBEV, который частично активирует IRF-3, может опережать индукцию IFN за счет быстрой репликации. Возможно, что скорость репликации также играет роль в ускользании IFN для других вирусов, помимо вируса TBEV, WNV и вируса гриппа A (11, 18, 30). Количественные измерения динамики индукции IFN (транскрипция и высвобождение IFN) и размножения вируса, как мы провели для TBEV, могут помочь лучше понять кинетический аспект ускользания IFN этими вирусами.Используя различные штаммы TBEV, мы наблюдали, что слабая индукция IFN TBEV была прямо пропорциональна уровню накопленной вирусной РНК. Этот результат согласуется с данными предыдущего исследования WNV, которое показало, что индукция IFN зависит от репликации генома (6). Более того, индукция IFN TBEV сильно зависит от IRF-3 и IPS-1. Более того, ВКЭ активирует фосфорилирование eIF2α, другого сигнального пути, запускаемого вирусной дцРНК. Таким образом, возможно, что, по крайней мере, на поздних стадиях инфицирования, некоторые вирусные молекулы активируют цитоплазматические PRR.Остается решить, является ли дцРНК, которую мы обнаружили в больших количествах в инфицированных клетках, единственной вирусной молекулой, запускающей индукцию IFN, или 5′-трифосфорилированная РНК, например вирусный антигеном, также играет роль. Кроме того, вклад отдельных цитоплазматических PRR и Toll-подобных рецепторов в индукцию IFN с помощью TBEV будет предметом будущих исследований. TBEV эффективно перестраивает внутренние цитоплазматические мембраны, чтобы они содержали фабрики репликации вируса. Перестройки мембран ER и образование фабрик репликации были впервые описаны для KUNV (78).Ранее сообщалось, что небольшие пакеты везикул (VP) внутри производных от ER компартментов содержат вирусные белки NS1, NS2A, NS3, NS4A и дцРНК (41-43, 78). Ультраструктура VP также была изучена для DENV, и VP был идентифицирован как сайт репликации РНК. Эти везикулы содержали небольшую пору в направлении цитоплазмы, где метаболиты и РНК могли обмениваться с цитоплазмой (75). Для TBEV (данное исследование) и KUNV (44) было показано, что разрушение мембранных компартментов с помощью BFA через 12 ч.я. не препятствовали размножению вируса. Однако лечение сделало KUNV чувствительным к противовирусному действию IFN-индуцированного белка MxA (25), что предполагает определенное воздействие. Для TBEV мы наблюдали, что BFA не изменяет недоступность дцРНК для клеточного распознавания и что уровень индукции вирусного IFN не повышается (данные не показаны). Это открытие указывает на то, что мембранные компартменты, индуцированные ВКЭ, надежно защищают комплексы репликации вируса.

Мы обнаружили, что в 24-часовой момент инфицирования уровни транскриптов IFN были сопоставимы между TBEV и клоном 13 вируса-индуктора, но уровни высвобожденного IFN были разными.Только в результате импульсного эксперимента по измерению IFN было получено de novo между 24 и 48 часами p.i. выявили, что клетки способны секретировать одинаковое количество IFN в обоих случаях. Анализ динамики времени показал, что клетки, инфицированные ВКЭ, отставали от контрольного индуктора, поскольку конечные уровни мРНК IFN-β были достигнуты с задержкой, по меньшей мере, 8 часов. Если бы мы измеряли только мРНК и вирусные титры в супернатантах через 24 часа p.i., было бы получено неверное впечатление о блокаде секреции IFN, вызванном TBEV.Это демонстрирует, что в случае таких наблюдений строгий количественный и кинетический анализ являются обязательными, прежде чем можно будет сделать выводы. В целом, наши количественные анализы динамики размножения вирусов, уровней мРНК IFN-β и синтеза белка IFN показывают, что мРНК IFN-β должны синтезироваться в течение длительного периода времени до тех пор, пока обнаруживаемые уровни IFN не будут высвобождены инфицированными клетками. Нам не известно, что эти зависимости были ранее исследованы до такой степени.

Таким образом, мы предлагаем кинетическую модель ускользания IFN TBEV.Вирус перестраивает внутренние клеточные мембраны, чтобы обеспечить место для своей дцРНК, недоступное для PRR. Это задерживает начало индукции IFN в достаточной степени, чтобы дать возможность продуцированию частиц потомства. Клетки начинают секретировать IFN только спустя 24 часа после заражения. Однако к этому моменту вторичные инфекции окружающих клеток уже произошли. Хорошо задокументированная способность TBEV блокировать передачу сигналов JAK / STAT (3, 76) гарантирует, что IFN на поздней стадии неспособен развивать свою противовирусную активность.Эта комбинация задержки индукции IFN и блока передачи сигналов IFN может позволить вирусу проникнуть в центральную нервную систему до того, как будет запущен эффективный противовирусный ответ.

Обнаружение и характеристика вируса клещевого энцефалита в странах Балтии и Восточной Польше

Abstract

Клещей собирали с растительности в странах Балтии, Эстонии, Латвии, Литве и восточной Польше и анализировали на наличие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) путем амплификации частичных генов E и NS3.В Эстонии мы обнаружили статистически значимые различия в распространенности ВКЭ между клещами I. persulcatus и I. ricinus (4,23% и 0,42% соответственно). В Латвии разница в распространенности ВКЭ между двумя видами не была статистически значимой (1,02% для I. persulcatus и 1,51% для I. ricinus , соответственно). В Литве и Польше ВКЭ был обнаружен у 0,24% и 0,11% из клещей I. ricinus соответственно. Генетическая характеристика частичных последовательностей E и NS3 показала, что штаммы ВКЭ принадлежат к европейскому подтипу во всех странах, а также к сибирскому подтипу в Эстонии.Мы также обнаружили, что в районах, где ареалы двух видов клещей перекрываются, подтипы ВКЭ могут быть обнаружены не только у их естественного переносчика, но и у симпатрических видов клещей.

Образец цитирования: Катаргина О., Русакова С., Геллер Дж., Кондрусик М., Зайковская Дж., Зыгутене М. и др. (2013) Выявление и характеристика вируса клещевого энцефалита в странах Балтии и Восточной Польше. PLoS ONE 8 (5): e61374. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061374

Редактор: Ульрике Гертруд Мундерлох, Университет Миннесоты, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 13 ноября 2012 г .; Принята к печати: 7 марта 2013 г .; Опубликован: 1 мая 2013 г.

Авторские права: © 2013 Katargina et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Европейского Союза Goce-2003-010284 EDEN, Эстонским научным фондом (грант ETF 8691), Министерством образования и науки Эстонии (проект SF0940033s09) и Европейским фондом регионального развития ( Эстонский исследовательский совет, программа TerVE, проект ZoonRisk 3.2.1002.11-0002). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никакие конкурирующие интересы не уходят.

Введение

Клещевой энцефалит (КЭ) — одна из наиболее серьезных инфекций центральной нервной системы человека. Вирус клещевого энцефалита вызывает потенциально смертельные инфекции центральной нервной системы, о которых ежегодно регистрируются тысячи случаев в Центральной и Восточной Европе и России.В течение 1990–2009 гг. В среднем регистрировалось около 8500 случаев заболевания людей в год, из которых 2800 ежегодно в Европе [1]. Страны Балтии считаются эндемичным районом КЭ с одним из самых высоких показателей заболеваемости в Европе. Возбудителем заболевания является вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), принадлежащий к роду Flavivirus в семействе Flaviviridae . ВКЭ представляет собой оболочечный вирус с одной молекулой РНК с положительной цепью размером примерно 11 т.п.н., содержащей одну открытую рамку считывания (ORF), которая кодирует 10 белков [2].

Для выживания клещей необходимы два разных типа хозяев: клещи, которые действуют как переносчики вируса и резервуарные хозяева, и позвоночные, которые действуют как резервуар и источник крови для кормления клещей и поддерживают передачу вируса клещей путем совместного кормления инфицированных. и незараженные клещи на одном и том же хозяине [3]. Два вида клещей, I. ricinus (клещ клещевины) и I. persulcatus (таежный клещ), являются основными переносчиками ВКЭ и относятся к семейству твердых клещей ( Ixodidae ).В целом европейский подтип ВКЭ переносится клещами Ixodes ricinus , в то время как сибирский и дальневосточный подтипы переносятся клещами Ixodes persulcatus [4], [5], [6]. Жизненный цикл клеща варьируется от двух до шести лет и включает четыре стадии развития: яйцо, личинка, нимфа и взрослая особь. Все клещи питаются только один раз на каждой стадии, и продолжительность жизни клеща зависит от временных интервалов между успешными кормлениями, а также климатических условий [7]. Для клещей Ixodes описано множество животных-хозяев с более чем 300 различными видами диких и домашних млекопитающих, птиц и рептилий.Географическое распространение I. ricinus включает районы Европы и части Северной Африки [4], [7], I. persulcatus имеет широкий ареал в Евразии из стран Балтии, Эстонии, Латвии и Финляндии на западе. в северную Японию на востоке [1], [5], [8].

Генетически TBEV подразделяется на три линии: европейский (TBEV-Eur, западный), дальневосточный (TBEV-FE) и сибирский (TBEV-Sib) подтипы, соответственно. Недавние исследования показали, что подтипы TBEV-Sib и TBEV-FE филогенетически более тесно связаны друг с другом, чем с подтипом TBEV-Eur [9].Распределение подтипов ВКЭ соответствует диапазонам их клещевых векторов. Таким образом, подтип TBEV-Eur широко распространен в Европе, включая штаммы, изолированные в Австрии, Швейцарии, Швеции, Германии, Словении, Чехии, Венгрии, Финляндии, Эстонии, Латвии, Литве, Беларуси и европейской части России [5], [10]. Штаммы TBEV-FE и TBEV-Sib были обнаружены от Японии и Дальнего Востока России до стран Балтии и Северной Европы, Латвии, Эстонии и Финляндии [6], [10], [11], [12].

Предыдущие исследования показали, что все три подтипа TBEV присутствуют в Эстонии и Латвии [10], [13], в то время как только подтип TBEV-Eur был обнаружен в Литве и Польше [11], [14].Ареалы двух видов переносчиков ВКЭ, I. ricinus и I. persulcatus , перекрываются в восточных частях Эстонии и Латвии ([15], неопубликованные данные Головлева), в то время как только I. ricinus был обнаружен как Вектор ВКЭ в Литве и восточной части Польши. Еще один вид клещей Dermacentor reticulatus , который не признан эффективным переносчиком вируса клещевого энцефалита, также присутствует в тех же районах Литвы и Польши.

Цели настоящего исследования заключались в сравнении распространенности и распределения клещей, ведущих поиск клещей, собранных в странах Балтии и восточной части Польши, и характеризации местных штаммов вируса клещевого энцефалита путем секвенирования участков частичных генов E и NS3.

Материалы и методы

Взятие клещей

клещей было собрано на 7 участках материковой части Эстонии (Лаэва 26,446 ° в.д., 58,434 ^o северной широты; Ярвселья 27,305 ° в.д., 58,255 ° северной широты; Андинеме 25,458 ° в.д., 59,495 ° северной широты; Оонурме 26,983 ° в.д., 59,100 ° северной широты; Килинги). -Нымме 24,880 ° E, 58,164 ° N; Пухту 23,551 ° E, 58,560 ° N; 24,539 ° E, 58,524 ° N) на Сааремаа (28,451 ° E, 58,249 ° N) и островах Муху (23,238 ° E, 58,592 ° N ), на шести участках в Восточной Польше (Якубин 23,180 ° в.д., 53,117 ° с.ш .; Беловежа 23,850 ° в.д., 54.700 ° с. Даспуда: 22,950 ° в. Д., 54,100 ° с. Стависки 21,933 ° в. Д., 52,417 ° с. Руда: 22,517 ° в. Д., 54,033 ° с. Зерчице, 22,867 ° в. Д., 52,434 ° с. Ш.), На семи участках в Латвии (Краслава, 27,138 ° в. Д., 56,007 ° с. Ш .; Мадона, 26,486 ° в. Д., 56,793 ° с. Ш .; Елгава, 23,804 ° в. N; Салдус 22,818 ° E, 56,648 ° N; Рига 23,790 ° E, 56,833 ° N; Лиепая 21,161 ° E, 56,689 ° N) и четыре в Литве (Утена 25,517 ° E, 55,600 ° N; Радвилишкис 23,617 ° E, 55,750 ° N; Клайпеда 21.083 ° E, 55.750 ° N; Кедайняй 23.983 ° E, 55.300 ° N) (рис.1). Участки были выбраны в известных эндемичных по КЭ регионах и в зоне перехода двух видов клещей в Эстонии и Латвии.

Рисунок 1. Места сбора клещей, минимальный уровень заражения (MIR) показан в процентах.

Ареал симпатрии для видов клещей I. persulcatus и I. ricinus штрихован по неопубликованным данным Карелиса [15] и Головлевой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061374.g001

Взрослых и нимфальных клещей собирали с растительности ежемесячно с апреля по ноябрь в течение 2006–2009 гг. На каждом участке были установлены четыре линейных трансекта длиной 100 м, которые обозначены фланелевой тканью длиной 1 м ² .Ткани осматривали через каждые 5 м, всех клещей удаляли щипцами и поддерживали живыми до последующей идентификации.

Вид, стадия развития и пол взрослых клещей были идентифицированы морфологически с помощью стереомикроскопа. Собранные клещи исследовали индивидуально или объединяли в группы по 5 или 10 взрослых особей и 5 или 20 нимф, промывали стерильным PBS и хранили при -70 ° C до приготовления. Клещей промывали 70% этанолом и дважды промывали стерильным PBS, гомогенизировали в 400 мкл PBS и хранили при -70 ° C.Двести микролитров суспензии использовали для экстракции РНК.

Экстракция РНК

РНК

экстрагировали из 200 мкл суспензии клещей методом гуанидиния тиоцианат-фенол-хлороформ с использованием реагента для выделения РНК TriPure (Roche Diagnostics, Lewes, UK) в соответствии с инструкциями производителя. РНК ресуспендировали в 30 мкл воды и хранили при -70 ° C.

Обнаружение TBEV

Образцы

были проверены на наличие специфической РНК TBEV с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров: F-TBE1 и R-TBE1, а также зонда TBE-WT, как описано Швайгером и Кассинотти [16] (Таблица 1).РНК TBEV амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл каждого образца РНК, 12,5 мкл 2X Reaction Mix, 0,5 мкл SuperScript III Platinum One-Step Taq Mix (Invitrogen, США), 300 нМ прямого праймера, 900 мкл. нМ обратный и 250 нМ зонда TBE-WT. Условия цикла включали 30 минут обратной транскрипции при 42 ° C, денатурацию в течение 10 минут при 94 ° C, затем 45 циклов по 15 секунд при 95 ° C и 1 минуту при 60 ° C. Система 7500 Fast Real Time PCR (Applied Biosystems) использовалась для реакций PCR и флуоресцентных детекций.

образцов, положительных с помощью ПЦР в реальном времени, были использованы для одноэтапной ОТ-ПЦР и для вложенной ПЦР для будущего секвенирования частичного гена белка E с внешними праймерами: 283F1 и 827R1 и с внутренними праймерами: 349F2 и 814R2, а также для гена NS3. с внешними праймерами NS3 F1 и NS3 R1 и внутренними праймерами NS3 F2 и NS3 R2 (таблица 1). RT-PCR амплификацию проводили в общем реакционном объеме 25 мкл, который содержал следующую смесь реагентов: 2x реакционная смесь (Invitrogen, Carlsbad USA), 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров, 1 мкл SuperScript® III RT / Platinum® Taq Mix (Invitrogen, Carlsbad USA) и 5 ​​мкл целевой РНК.Условия цикла включали синтез кДНК 30 минут при 50 ° C, денатурацию в течение 2 минут при 94 ° C, затем 40 циклов по 20 секунд при 94 ° C, 1 минуту при 60 ° C для гена E и 55 ° C для гена NS3. , и 1 мин при 68 ° C с последующим увеличением на 68 ° C в течение 5 мин.

Вложенные ПЦР-амплификации выполняли в общем объеме 50 мкл следующим образом: GeneAmp 10xPCR буфер II, MgCl ₂ (1,5 мМ для гена E, 5 мМ для гена NS3) 600 мкМ для амплификации гена E, 800 мкМ для NS3 ген dNTP, 0,5 мМ прямого и обратного праймеров, ДНК-полимераза AmpliTaq (2.5U) (Applied Biosystems, Roche, Branchburg, NJ) и 5 ​​мкл целевой ДНК из первой реакции ПЦР. Условиями циклов были начальная денатурация в течение 2 мин при 94 ° C, затем 30 циклов в течение 1 мин при 94 ° C, 1 мин при 65 ° C для гена E и 55 ° C для гена NS3 и 1 мин при 72 ° C с последующим удлинением при 72 ° C в течение 10 мин.

Продукты вложенной ПЦР очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR (QIAGEN, Hilden, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Терминатор BigDye v3.Набор для циклического секвенирования (Applied Biosystems, Forest City, CA, USA) использовали для реакции секвенирования ДНК в соответствии с рекомендациями производителя с последующим секвенированием на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Полученные последовательности редактировали с помощью программы BioEdit (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

Подтверждение вида клещей

Обнаружение морфологических видов было дополнительно подтверждено с помощью ПЦР и секвенирования митохондриальной 16S РНК Ixodes [17].

ПЦР-амплификацию проводили в общем реакционном объеме 50 мкл, который содержал GeneAmp 10xPCR буфер II, MgCl ₂ (1,5 мМ), 600 мкМ dNTP, 200 нМ прямого и обратного праймеров, ДНК-полимеразу AmpliTaq (5U) ( Applied Biosystems, Roche, Branchburg, NJ) и 5 ​​мкл целевой ДНК. Условия цикла состояли из 2 циклов программы приземления, состоящей из 1 мин денатурации 94 ° C, 1 мин при снижении температуры отжига с 49 ° C до 47 ° C в каждом цикле и шага удлинения 2 мин при 72 ° C. с последующими 40 циклами: этап денатурирования продолжительностью 30 секунд при 94 ° C, этап отжига в течение 1 минуты при 45 ° C и этап удлинения в течение 2 минут при 72 ° C с последующим удлинением при 72 ° C в течение 10 минут. мин.

Филогенетический анализ

Последовательности

были извлечены из базы данных GenBank и выровнены вручную с помощью программы BioEdit [18]. Модель максимального правдоподобия была использована для реконструкции филогенетического дерева с использованием пакета Tree Puzzle версии 5.2 [19], а 25 000 загадочных шагов со значениями поддержки Quartet Puzzling (QP)> 70% были применены с использованием модели Hasegawa-Kishino-Yano (HKY). замены [20]. Соотношение переход / трансверсия и частоты нуклеотидов оценивали на основе набора данных.Номера доступа GenBank последовательностей, используемых в филогенетическом анализе, приведены в таблице S1.

Статистический анализ

Собранные клещи были проанализированы индивидуально, а также в пулах разного размера, и распространенность ВКЭ у клещей была рассчитана как минимальный уровень инфицирования (MIR) с предположением, что только один клещ в каждом пуле был положительным.

MIR был проанализирован в соответствии с местом отбора проб и видами клещей, и был рассчитан 95% биномиальный доверительный интервал с поправкой на непрерывность [21].Различия между группами рассчитывались по таблице сопряженности с точным критерием Фишера 2 × 2 [22].

Результаты

Сбор клещей и распространенность клещей-поисковиков

Эстония.

Всего было проанализировано 3287 клещей из разных частей Эстонии. Из них 2341 были идентифицированы как I. ricinus (1295 взрослых клещей и 1046 нимф) и 946 как I. persulcatus (588 взрослых клещей и 358 нимф). I. ricinus На всей территории Эстонии собрано клещей, а I.persulcatus клещей обнаружены только в восточной и юго-восточной частях (Лаэва, Ярвселья, Оонурме и Килинги-Нымме). Восточная Эстония является ареалом симпатрического распространения обоих видов клещей: I. persulcatus преобладают на 78%, 87% и 93% в Лаэва, Оонурме и Ярвселья, соответственно. Хотя стоянка Килинги-Нымме также находится в симпатрической зоне, доля собранных клещей I. persulcatus составила всего 1,5%.

Все собранные клещи были протестированы на наличие ВКЭ с помощью ПЦР в реальном времени, и 51 клещ из Эстонии из 3287 был признан положительным с общим MIR, равным 1.55% (таблица 2). Присутствие ВКЭ было обнаружено на всех проанализированных участках и колебалось от 0,2% в Пухту до 4,13% в Оонурме (Таблица 2). клещей I. persulcatus продемонстрировали статистически значимую разницу в распространенности ВКЭ по сравнению с I. ricinus : 4,23% (40/946) против 0,46% (11/2341) (P <0,0001) соответственно. Однако распространенность ВКЭ среди взрослых клещей и нимфальных клещей внутри каждого вида не выявила существенных различий (0,46% и 0,48% для I. ricinus и 4.60% и 3,63% для I. persulcatus соответственно).

В районах, симпатичных к двум видам клещей, мы обнаружили, что клещей I.ricinus продемонстрировали статистически более высокий уровень распространенности ВКЭ (2,22% в Лаэва и 3,13% в Ярвселье), чем в Западной Эстонии, где уровень распространенности колебался от 0,20 до 0,99. % (Таблица 2).

Латвия.

Из 4099 проанализированных клещей, собранных в Латвии, 3812 были идентифицированы как I. ricinus (1456 взрослых клещей и 2356 нимф) и 287 как I.perculcatus (170 взрослых клещей и 117 нимф). I. persulcatus клещей собрано только на двух из семи участков (Краслава и Мадона). Доля I. persulcatus в Краславе была низкой, так как были собраны только единичные клещи (9 из 436). На втором участке (Мадона) 65,4% (278 из 425) клещей были идентифицированы как I. persulcatus .

В целом, МИР ВКЭ у проанализированных клещей из Латвии был аналогичен таковому в Эстонии — 1,07% (44/4099).ВКЭ был обнаружен в шести местах из семи, а распространенность варьировала от 0,22% в Лиепае до 3,09% в Елгаве (Таблица 2). Однако, в отличие от показателей распространенности в Эстонии, клещей I. persulcatus в Латвии не показали каких-либо статистически значимых различий по сравнению с I. ricinus с коэффициентами 1,74% (5/287) и 1,02% (39/3812). , соответственно. Однако количество собранных и проанализированных клещей I. persulcatus было более чем в 13 раз ниже, чем у I.ricinus . Мы обнаружили статистически значимые различия (P <0,0001) распространенности ВКЭ между взрослыми особями и нимфами I. ricinus , составляющие 2,06% (30/1456) и 0,38% (9/2356), соответственно, хотя такие различия не могли быть продемонстрированы. для клещей I. persulcatus (табл. 2).

Литва.

Всего было собрано и проанализировано 1990 клещей I. ricinus из Литвы, в том числе 920 взрослых особей и 1070 нимф. Присутствие ВКЭ было обнаружено только на двух участках из четырех с общим MIR 0.30%, от 0,18% (Utenos) до 1,07% (Radviliskio). Уровень инфицирования ВКЭ среди взрослых и нимф не показал статистических различий (0,32% и 0,28% соответственно).

Польша.

В Польше было собрано и проанализировано 7270 клещей I. ricinus (3605 взрослых особей и 3665 нимф). Помимо I. ricinus, 600 взрослых особей D. reticulatus и клещей были проанализированы на наличие ВКЭ. Положительные клещи были обнаружены на пяти из шести участков с общим MIR 0.21% у клещей I. ricinus и колеблется от 0,01% (Ruda) до 0,42% (Jakubin) (таблица 2). Показатели инфицирования у взрослых и в нимфальной стадии оказались схожими (0,17% и 0,25% соответственно).

РНК

TBEV была обнаружена у двух из 600 D. reticulatus взрослых клещей с общим MIR 0,33%.

Генетический анализ последовательностей ВКЭ

В настоящем исследовании 31 образец клещей, собранный в Эстонии, пять образцов из Латвии, 2 из Литвы и восемь из Польши, были амплифицированы и секвенированы на частичные гены E и / или NS3.Всего было проанализировано 36 образцов для обеих генетических областей, и десять образцов были секвенированы либо в частичном гликопротеине E, либо в генах NS3. Последовательности TBEV были амплифицированы из I. persulcatus и I. ricinus из Эстонии и Латвии, из I. ricinus из Литвы и из I. ricinus и D. reticulatus из Польши.

В эстонских образцах 28 последовательностей были идентифицированы как подтип TBEV-Sib, 25 из которых были обнаружены в I.persulcatus и, неожиданно, три в I. ricinus (Est1039, Est3512-1 и Est3974), тогда как подтип TBEV-Eu был подтвержден в трех образцах, амплифицированных из I. ricinus .

Две последовательности, принадлежащие к подтипу TBEV-Sib из I. ricinus (Est1039, Est3512-1), были амплифицированы из клещей, собранных в районах, где преобладают клещи I. persulcatus , в то время как одна последовательность (Est3974-1) произошла от Участок Андинеме, где было собрано только I. ricinus , и расположенный в 300 км от I.persulcatus диапазон.

Последовательности эстонского подтипа TBEV-Sib, амплифицированные в настоящем исследовании, были либо идентичны друг другу, либо имели высокую степень сходства (до 99,2%) для частичных генов гликопротеина E и NS3.

На филогенетических деревьях, основанных на частичных генах NS3 и E, эстонские образцы подтипа TBEV-Sib сгруппировались вместе со штаммами, выделенными из I. persulcatus в Финляндии и Карелии (рис. 2), и продемонстрировали 96,1–99,6% и 95.Степень сходства генов NS3 и E составляет 5–99,7% соответственно. Частичные гены гликопротеина E трех других штаммов, принадлежащих к подтипу TBEV-Sib и выделенных из I. ricinus , депонированы в GenBank: штамм Волхов-2-43 (FJ214148), выделенный в 1943 году в Волхове (около 500 км). удаленности от места обнаружения эстонских штаммов), штамм Вологда-509-75 (FJ214142), выделенный в европейской части России в 1975 г. (примерно 800 км от Эстонии), и штамм Семекс (AF224665), выделенный в Житомирской области на Украине ( ок.900 км от Эстонии). Сравнение частичного нуклеотидного сходства гена E штаммов Волхов-2-43 и Вологда-509-75 с последовательностями эстонского TBEV-Sib, также амплифицированными из I. ricinus (Est3512-1, Est3974-1), показало такой же уровень. нуклеотидной замены, обнаруженной в балтийской подлинии подтипа TBEV-Sib. Штамм Семекс был менее связан со штаммами, изолированными в Эстонии и европейской части России, и сгруппировался вместе со штаммами, изолированными в Сибири. Нуклеотидное сходство между балтийской и сибирской подлинией подтипа TBEV-Sib составляет 92.2–95,8% и 92,6–95,0% для частичных генов NS3 и E соответственно.

Рисунок 2. Филогенетическое дерево (максимальная вероятность), основанное на последовательностях частичного короткого гена E (367 п.н.) (A) и на последовательностях, кодирующих белок NS3 (631 п.о.) (B) TBEV.

Последовательности, обнаруженные в настоящем исследовании, выделены жирным шрифтом. Показаны только поддерживаемые значения, превышающие 70%. Регистрационные номера последовательностей GenBank приведены в таблице S1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061374.g002

Три последовательности для частичных генов E и NS3 (из штаммов Est1149, Est1530 и Est2270), принадлежащих подтипу TBEV-Eur, были амплифицированы от клещей I. ricinus : две от клещей, собранных в I. ricinus allopatric ареал (Est1530, Est2270) и один (Est1149), собранный в районе смешанного ареала из видов Ixodes , где преобладали штаммы подтипа TBEV-Sib. Удивительно, но частичные последовательности гликопротеина E и NS3 этого штамма были более близки к штаммам, выделенным в Корее 98.На 9–99,7% и 99,6–99,8%, соответственно, чем у штаммов, циркулирующих в Эстонии или других частях Европы, со сходством нуклеотидных последовательностей 96,7–99,1% и 96,5–98,4% соответственно. На филогенетическом дереве, основанном на частичных последовательностях гена E-гликопротеина, корейские и эстонские штаммы сгруппировались вместе и сформировали линию с высоким поддерживающим значением QP (рис. 2).

Два других эстонских образца, полученных из I. ricinus (Est1530, Est2270), были случайным образом распределены внутри подтипа TBEV-Eur на филогенетических деревьях на основе частичных генов гликопротеина E и NS3 и продемонстрировали 97.0–99,1% и 96,8–99,3%, сходство, соответственно, с другими европейскими штаммами.

На латвийском участке Мадона, где диапазоны I. ricinus и I. persulcatus перекрываются, TBEV был обнаружен у I. persulcatus (Lat1643) и неожиданно идентифицирован как подтип TBEV-Eur путем секвенирования частичного гликопротеина E и Гены NS3. На участке Елгава, где обнаружено только I. ricinus , четыре идентичные последовательности (Lat103, Lat104, Lat184, Lat185), принадлежащие подтипу TBEV-Eur, были обнаружены путем амплификации обеих генетических областей.

В соседней Литве присутствует только клещей I. ricinus , и были амплифицированы две идентичные последовательности (Lith229, Lith230) частичного гликопротеина E и генов NS3, принадлежащих подтипу TBEV-Eur.

На польском сайте Jakubin последовательности TBEV частичного гликопротеина E и генов NS3, принадлежащих к подтипу TBEV-Eur, были обнаружены у I. ricinus (J49, J99, J103), а также у D. reticulatus (D49 , D60) клещей. В двух других сайтах последовательности Zerczyce (Si218) и Bialowieza (B249, B273) подтипа TBEV-Eu были амплифицированы только из I.рицинус.

На филогенетических деревьях, основанных на частичных генах гликопротеинов NS3 и E, последовательности подтипа TBEV-Eur, полученные от латвийских, литовских и польских клещей, не показали географической кластеризации внутри подтипа TBEV-Eur, но продемонстрировали высокий уровень нуклеотидного сходства ( 97,2–99,8% и 96,0–99,7% для неполных генов гликопротеина E и NS3 соответственно).

ПЦР-определение видов клещей путем секвенирования митохондриального гена 16S рРНК

В районах, где простирается I.ricinus и I. persulcatus перекрываются, морфологическая идентификация видов Ixodes была подтверждена амплификацией и последующим секвенированием частичного гена митохондриальной 16S рРНК (339 п.н.). Результаты подтвердили, что все виды клещей были правильно идентифицированы морфологическим методом.

Обсуждение

В настоящем исследовании оценивалась распространенность РНК ВКЭ у квестовых клещей, собранных с растительности в трех странах Балтии и Польше.Сообщенный общий уровень инфицирования клещами-поисковиками в Эстонии (1,55%) и Латвии (1,07%) был статистически выше (P <0,0001), чем у I. ricinus в Литве (0,30%) и Польше (0,21%). В восточных районах Эстонии и Латвии ареал I. ricinus перекрывается с I. persulcatus, , и настоящее исследование показало, что клещей I. persulcatus чаще заражаются ВКЭ (4,23% в Эстонии и 1,74%). в Латвии), чем клещей I. ricinus (0.46% в Эстонии и 1,02% в Латвии). В Латвии разница была менее заметной, так как количество собранных клещей I. persulcatus было относительно высоким только на одном латвийском участке (Мадона). Более того, I. ricinus имел более высокие показатели распространенности ВКЭ в районах, симпатичных к I. persulcatus , чем в районах, где распространено только I. ricinus . Эти различия в показателях распространенности ВКЭ могут отражать более благоприятные условия для циркуляции ВКЭ в Восточной Эстонии, где ареалы двух видов клещей частично совпадают.Согласно другим исследованиям, распространенность ВКЭ у I. на s ulcatus клещей варьировала от 1,0 до 4% в Западной Сибири [23] до 6% в Финляндии [12]. В Латвии ранее сообщавшаяся частота инфицирования ВКЭ для I. на с ulcatus составляла 5% [24].

В настоящем исследовании уровень заражения клещей I. ricinus варьировал от 0,21% в Польше до 1,17% в Латвии. В других европейских странах общие зарегистрированные уровни распространенности ВКЭ составляют I.ricinus составляли 0,5–2,0% в Баварии [25], 0,2–1% в Финляндии [26] и 0,47% в Словении [27]. Уровни инфицирования 0,1–1,7% и аналогичные тем, которые представлены в настоящем исследовании, ранее были зарегистрированы в Литве [28], в то время как более высокие показатели распространенности 2,4–3,7% и 1,6% были зарегистрированы в Латвии и Польше соответственно [14]. , [24]. Однако различия в показателях распространенности ВКЭ в разных странах можно объяснить разными методами обнаружения вируса у клещей, а также колебаниями распространенности ВКЭ в сезоны и годы сбора.

В настоящем исследовании мы обнаружили, что штаммы подтипов TBEV-Sib и TBEV-Eur могут обмениваться между симпатрическими видами клещей в одном районе. В Эстонии мы обнаружили штаммы подтипа TBEV-Sib не только у I. persulcatus, , как показано в предыдущих исследованиях [13], [29], но и у I. ricinus . Хотя I. ricinus считается основным вектором подтипа TBEV-Eur в Европе, обнаружение TBEV-Sib у I. ricinus было зарегистрировано в европейской части России [30].Ретроспективное исследование штамма Волхов-2-43, выделенного из I. ricinus в 1943 г. в Ленинградской области, показало, что он принадлежит к подтипу ВКЭ-Sib и на сегодняшний день является старейшим изолированным штаммом ВКЭ-Sib [30], [31]. Хотя этот штамм был выделен почти 70 лет назад, он показал такой же уровень нуклеотидного сходства гена частичного гликопротеина E с другими штаммами балтийской линии в пределах подтипа TBEV-Sib, выделенного из I. persulcatus , а также из I.ricinus . Эстонские последовательности подтипа TBEV-Sib, амплифицированные из I. ricinus , также были близки или идентичны по нуклеотидным и аминокислотным уровням другим штаммам эстонского TBEV-Sib, выделенным из I. persulcatus .

Недавнее исследование гемагглютинирующих дефицитных штаммов TBEV-Sib из европейской части России выявило три уникальные аминокислотные замены в гликопротеине E, которые увеличивают суммарный заряд и гидрофобность поверхности вириона [32].Было высказано предположение, что повышение гидрофобности является адаптацией штаммов I. persulcatus TBEV к новому вектору, то есть I. ricinus [32]. Однако частичное выравнивание аминокислотных последовательностей E-гликопротеина эстонских последовательностей TBEV-Sib, амплифицированных из I. ricinus , было идентично последовательностям из I. persulcatus в той же области и не показало никаких аминокислотных замен. На филогенетических деревьях, основанных на частичных генах гликопротеина E и NS3, штаммы TBEV-Sib из I.ricinus также не сформировали свои собственные линии, что можно рассматривать как свидетельство адаптации к новому вектору, а скорее случайным образом сгруппировались в рамках балтийской сублинии.

Мы предполагаем, что штаммы подтипа TBEV-Sib могут инфицировать личинок I. ricinus во время совместного кормления с нимфами I. persulcatus на млекопитающих, и что обнаружение TBEV-Sib в сотнях километров от I. persulcatus ареал (образец Est3974-1) может быть результатом переноса клещей птицами или млекопитающими с востока на запад в Эстонии.В Эстонии была продемонстрирована роль перелетных птиц в распространении личинок, инфицированных ВКЭ, из районов размножения в Эстонии, Финляндии и на северо-западе России по пути к местам зимовки в Центральной и Южной Африке [33].

В настоящем исследовании мы также обнаружили другой вид обмена с участием подтипа ВКЭ и клещевого вектора: присутствие подтипа TBEV-Eur у клещей I. persulcatus в зоне совместного циркуляции двух видов клещей в Латвии. Подобные находки были ранее зарегистрированы в Латвии [24], а недавно в Финляндии, в 200 км к северу от I.ricinus в ареале, где распространен только I. persulcatus [12]. Более того, идентичные или близкородственные штаммы TBEV-Eur были выделены от рыжих полевок ( Myodes glareolus ) в том же районе Финляндии, что указывает на создание нового очага TBEV-Eur без его природного вектора клещей I. ricinus, а исторические данные позволили авторам оценить возраст этого очага в 50 лет [12]. Подобные необычные очаги TBEV-Eur были зарегистрированы в Южной Корее, прибл.7000 км от европейского ареала обращения подтипа TBEV-Eur. Штаммы TBEV-Eur были обнаружены у Haemophysalis longicornis , H. flava и Ixodes nipponensis , а также у диких грызунов [34], [35], [36], [37]. Как и когда штаммы подтипа TBEV-Eur были введены в Южную Корею, остается неясным, но штаммы TBEV, относящиеся к подтипу TBEV-Eur, были обнаружены путем молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в I. persulcatus , грызунах и людях на Востоке и в США. Западная Сибирь, а также на Урале [30].Другой пример необычного образования очагов ВКЭ-СЭ был зарегистрирован в Крыму, примерно в 3000 км от известного ареала распространения ВКЭ-СЭ [5], [38]. Было высказано предположение, что перемещение кабанов ( Sus scrofa ) в 1957 г. на самолете с Дальнего Востока России и акклиматизация животных в Крыму могут объяснить внедрение штаммов TBEV-FE в новые очаги [38], [39]. Такое быстрое перемещение животных вместе с прикрепленными клещами I. persulcatus , вероятно, инфицированными ВКЭ, может привести к проникновению вируса в местный I.ricinus , в которой вирус сохранялся до настоящего времени.

Хотя TBEV-Sib и TBEV-Eur чаще обнаруживаются у неприродных клещевых векторов, I. ricinus или I. persulcatus , соответственно, штаммы TBEV-Sib и TBEV-Eur все еще имеют ограниченный диапазон. циркуляции, и нет видимого движения в западно-восточном направлении и обмена видами клещей.

Обнаружение и изоляция ВКЭ у клещей Dermacentor не редкость; в природных очагах вирус обнаружен у D.reticulatus и D. marginatus [38], [40]. Недавно более высокая распространенность ВКЭ у D. reticulatus по сравнению с I. ricinus была обнаружена в Польше [14] в районе, симпатичном обоим видам клещей. Личинки D. reticulatus (или других видов клещей) могут быть инфицированы местными штаммами ВКЭ, циркулирующими в том же районе, во время совместного кормления с нимфами I. ricinus или I. persulcatus на тех же млекопитающих, что было продемонстрировано в Удмуртии. [41].Сохранение ВКЭ D. reticulatus в природных очагах в отсутствие клещей Ixodes весьма сомнительно [42], но этот вид может поддерживать циркуляцию ВКЭ в популяциях I. ricinus .

В заключение, в этом исследовании мы сообщили о распространенности ВКЭ среди ищущих клещей в странах Балтии, и мы обнаружили, что штаммы ВКЭ-Sib и TBEV-Eur могут быть обнаружены не только в естественных переносчиках клещей, но и в симпатрических клещах. разновидность. Хотя значение этих результатов в настоящее время неясно, дальнейшие исследования могут прояснить, имеет ли место распространение ВКЭ от естественного переносчика клещей на сосуществующие виды клещей в том же районе или начало адаптации вируса к вирусу. новые виды клещей и в результате переезда в новые географические районы.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: IG OK MK JZ MZ AB. Проведены эксперименты: IG OK SR JG MK JZ MZ AB JT. Проанализированы данные: IG OK JG MK JZ MZ AB. Внесенные реактивы / материалы / инструменты анализа: IG MK JZ MZ AB. Написал статью: IG OK SR MK JZ MZ AB.

Ссылки

1. 1. Suss J (2011) Клещевой энцефалит 2010: эпидемиология, зоны риска и штаммы вирусов в Европе и Азии — обзор. Клещи Tick Borne Dis 2: 2–15.
2. 2. Рис C (1996) Flaviviridae: вирусы и их репликация. В: Filds B, Knipe, DM, et al., Редактор. Области вирусологии. 3-е изд. Филадельфия: Raven Publishers.
3. 3. Лабуда М., Даниелова В., Джонс Л.Д., Наттолл П.А. (1993) Усиление инфицирования вирусом клещевого энцефалита во время совместного кормления клещей. Med Vet Entomol 7: 339–342.
4. 4. Линдквист Л., Вапалахти О. (2008) Клещевой энцефалит. Ланцет 371: 1861–1871.
5. 5.Ecker M, Allison SL, Meixner T, Heinz FX (1999) Анализ последовательности и генетическая классификация вирусов клещевого энцефалита из Европы и Азии. J Gen Virol 80 (Pt 1): 179–185.
6. 6. Мавчутко В., Вен С., Хаглунд М., Форсгрен М., Дукс А. и др. (2000) Характеристика вируса клещевого энцефалита из Латвии. J Med Virol 60: 216–222.
7. 7. Сусс Дж. (2003) Эпидемиология и экология клещевого энцефалита, имеющие отношение к производству эффективных вакцин.Вакцина 21 Дополнение 1S19–35.
8. 8. Коренберг Е.И. (1999) [Взаимосвязь возбудителей трансмиссивных болезней иксодовых клещей (Ixodidae) со смешанной инфекцией]. Паразитология 33: 273–289.
9. 9. Grard G, Moureau G, Charrel RN, Lemasson JJ, Gonzalez JP, et al. (2007) Генетическая характеристика клещевых флавивирусов: новый взгляд на эволюцию, патогенетические детерминанты и таксономию. Вирусология 361: 80–92.
10. 10. Лундквист А., Вен С., Головлева И., Мавчутко В., Форсгрен М. и др.(2001) Характеристика вируса клещевого энцефалита из Латвии: данные о совместной циркуляции трех различных подтипов. J Med Virol 65: 730–735.
11. 11. Мицкене А., Вен С., Головлева И., Лайсконис А., Линдквист Л. и др. (2001) Вирус клещевого энцефалита в Литве. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 20: 886–888.
12. 12. Яаскелайнен А.Е., Тонтери Е., Сиронен Т., Пакаринен Л., Вахери А. и др. (2011) Вирус клещевого энцефалита европейского подтипа у клещей Ixodes persulcatus.Emerg Infect Dis 17: 323–325.
13. 13. Головлева И., Вен С., Сьоландер К.Б., Василенко В., Плюснин А. и др. (2004) Характеристика вируса клещевого энцефалита из Эстонии. J Med Virol 74: 580–588.
14. 14. Войчик-Фатла А., Цисак Э., Заяц В., Зволински Дж., Дуткевич Дж. (2011) Распространенность вируса клещевого энцефалита у клещей Ixodes ricinus и Dermacentor reticulatus, собранных в районе Люблина (восточная Польша). Клещи Tick Borne Dis 2: 16–19.
15. 15.Карелис Г., Борман А., Логина И., Лученко И., Суна Н. и др. (2012) Клещевой энцефалит в Латвии 1973-2009: эпидемиология, клинические особенности и последствия. Eur J Neurol 19: 62–68.
16. 16. Schwaiger M, Cassinotti P (2003) Разработка количественного анализа RT-PCR в реальном времени с внутренним контролем для лабораторного обнаружения РНК вируса клещевого энцефалита (TBEV). Дж. Клин Вирол 27: 136–145.
17. 17. Caporale DA, Rich SM, Spielman A, Telford SR 3rd, Kocher TD (1995) Различение клещей Ixodes с помощью последовательностей митохондриальной ДНК.Mol Phylogenet Evol 4: 361–365.
18. 18. Hall TA (1999) BioEdit: удобный редактор для выравнивания биологических последовательностей и программа анализа для Windows 95/98 / NT: Nucleic Acids Symposium. 95–98 с.
19. 19. Schmidt HA, Strimmer K, Vingron M, von Haeseler A (2002) TREE-PUZZLE: филогенетический анализ максимального правдоподобия с использованием квартетов и параллельных вычислений. Биоинформатика 18: 502–504.
20. 20. Hasegawa M, Kishino H, Yano T (1985) Датирование расщепления человека и обезьяны по молекулярным часам митохондриальной ДНК.J Mol Evol 22: 160–174.
21. 21. Уилсон Е.Б. (1927) Вероятный вывод, закон преемственности и статистический вывод. Журнал Американской статистической ассоциации 22: 209–212.
22. 22. Фишер Р.А. (1922) Об интерпретации χ2 из таблиц непредвиденных обстоятельств и расчетах П. Журнал Королевского статистического общества. 85: 87–94.
23. 23. Dobler G, Zöller G, Poponnikova T, Gniel G, Pfeffer M, et al. (2008) Вирус клещевого энцефалита в высокоэндемичной зоне в Кемерово (Западная Сибирь, Россия).Int J Med Microbiol 298: 94–101.
24. 24. Сусс Дж., Шредер С., Абель У., Борман А., Дукс А. и др. (2002) Характеристика очагов клещевого энцефалита (КЭ) в Германии и Латвии (1997–2000). Int J Med Microbiol 291 Suppl 3334–42.
25. 25. Сусс Дж., Клаус С., Диллер Р., Шредер С., Воханка Н. и др. (2006) Заболеваемость клещевым энцефалитом в сравнении с распространенностью вируса и повышенной распространенностью вируса клещевого энцефалита у Ixodes ricinus, удаленных от людей. Int J Med Microbiol 296 Suppl 4063–68.
26. 26. Хан X, Ахо М., Вен С., Пельтомаа М., Вахери А. и др. (2001) Распространенность вируса клещевого энцефалита среди клещей Ixodes ricinus в Финляндии. J Med Virol 64: 21–28.
27. 27. Дурмиси Э., Кнап Н., Саксида А., Трилар Т., Ду Д. и др. (2011) Распространенность и молекулярная характеристика вируса клещевого энцефалита у клещей Ixodes ricinus, собранных в Словении. Переносимые переносчиками зоонозы Dis 11: 659–664.
28. 28. Хан X, Juceviciene A, Uzcategui NY, Brummer-Korvenkontio H, Zygutiene M, et al.(2005) Молекулярная эпидемиология вируса клещевого энцефалита у клещей Ixodes ricinus в Литве. J Med Virol 77: 249–256.
29. 29. Головлева И., Катаргина О., Геллер Дж., Талло Т., Митценков В. и др .. (2008) Уникальная сигнатурная аминокислотная замена в штаммах вируса клещевого энцефалита Балтийского моря (ВКЭ) в пределах сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита. Int J Med Microbiol.
30. 30. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М., Козлова И.В., Ткачев С.Е. и др. (2010) Генотипирование и характеристика географического распределения вариантов вируса клещевого энцефалита с помощью набора молекулярных зондов.J Med Virol 82: 965–976.
31. 31. Погодина В.В. (2005) Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60 лет. Вопр Вирусол 50: 7–13.
32. 32. Хаснатинов М.А., Устаникова К., Фролова Т.В., Погодина В.В., Бочкова Н.Г. и др. (2009) Негемагглютинирующие флавивирусы: молекулярные механизмы появления новых штаммов через адаптацию к европейским клещам. PLoS One 4: e7295.
33. 33. Геллер Дж., Назарова Л., Катаргина О., Лейвиц А., Ярвекюльг Л. и др.. (2012) Клещевые патогены у клещей, питающихся перелетными воробьинообразными в западной части Эстонии. принято к публикации в журнале «Переносимые переносчиками и зоонозами».
34. 34. Ким СИ, Юн С.М., Хан М.Г., Ли И.Ю., Ли Нью-Йорк и др. (2008) Выделение вирусов клещевого энцефалита от диких грызунов, Южная Корея. Переносимые переносчиками зоонозы Dis 8: 7–13.
35. 35. Ким СИ, Чон Й.Е., Юн С.М., Ли И.Ю., Хан М.Г. и др. (2009) Молекулярные доказательства вируса клещевого энцефалита у клещей в Южной Корее.Мед Вет Энтомол 23: 15–20.
36. 36. Ко С., Кан Дж. Г., Ким С. И., Ким Х. С., Кляйн Т. А. и др. (2010) Распространенность вируса клещевого энцефалита у клещей из южной Кореи. J Vet Sci 11: 197–203.
37. 37. Юн С.М., Ким SY, Хан М.Г., Чжон Й.Е., Ён Т.С. и др. (2009) Анализ гена белка оболочки (E) вирусов клещевого энцефалита, выделенных в Южной Корее. Переносимые переносчиками зоонозы Dis 9: 287–293.
38. 38. Евстафьев И.Л. (2001) Результаты 20-летнего изучения клещевого энцефалита в Крыму.Ж. Микробиол, эпидемиол, иммунобиол: 111–114.
39. 39. Алексеев А.Н. (1993) Возможная причина восстановления активности очага клещевого энцефалита на Крымском полуострове. Ж. Микробиол, эпидемиол, иммунобиол: 113–116.
40. 40. Kozuch O, Labuda M, Lysy J, Weismann P, Krippel E (1990) Продольное исследование природных очагов вируса центрально-европейского энцефалита в Западной Словакии. Acta Virol 34: 537–544.
41. 41. Кисленко Г.С., Коротков Ю.С., Шмаков Л.В. (1987) Луговый клещ Dermacentor reticulatus в природных очагах клещевого энцефалита в Удмуртии.Паразитология 21: 730–735.
42. 42. Randolph S (1999) Эпидемиологическое использование популяционной модели клеща Rhipicephalus appendiculatus. Trop Med Int Health 4: A34–42.
43. 43. Скарпаас Т., Головлева И., Вене С., Льостад Ю., Сюрсен Х. и др. (2006) Вирус клещевого энцефалита, Норвегия и Дания. Emerg Infect Dis 12: 1136–1138.

Неструктурный белок NS5 вируса клещевого энцефалита вызывает экспрессию RANTES в зависимости от РНК-зависимой РНК-полимеразной активности

Abstract

Вирус клещевого энцефалита (TBEV) — один из флавивирусов, поражающих ЦНС и вызывающих энцефалит у людей.Механизм ВКЭ, вызывающего разрушение ЦНС, остается неясным. Сообщалось, что RANTES-опосредованная миграция моноцитов крови и Т-лимфоцитов человека специфически индуцируется в головном мозге мышей, инфицированных TBEV, что вызывает последующее нейровоспаление и может способствовать разрушению мозга. Однако вирусные компоненты, ответственные за индукцию RANTES, и лежащие в основе механизмы еще предстоит полностью изучить. В этом исследовании мы демонстрируем, что NS5, но не другие вирусные белки ВКЭ, индуцирует продукцию RANTES в клеточных линиях глиобластомы человека и первичных астроцитах.TBEV NS5, по-видимому, активирует сигнальный путь регуляторного фактора 3 IFN (IRF-3) способом, зависящим от RIG-I / MDA5, что приводит к ядерной транслокации IRF-3 для связывания с промотором RANTES. Дальнейшие исследования показывают, что активность РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), но не РНК-кэп-метилтрансферазы, является критической для вызванной TBEV NS5 экспрессии RANTES, и это, вероятно, связано с RdRP-опосредованным синтезом дцРНК. Дополнительные данные показывают, что остатки K359, D361 и D664 TBEV NS5 являются критическими для активности RdRP и индукции RANTES.Следует отметить, что NS5 из других флавивирусов, включая вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, вирус Зика и вирус денге, также могут индуцировать экспрессию RANTES, что свидетельствует о значении индуцированной NS5 экспрессии RANTES в патогенезе флавивирусов. Наши результаты обеспечивают основу для дальнейшего понимания того, как флавивирусы вызывают нейровоспаление, и являются потенциальной вирусной мишенью для вмешательства.

Введение

Флавивирусы включают более 53 различных вирусов, таких как вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), вирус японского энцефалита (ЯЭ), вирус Зика (ZIKV), вирус денге (DENV), вирус Западного Нила (WNV). ) и вирус желтой лихорадки (1).Большинство флавивирусов переносятся членистоногими и вызывают проблемы общественного здравоохранения во всем мире (2). TBEV имеет три серотипа: европейский подтип (TBEV-Eu), сибирский подтип (TBEV-Sib) и наиболее вирулентный, дальневосточный подтип (TBEV-FE) (3). Ixodes ricinus и Ixodes persulcatus являются векторами TBEV-Eu и двух других подтипов соответственно (4). ВКЭ — одна из наиболее частых причин инфекций ЦНС в Европе, особенно в эндемичных районах Центральной Европы (5). Заболевание проявляется в виде асептического менингита (50%), менингоэнцефалита (40%) или менингоэнцефаломиелита (10%) (6).Геном ВКЭ состоит из оцРНК длиной 11 т.п.н., кодирующей один полипротеин из 3414 аминокислот, который расщепляется вирусными и клеточными протеазами на три структурных (C, prM и E) и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B). , NS3, NS4A, NS4B и NS5) (7). Флавивирус NS5 обладает активностями РНК-кэп-метилтрансферазы (МТаза) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), связанной с его N-концевым и С-концевым участками, соответственно (8-10). RdRP отвечает за репликацию вирусной РНК через механизм инициации de novo независимым от праймеров способом (11).

Хотя основным путем заражения является укус инфицированного клеща, задокументировано также алиментарное заражение через употребление зараженных ВКЭ молочных продуктов (12). После попадания в организм различными путями первая репликация ВКЭ обычно происходит в дендритных клетках кожи после укусов клещей, затем в регионарных лимфатических узлах, а затем вирус может быть обнаружен в плазме (13, 14). На стадии активной виремии вирус может пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и проникнуть в ЦНС, где вызывает глубокое разрушение нервных клеток (15).Было предложено несколько потенциальных механизмов того, как ВКЭ вызывает дисфункцию ЦНС: 1) прямое инфицирование эпителиальных клеток и перенос вирусов через базолатеральные мембраны, 2) опосредованное цитокинами разрушение ГЭБ или 3) «троянский конь». путь, по которому лейкоциты, инфицированные ВКЭ, могут мигрировать через ГЭБ (14, 16, 17). В общем, невропатия в ЦНС является следствием вирусной инфекции соответствующих клеток и возникающих в результате нейровоспалительных реакций. Наиболее тяжелые формы КЭ могут характеризоваться серьезным повреждением нейронов в различных частях ЦНС (18).Однако точные механизмы, лежащие в основе иммуноопосредованного повреждения нейронов, остаются неясными.

Хемокины представляют собой семейство небольших секретируемых белков, которые организуют миграцию лейкоцитов к участкам воспаления, играя решающую роль в регуляции гомеостаза путем доставки специфических клеток в физиологических условиях (19, 20). Β-хемокин RANTES (CCL5) индуцирует миграцию лейкоцитов, моноцитов крови человека и Т-лимфоцитов за счет связывания с хемокиновыми рецепторами CCR1, CCR3 и CCR5 (21), и его много в спинномозговой жидкости пациентов с КЭ (22).Сообщалось, что CCR5 (в частности, аллель CCR5Delta32) связан с тяжестью заболевания, вызванного ВКЭ, что позволяет предположить, что дифференциальная регуляция RANTES может иметь клиническое значение (23). Кроме того, антагонизм RANTES в ЦНС увеличивает выживаемость мышей и снижает накопление инфильтрирующих клеток в головном мозге после инфицирования ВКЭ (24). Известно, что перепроизводство хемокинов в ответ на иммунологические, воспалительные и инфекционные сигналы может вызывать пагубные эффекты, особенно в в основном не самообновляющихся тканях мозга (25).Все это указывает на то, что RANTES, вероятно, играет важную роль в дисфункции нервных клеток, вызванной ВКЭ. Наше недавнее исследование предполагает, что инфекция ВКЭ может активировать RANTES посредством сигнального пути регуляторного фактора 3 IFN (IRF-3) (24). Однако, как TBEV напрямую индуцирует экспрессию RANTES в нервных клетках, еще предстоит выяснить. В частности, вирусные компоненты ВКЭ, ответственные за индукцию RANTES, и лежащие в основе механизмы остаются неуловимыми.

В текущем исследовании мы исследовали молекулярный механизм экспрессии RANTES, индуцированной TBEV.Сначала мы определили неструктурный белок NS5 как вирусный компонент, ответственный за индукцию RANTES в клеточных линиях глиобластомы человека и первичных астроцитах, а также рассмотрели, как TBEV NS5 способствует экспрессии RANTES, а также ключевой области и остаткам NS5, участвующим в этом процессе.

Материалы и методы

Клеточные линии, вирусы и плазмиды

Клеточная линия глиобластомы человека T98G (ATCC CRL-1690; American Type Culture Collection) культивировалась в MEM (41500-034; Life Technologies) с добавлением 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ .Клеточная линия глиобластомы человека U251, HEK 293T, Vero и линия клеток эпителия шейки матки человека HeLa культивировали в DMEM (11965; Life Technologies) с добавлением тех же компонентов, что и в MEM. Клетки-предшественники нейронов человека были получены из ткани мозга плода человека и охарактеризованы, как описано ранее (26). Для дифференцировки астроцитов среду роста заменяли средой для дифференцировки глиальных клеток DMEM – F-12 с добавлением 10% FBS, гентамицина (50 мкг / мл) и амфотерицина B (1,5 мкг / мл).Использовали культуры, показывающие 95% положительность глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) после 21 дня дифференцировки (27).

Штамм Wh3012 ВКЭ был описан ранее (28). Были клонированы гены TBEV C, Pre, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5, усечения NS5 (RdRP, MTase и D303) и мутанты NS5 (R354A, E358A, K359A, D361A и D664A). в сайты HindIII-BamHI вектора pFlag-CMV2 с использованием набора для одноэтапного направленного клонирования NovoRec PCR (NR001; Novoprotein) в соответствии с инструкциями производителя.HA-меченые экспрессирующие конструкции TBEV, JEV и ZIKV NS5 клонировали в pCAGGS соответственно. HA-меченные DENV и WNV NS5 в pCAGGS были подарками профессора Б. Чжана (Уханьский институт вирусологии Китайской академии наук). Геномная РНК TBEV, репортерная плазмида промотора RANTES (pGL2-220), сайт-мутировавшие плазмиды для IFN-стимулированного ответного элемента (ISRE) (ISRE Mut) и ДНК-связывающие домены, лишенные IRF-3 (IRF-3 △ N). описано ранее (24). Репортерная плазмида PRD (III-I) ₄ -Luc была предоставлена ​​Dr.С. Людвиг (Мюнстерский университет, Мюнстер, Германия) (29). Репортерная плазмида IFN-β luc и плазмида внутреннего контроля phRL-TK были описаны ранее (30, 31). Все использованные праймеры перечислены в дополнительной таблице I.

Трансдукция клеток

Контрольный лентивирус (LV; LV-контроль) и LV, несущие NS5 с меткой Flag (LV-NS5-Flag), были созданы Cyagen Biosciences. Титры LV-control и LV-NS5-Flag составляли 7,25 × 10 ⁸ и 1,58 × 10 ⁸ TU / мл, соответственно, измеренные с помощью количественной ПЦР.В общей сложности 5 × 10 ⁵ астроцитов, происходящих из предшественников человека (HPDA) на лунку, высевали в шестилуночные планшеты для получения соответствующей плотности 70-80% конфлюэнтности на следующий день. Клетки в каждой лунке трансдуцировали при указанной множественности инфекции (MOI) и инкубировали в течение ночи. На следующий день культуру заменяли свежей средой и инкубировали 72 или 96 ч при 37 ° C с 5% CO ₂ .

Экспрессию гена в трансдуцированных клетках исследовали вестерн-блоттингом или иммунофлуоресцентным анализом с кроличьими поликлональными антителами против GFAP (16825-1-AP; Proteintech) и мышиными mAb против Flag (F1804; Sigma).Уровень экспрессии RANTES в супернатантах от трансдуцированных культур клеток определяли с помощью ELISA (DY278-05; R&D Systems) в соответствии с инструкциями производителя. Уровень экспрессии мРНК определяли с помощью ПЦР в реальном времени.

Отчет о двойном люциферазном анализе

Клетки T98G высевали в 48-луночные планшеты в течение ночи и котрансфицировали плазмидами, кодирующими C, Pre, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5, усеченный или односайтовый NS5 мутантный или пустой вектор вместе с плазмидой люциферазы Renilla phRL-TK и репортерной плазмидой pGL2-220.Трансфекцию проводили с использованием реагента X-tremeGENE HP (06366236001; Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Спустя 48 часов клетки собирали и лизировали, а лизаты использовали для измерения активности люциферазы светлячков и Renilla с использованием системы анализа репортеров двойной люциферазы (E1980; Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Для некоторых экспериментов клетки T98G котрансфицировали пустым вектором или плазмидой экспрессии NS5 вместе с репортерными плазмидами pGL2-220 и phRL-TK плюс доминантно-отрицательные мутанты IRF-3 N.Через 48 часов после трансфекции измеряли ферментативную активность люциферазы светлячка и Renilla.

ПЦР в реальном времени

Клетки T98G в 12-луночных планшетах трансфицировали пустым вектором, плазмидой, экспрессирующей NS5, или укороченным NS5 (MTase или RdRP). Через 48 часов после трансфекции клетки собирали и общую РНК экстрагировали с использованием TRIzol (15596-026; Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Не содержащую РНКаз ДНКазу I (EN0521; Fermentas) использовали для устранения загрязнения геномной ДНК.кДНК была синтезирована с помощью обратной транскриптазы SMART MMLV (639522; Takara). Вновь синтезированная кДНК была использована в качестве матрицы для амплификации RANTES и внутреннего контроля GAPDH. ПЦР в реальном времени выполняли на аппарате ABI StepOne с использованием основной смеси SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (AQ141; Transgen Biotech) в следующих условиях: 95 ° C в течение 1 мин, затем 40 циклов при 94 ° C в течение 5 минут. с, 58 ° C в течение 15 с и 72 ° C в течение 10 с. Разность экспрессии рассчитывалась на основе значений 2 ^{— Ct} .Используемые пары праймеров перечислены в дополнительной таблице I. ELISA

для RANTES

Клетки

T98G, предварительно засеянные в 12-луночные планшеты, трансфицировали плазмидами, экспрессирующими NS5, усеченным NS5 (MTase или RdRP) или пустым вектором. Через 48 часов после трансфекции супернатанты клеточных культур собирали и центрифугировали для удаления клеточного дебриса. Количество секретированных RANTES в супернатантах определяли с помощью набора для ELISA RANTES для человека (DY278-05; R&D Systems) в соответствии с инструкциями производителя.

Вестерн-блоттинг-анализ

Клетки T98G, предварительно засеянные в шестилуночные планшеты, трансфицировали плазмидой, экспрессирующей NS5, усеченным или односайтовым мутантом NS5, или пустым вектором.Общие белки высвобождали с использованием буфера для лизиса клеток (87788; Thermo Fisher). Цитоплазматические и ядерные белки выделяли с использованием набора для экстракции белков ядер и цитоплазмы (P0027; Beyotime). Экстракты клеток подвергали 10% или градиенту 4–20% SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидные мембраны (0,45 мм; Millipore). Затем мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в TBS-Tween (50 мМ Трис-HCl [pH 7,5], 200 мМ NaCl, 0,1% [об. / Об.] Tween 20) в течение 2 часов и зондировали соответствующими первичными АТ при комнатной температуре. за 2 ч.После трех промывок TBS-Tween мембрану инкубировали с HRP-конъюгированным козьим антикроличьим IgG (BA1054; Boster) или козьим антимышиным IgG (BA1051; Boster) при комнатной температуре в течение 1 часа. Полосы белка визуализировали с помощью системы визуализации FluorChem HD2 (α Innotech) после добавления хемилюминесцентных субстратов (P0018; Beyotime).

Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки T98G предварительно высевали в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм и трансфицировали плазмидами, экспрессирующими NS5, усеченный NS5 (MTase или RdRP) или пустой вектор.Через тридцать шесть часов после трансфекции клетки фиксировали 4% парафомальдегидом и повышали проницаемость 0,2% Triton X-100. После трех промывок PBS клетки блокировали в PBS, содержащем 3% BSA, при 4 ° C в течение ночи. После этого клетки инкубировали с кроличьими поликлональными Ab против IRF-3 человека (11312-1-AP; Proteintech) и мышиными mAb против Flag (F1804; Sigma) или мышиными антителами против dsRNA (J2-1406; English and Scientific Consulting. ) и кроличьи поликлональные антитела против НА (51064-2-AP; Proteintech) в разведении 1: 200 при 37 ° C в течение 1 часа.После трех промывок PBS клетки затем инкубировали с меченным Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (A0423; Beyotime) и меченным Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (A0473; Beyotime) или меченный Alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (A0468; Beyotime) и меченный Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (A0428; Beyotime) в разведении 1: 100 в течение 1 ч при 37 ° C. Затем клетки промывали и инкубировали с DAPI (C1005; Beyotime) в течение 5 минут при комнатной температуре. После промывок клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом (N-STORM; Nikon).

РНК-интерференция

Приведены следующие последовательности малых интерферирующих РНК (миРНК): 5′-GGAAGAGGUGCAGUAUAUU-3 ‘, 5′-CCACAACACUAGUAAACAAUU-3′ и 5’-CGGAUUAGCGACAUA для RGGAUUAGCGACAUA ′ -GGUGAAGGAGCAGAUUCAGUU-3 ′ и 5′-GUAACAUUGUUAUCCGUUAUU-3 ′ для MDA5 (32–35). siRNA и скремблированная последовательность отрицательного контроля (контроль) были синтезированы Sangon Biotech. siRNA трансфицировали в клетки T98G с использованием реагента для трансфекции HiPerFect (301705; Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.Через восемь часов после трансфекции клетки котрансфицировали плазмидами, кодирующими NS5 или пустой вектор, вместе с плазмидой люциферазы Renilla phRL-TK и репортерной плазмидой pGL2-220. Сорок часов спустя клетки собирали для измерения активности люциферазы.

Иммунопреципитация хроматина

Клетки T98G, предварительно засеянные в шестилуночные планшеты, трансфицировали плазмидой экспрессии NS5 с меткой Flag или пустым вектором. Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) выполняли в соответствии с инструкциями производителя (17-409; Millipore).Вкратце, через 36 часов после трансфекции клетки фиксировали в 1% формальдегиде при комнатной температуре в течение 10 минут с последующей инкубацией в 1 М растворе глицина при комнатной температуре в течение 5 минут для гашения непрореагировавшего формальдегида. После трех промывок холодным PBS, содержащим коктейль II из ингибиторов протеаз, клетки соскребали в пробирку для микроцентрифугирования с последующим центрифугированием. Осадки клеток ресуспендировали в буфере для лизиса клеток (10 мМ HEPES [pH 7,9], 0,5% IGEPAL-CA630, 1,5 мМ MgCl ₂ , 10 мМ KCl), содержащем коктейль ингибиторов протеазы II.После центрифугирования супернатанты удаляли, а клеточный дебрис ресуспендировали в буфере для ядерного лизиса (1% SDS, 10 мМ EDTA, 50 мМ Tris-HCl [pH 8,1]), содержащем коктейль ингибиторов протеазы II. После инкубации на ледяной бане в течение 10 минут ДНК разрезали на мелкие фрагменты обработкой ультразвуком, и супернатанты переносили в чистые пробирки. Небольшую фракцию супернатантов использовали для обнаружения входящего образца. Магнитный белок G добавляли к оставшимся супернатантам с последующим вращением в течение 2 часов при 4 ° C для уменьшения неспецифического связывания белка-мишени или ДНК с агарозой с белком G.После этого к предварительно обработанным супернатантам добавляли свежий магнитный белок G с последующей инкубацией с антителами кролика против IRF-3, антителами против РНК-полимеразы II мыши (положительный контроль) или нормальным кроличьим IgG (отрицательный контроль) при 4 ° C в течение ночи. На следующий день после нескольких промывок иммунопреципитированные комплексы ДНК / белок элюировали путем инкубации при 65 ° C в течение 4 часов и 95 ° C в течение 10 минут. Конечные супернатанты, содержащие ДНК, очищали с использованием спин-колонок. Очищенную ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР-детекции IRF-3-чувствительной промоторной последовательности RANTES и GAPDH с соответствующими праймерами, перечисленными в дополнительной таблице I.

Ингибирование клеточного сигнального пути

Клетки T98G, предварительно засеянные в 48-луночные планшеты, котрансфицировали плазмидами, экспрессирующими NS5, усеченный NS5 или пустой вектор вместе с плазмидой люциферазы Renilla phRL-TK и репортерной плазмидой pGL2-220. Через восемь часов после трансфекции клетки обрабатывали BX795 (tlrl-bx7; InvivoGen) или носителем ДМСО в отсутствие сыворотки в течение 40 часов, а затем собирали для измерения активности люциферазы.

Хемотаксис

Лимфоциты человека выделяли из периферической крови человека с использованием среды для разделения лимфоцитов человека (Dakewe) в соответствии с инструкциями производителя.Лимфоциты человека были дифференцированы в Т-клетки CD4 ⁺ путем стимуляции 20 мкг / мл ИЛ-2 и 1 мкг / мл ФГА. Клетки T98G, предварительно посеянные в 12-луночные планшеты, трансфицировали 1,5 мкг экспрессионной плазмиды NS5 или пустым вектором. Через 48 часов культуральную среду собирали и инкубировали с 0,5 мкг / мл человеческого RANTES Ab (MAB2781; R&D Systems) в течение 1 часа для нейтрализации RANTES или неспецифического нормального IgG в качестве контроля. Затем 600 мкл супернатантов загружали в нижнюю камеру устройства для трансвелл (поликарбонатный фильтр 5 мкм, 3421; Corning).CD4 ⁺ Т-клетки (1 × 10 ⁶ в 100 мкл) добавляли в верхнюю камеру вставки трансвелл. После 1 ч инкубации при 37 ° C вставки из лунок удаляли и количество клеток, мигрировавших в нижнюю камеру, подсчитывали с помощью гематоцитометра. Данные были выражены как процент мигрировавших = 100% × (мигрировавшие клетки в нижней камере / общее количество введенных клеток).

Экспрессия белка, очистка и анализ полимеразы in vitro

Ген NS5 TBEV был клонирован в вектор pET26b-Ub (36), и полученная плазмида pET26b Ub-TBEV-NS5 служила шаблоном клонирования для конструирования R354A, Мутанты E358A, K359A и D361A с использованием метода сайт-направленного мутагенеза QuikChange.Плазмиды экспрессии NS5 трансформировали в штамм BL21 (DE3) pCG1 Escherichia coli (любезно предоставленный доктором К. Кэмерон) для экспрессии NS5 TBEV с использованием С-концевой гексагистидиновой метки и линкера Gly-Ser-Ser-Ser. .

Процедуры лизиса клеток, очистки белка и хранения были описаны ранее для JEV NS5 (37), за исключением того, что 5 мМ Трис (pH 7,5) использовали в качестве буферного агента для колонки для гель-фильтрации Superdex 200 (GE Healthcare). Белок TBEV NS5 концентрировали, быстро замораживали в виде аликвот по 5-20 мкл и хранили при -80 ° C для одноразового использования.Коэффициент молярной экстинкции для каждой конструкции NS5 рассчитывали на основе последовательности белка с использованием программы ExPASy ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Выход находился в диапазоне 1–3,5 мг чистого протеина на литр бактериальной культуры. Матрица РНК из 33 нуклеотидов (Т33) была приготовлена, как описано ранее в исследовании JEV NS5 (38). Праймер РНК длиной 10 нуклеотидов (P10) был приобретен у Integrated DNA Technologies. Процедуры отжига и хранения конструкции T33 / P10 были описаны ранее (38).Для проведения полимеразных анализов in vitro обычная реакционная смесь объемом 20 мкл, содержащая 6 мкМ NS5 (или его вариант, 4 мкМ конструкции T33 / P10), 50 мМ MES (pH 6,5), 20 мМ NaCl, 5 мМ MnCl ₂ , 2 мМ MgCl ₂ , 5 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин, 300 мкМ АТФ и 300 мкМ UTP инкубировали при 40 ° C в течение различного времени (от 0,5 до 60 мин) перед гашением равным объем стоп-раствора 95% (об. / об.) формамида, 20 мМ ЭДТА (pH 8), 0,02% (мас. / об.) бромфенолового синего и 0,02% (мас. / об.) цианола ксилола.Процедуры денатурирования PAGE, окрашивания геля и количественного определения были описаны ранее (38). Каждый раз курсовая реакция проводилась трижды. Количественный анализ был основан на всех трех экспериментах с отображением репрезентативных изображений одного геля.

Статистический анализ

Все эксперименты повторяли не менее трех раз, и данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, если не указано иное. Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad). Сравнение между двумя группами было проанализировано с помощью двустороннего непарного теста Стьюдента t .Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

TBEV NS5 отвечает за индуцированную TBEV продукцию RANTES

TBEV нацелен на ЦНС, и его инфекция может способствовать выработке RANTES, хотя лежащие в основе механизмы еще предстоит выяснить (24). В соответствии с нашим недавним исследованием, клетки T98G были способны экспрессировать RANTES в ответ на инфекцию TBEV, но УФ-инактивация резко ухудшила способность TBEV индуцировать экспрессию RANTES, что указывает на то, что RANTES, индуцированный TBEV, зависел от репликации вируса (рис.1А). Чтобы определить, какой вирусный белок TBEV отвечает за индукцию RANTES, мы клонировали все кодирующие гены TBEV и протестировали их влияние на активацию промотора RANTES. Экспрессию всех белков TBEV с меткой Flag подтверждали вестерн-блоттингом. Повышенная активность люциферазы наблюдалась только в клетках T98G, трансфицированных плазмидой экспрессии NS5 (фиг. 1B). Последующие эксперименты подтвердили, что TBEV NS5 активировал промотор RANTES дозозависимым образом (рис. 1C). Кроме того, уровни мРНК и белка RANTES были значительно повышены TBEV NS5 дозозависимым образом (рис.1D, 1E). Эти результаты показывают, что TBEV NS5, вероятно, ответственен за индукцию RANTES в клетках T98G. Помимо TBEV NS5, NS5 из других флавивирусов, включая JEV, DENV, WNV и ZIKV, все активировали промотор RANTES в клетках T98G (дополнительный рис. 1). Учитывая, что TBEV NS5 был вирусным белком, индуцирующим экспрессию RANTES, мы впоследствии сосредоточились на TBEV NS5, чтобы изучить основные механизмы и значение.

РИСУНОК 1.

TBEV NS5 отвечает за индукцию RANTES.( A ) TBEV индуцирует экспрессию RANTES. Клетки T98G инокулировали только средой, TBEV или УФ-инактивированным TBEV с MOI, равным 1. Сорок восемь часов спустя супернатанты собирали для измерения уровня RANTES с помощью ELISA. ( B ) Идентификация белков ВКЭ, индуцирующих экспрессию RANTES. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали 200 нг Flag-tag-tag-плазмидами, кодирующими различные белки TBEV, или пустой вектор вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы.Экспрессию белков TBEV анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против Flag. Звездочкой обозначены белки ВКЭ. ( C ) Влияние дозировки TBEV NS5 на активацию промотора RANTES. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали различными количествами плазмиды экспрессии NS5 с меткой Flag или пустого вектора вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы. ( D и E ) TBEV NS5 индуцирует продукцию мРНК и белка RANTES дозозависимым образом.Клетки T98G в 12-луночных планшетах трансфицировали различными количествами плазмиды для экспрессии Flag-tagged NS5 или пустого вектора. Через 48 часов из трансфицированных клеток экстрагировали тотальную РНК для измерения мРНК RANTES с помощью ПЦР в реальном времени (D), тогда как RANTES, высвобожденный в супернатантах, определяли с помощью ELISA (E). ( F ) RANTES, индуцированный TBEV NS5, привлекает первичные CD4 ⁺ Т-клетки. Клетки T98G в 12-луночных планшетах трансфицировали 1,5 мкг Flag-tag-tagged экспрессирующей плазмиды NS5 или пустым вектором.Через 48 часов культуральные супернатанты собирали, инкубировали с 0,5 мкг / мл RANTES Ab или контрольным IgG в течение 1 часа, а затем использовали для анализа хемотаксиса CD4 ⁺ T-клеток. Для вестерн-блоттинга показан один репрезентативный эксперимент из трех. Белки TBEV были обнаружены с использованием антител против флага, при этом β-актин использовался в качестве контроля нагрузки. Для графиков данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполняется в трех экземплярах. По сравнению с пустым вектором *** p <0.001, ** p <0,01, * p <0,05. нс, не имеет значения.

RANTES является хемотаксиком для Т-клеток, эозинофилов и базофилов и играет активную роль в рекрутировании лейкоцитов в участки воспаления (39, 40). Далее мы определили хемотаксическую активность RANTES, индуцированную NS5, с использованием системы трансвелл. Как и ожидалось, супернатанты от клеток, трансфицированных NS5, индуцировали более сильный хемотаксис первичных CD4 ⁺ Т-клеток, чем супернатанты из контроля. Кроме того, хемотаксис значительно снижался в присутствии человеческого RANTES Ab (рис.1F). В совокупности эти результаты демонстрируют, что неструктурный белок NS5 отвечает за индуцированную TBEV продукцию RANTES, а индуцированный RANTES является функциональным в рекрутировании первичных CD4 ⁺ Т-клеток.

TBEV NS5 индуцирует экспрессию RANTES как в клеточных линиях глиобластомы человека, так и в первичных астроцитах.

Сначала мы исследовали влияние TBEV NS5 на активацию промотора RANTES в различных клеточных линиях. Мы обнаружили, что TBEV NS5 активировал промотор RANTES в клеточных линиях глиобластомы человека T98G и U251, но не в линиях неневральных клеток HeLa, Vero и HEK 293T (дополнительный рис.2). Дальнейшие эксперименты были проведены с использованием HPDA в качестве модели для проверки того, индуцирует ли TBEV NS5 экспрессию RANTES в первичных астроцитах человека. Впоследствии мы преобразовали HPDA с LV при различных MOI. Как показано на фиг. 2A, экспрессия RANTES в HPDA индуцировалась LV-NS5-Flag дозозависимым образом. Мы также преобразовали HPDA с LV при MOI 40, чтобы проверить влияние LV-NS5-Flag на экспрессию RANTES в разные моменты времени. Как показано на фиг. 2B, LV-NS5-Flag индуцировал более высокую экспрессию RANTES через 96 часов, чем через 72 часа.Между тем, мы провели иммунофлуоресцентный анализ для оценки экспрессии NS5 и астроцитарного маркера GFAP после трансдукции клеток LV в течение 96 часов при MOI 40 и подтвердили экспрессию TBEV NS5-Flag и дифференцированное состояние HPDA ( Рис. 2С). Кроме того, мы исследовали уровень мРНК RANTES через 96 ч после трансдукции HPDA с LV при MOI 40, показав, что LV-NS5-Flag увеличивал уровень мРНК RANTES (рис. 2D).

РИСУНОК 2.

TBEV NS5 индуцирует продукцию RANTES в первичных астроцитах.( A ) Влияние дозировки TBEV NS5 на индукцию RANTES в HPDA. HPDA в 48-луночных планшетах трансдуцировали LV-NS5-Flag или LV-контролем при указанной MOI. Через 96 часов RANTES в супернатантах определяли с помощью ELISA. ( B ) TBEV NS5-опосредованная индукция RANTES в HPDA в разные моменты времени. HPDA в шестилуночных планшетах трансдуцировали с помощью LV-NS5-Flag или LV-control при MOI 40. Спустя семьдесят два или девяносто шесть часов RANTES в супернатантах определяли с помощью ELISA.( C ) Экспрессия астроцитарного маркера GFAP и TBEV NS5-Flag после трансдукции HPDA с помощью LV. HPDA в 35-миллиметровых чашках трансдуцировали LV-NS5-Flag или LV-control при MOI 40. Через 96 часов клетки окрашивали мышиными антителами против Flag и кроличьими анти-GFAP pAb, а затем с помощью Alexa Fluor. 555-меченные Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (красный) и Alexa Fluor 647-меченные Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) (фиолетовые) в качестве вторичных Abs, соответственно. Ядра клеток (синие) окрашивали DAPI.Изображения получали с помощью флуоресцентной микроскопии с объективом 20x. Показаны репрезентативные изображения из трех независимых экспериментов. Шкала 100 мкм. ( D ) TBEV NS5 увеличивает уровни мРНК RANTES в HPDA. HPDA в шестилуночных планшетах трансдуцировали LV-NS5-Flag или LV-control при MOI 40. Через девяносто шесть часов экстрагировали общую РНК и количественно определяли уровень мРНК RANTES с помощью ПЦР в реальном времени. Для графиков данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов с каждым условием, выполненным в трех экземплярах.*** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05.

TBEV NS5-индуцированная экспрессия RANTES осуществляется через сигнальный путь IRF-3

Идентифицировав TBEV NS5 как вирусный белок, ответственный за индукцию RANTES, мы затем оценили потенциальные факторы транскрипции, участвующие в NS5-опосредованной активации промотора RANTES. Было высказано предположение, что связывание IRF-3 или IRF-7 с сайтом ISRE промотора RANTES важно для вирусной индукции RANTES (41), при этом IRF-3, вероятно, играет важную роль в активации транскрипции RANTES (42 ).Чтобы подтвердить это, мы провели эксперименты с двойным отчетным анализом люциферазы. По сравнению с промотором RANTES дикого типа (WT) мутация ISRE на промоторе RANTES резко ингибировала активацию, индуцированную NS5 (фиг. 3A), указывая на существенную роль ISRE в индуцированной NS5 активации RANTES. Наши предыдущие результаты показали, что инфекция ВКЭ может индуцировать продукцию RANTES через сигнальный путь IRF-3, хотя лежащие в основе механизмы еще предстоит определить (24). В двойном анализе люциферазы, по сравнению с соответствующими контролями, сверхэкспрессия IRF-3ΔN в клетках T98G резко ингибировала активацию промотора RANTES, индуцированную NS5 (рис.3B), предполагая участие IRF-3 в активации RANTES, индуцированной NS5. В соответствии с этим, активация промотора RANTES с помощью NS5 была значительно подавлена ​​в присутствии BX795 (рис. 3C), ингибитора, который блокирует TBK1- и IKKε-опосредованную активацию IRF-3 (43). Чтобы еще раз подтвердить, что NS5 активирует сигнальный путь IRF-3, мы трансфицировали клетки T98G с помощью PRD (III-I) ₄ –Luc, который содержит четыре повтора чувствительного к IRF-3 домена вместе с плазмидой экспрессии NS5 и phRL-TK. , показывая, что NS5 активирует PRD (III-I) ₄ -Luc дозозависимым образом (рис.3D). Взятые вместе, эти результаты показывают, что TBEV NS5 индуцирует экспрессию RANTES через сигнальный путь IRF-3.

РИСУНОК 3.

TBEV NS5 индуцирует экспрессию RANTES через сигнальный путь IRF-3. ( A ) Влияние мутации ISRE на активацию промотора RANTES с помощью TBEV NS5. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали 400 нг Flag-tag-tagged экспрессирующей плазмидой NS5 или пустым вектором вместе со 100 нг промотора pGL-220 RANTES или его мутантом ISRE. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы.( B ) IRF-3 △ N ингибирует активацию промотора RANTES с помощью TBEV NS5. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали 200 нг плазмиды экспрессии NS5 с меткой Flag или пустым вектором вместе с 200 нг плазмиды экспрессии IRF-3 N и 100 нг промотора pGL-220 RANTES. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы. ( C ) Ингибитор сигнального пути IRF-3 подавляет активацию промотора RANTES посредством TBEV NS5. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали 200 нг плазмиды экспрессии NS5 с меткой Flag или пустым вектором вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK.Через 8 часов клетки обрабатывали BX795 (2 мкМ) или носителем ДМСО в среде в течение 40 часов, и клетки собирали для измерения активности люциферазы. ( D ) Влияние дозировки TBEV NS5 на активацию промотора, чувствительного к IRF-3. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали различным количеством Flag-tag-tagged экспрессионной плазмиды NS5 или пустого вектора вместе со 100 нг PRD (III-I) ₄ -Luc и 10 нг phRL-TK. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы.Для вестерн-блоттинга показан один репрезентативный эксперимент из трех. TBEV NS5 был обнаружен с использованием антител против флага, с β-актином, используемым в качестве контроля нагрузки. Для графиков данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполняется в трех экземплярах. *** p <0,001.

TBEV NS5 увеличивает ядерную транслокацию IRF-3 для связывания с промотором RANTES

При фосфорилировании IRF-3 димеризуется и перемещается из цитоплазмы в ядро, где он действует как фактор транскрипции для активации соответствующих промоторов (44).После экспрессии TBEV NS5 в клетках T98G мы выделили цитоплазматические и ядерные белки для измерения белка p-IRF-3. Как показано на фиг. 4A, p-IRF-3 увеличивался не только в цитоплазме, но также в ядрах клеток, трансфицированных NS5. Далее мы провели иммунофлуоресцентный анализ для анализа распределения IRF-3. Как показано на фиг. 4B, NS5 значительно ускоряет транслокацию IRF-3 в ядре. Анализ ChIP также использовался для изучения способности связывания IRF-3 с промотором RANTES, показывая, что IRF-3 более эффективно связывается с промотором RANTES в присутствии NS5 (рис.4С). Эти результаты показывают, что TBEV NS5 увеличивает ядерную транслокацию IRF-3 для связывания с промотором RANTES.

РИСУНОК 4.

TBEV NS5 индуцирует ядерную транслокацию IRF-3 для связывания с промотором RANTES. ( A ) NS5 индуцирует фосфорилирование и ядерную транслокацию IRF-3. Клетки T98G в шестилуночных планшетах трансфицировали 3 мкг плазмиды экспрессии NS5, меченной флагом, или пустым вектором. Через 36 часов были выделены цитоплазматические и ядерные белки (NE), и p-IRF-3 был обнаружен вестерн-блоттингом с использованием антител против p-IRF-3.β-актин или ядерный Ag пролиферирующих клеток (PCNA) использовали в качестве контроля загрузки цитоплазматических белков (CE) или NE, соответственно. ( B ) Эффект NS5 на ядерную транслокацию IRF-3 определяли с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Клетки T98G в 35-мм чашках трансфецировали 3 мкг плазмиды экспрессии NS5 с меткой Flag или пустым вектором. Тридцать шесть часов спустя клетки были окрашены мышиными антителами против Flag и кроличьими анти-IRF-3 pAb, затем меченными Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (красный) и Alexa Fluor 488-меченными. Козий анти-кроличий IgG (H + L) (зеленый) в качестве вторичных антител соответственно.Ядра клеток (синие) окрашивали DAPI. Изображения были получены с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием объектива 60 ×. Показаны репрезентативные изображения из трех независимых экспериментов. Масштабные линейки, 20 мкм. ( C ) NS5 способствует связыванию IRF-3 с промотором RANTES. Клетки T98G в шестилуночных планшетах котрансфицировали 3 мкг плазмид экспрессии NS5, меченных флагом, или пустым вектором в течение 36 часов. Клетки лизировали и подвергали ChIP-анализу с использованием антител против IRF-3, mAb против РНК-полимеразы II (положительный контроль) или нормального IgG (отрицательный контроль) для иммунопреципитации.Экспрессию NS5 анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против Flag. Для всех экспериментов показан один репрезентативный эксперимент из трех.

Продемонстрировав, что TBEV NS5 может активировать сигнальный путь IRF-3, мы дополнительно оценили нисходящие события, отличные от экспрессии RANTES. Известно, что IRF-3 вместе с другими факторами транскрипции собирается на промоторе IFN-α / β, чтобы инициировать транскрипцию IFN-β (45). Мы провели эксперименты по трансфекции клеток T98G репортерной плазмидой промотора IFN-β вместе с плазмидой экспрессии TBEV NS5 и phRL-TK.Результаты показали, что NS5 активировал промотор IFN-β дозозависимым образом (дополнительный рис. 3A). Кроме того, продукция IFN-β в супернатантах была значительно повышена NS5 (дополнительный рис. 3B), и это было подтверждено в первичных астроцитах, показывая, что трансдукция с помощью LV-NS5-Flag увеличивала уровень мРНК IFN-β в HPDA. (Дополнительный рис. 3C). Мы также исследовали экспрессию IFN-стимулированных генов (ISG) (46) с помощью двойного анализа люциферазы и ПЦР в реальном времени, показав, что активность промотора ISG54 и уровни мРНК CXCL10, ISG15 и IFIT1 все увеличивались NS5. (Дополнительный рис.3D, 3E).

TBEV NS5 активирует сигнальный путь IRF-3 способом, зависящим от RIG-I / MDA5

Было высказано предположение, что рецепторы распознавания патогенов (PRR), такие как RIG-I, MDA5, TLR3 и TLR7, могут опосредовать противовирусные ответы. за счет увеличения воспалительных цитокинов в сыворотке крови, что приводит к нарушению ГЭБ (47). Чтобы выяснить, передается ли RANTES, индуцированная TBEV NS5, через PRR-активированный сигнальный путь IRF-3, мы выполнили ПЦР в реальном времени для определения уровней мРНК PRR.Результаты показали, что RIG-I и MDA5 в клетках T98G были значительно активированы NS5 (фиг. 5A). Далее мы проанализировали уровни мРНК RIG-I и MDA5 в первичных астроцитах. Как показано на фиг. 5B, LV-NS5-Flag увеличивал уровни мРНК как RIG-I, так и MDA5 в HPDA после трансдукции. Экспрессию TBEV NS5 с меткой Flag подтверждали вестерн-блоттингом (фиг. 5B). Чтобы определить, зависит ли RANTES, индуцированная NS5, от RIG-I / MDA5, мы провели эксперименты по нокдауну с использованием siRNA, специфичных для RIG-I или MDA5.Как показано на фиг. 5C, нокдаун RIG-I значительно ингибировал активацию промотора RANTES с помощью NS5, и аналогичные результаты наблюдались при нокдауне MDA5, хотя и в меньшей степени (фиг. 5D). Эффективность нокдауна подтверждали вестерн-блоттингом (фиг. 5C, 5D). RIG-I и MDA5 связываются с дцРНК и инициируют передачу сигналов через его адаптер MAVS, который активирует TBK-1 / IKK-ε, комплекс, состоящий из двух протеинкиназ, что приводит к фосфорилированию и дальнейшей активации IRF-3 (48, 49) . Как и ожидалось, все p-TBK1 и p-IRF-3 были активированы TBEV NS5, как и RIG-I и MDA5 (рис.5E). Эти данные показывают, что TBEV NS5 активирует сигнальный путь IRF-3 способом, зависящим от RIG-I / MDA5.

РИСУНОК 5.

TBEV NS5 активирует путь передачи сигналов IRF-3 способом, зависящим от RIG-I и MDA5. ( A ) TBEV NS5 активирует мРНК RIG-I и MDA5. Клетки T98G в 12-луночных планшетах трансфицировали 1,5 мкг Flag-tag-tagged экспрессирующей плазмиды NS5 или пустым вектором. Тридцать шесть часов спустя общая РНК была извлечена из трансфицированных клеток, и TLR3, TLR7, RIG-I и MDA5 были обнаружены с помощью ПЦР в реальном времени.( B ) TBEV NS5 увеличивает уровни мРНК RIG-I и MDA5 в первичных астроцитах. HPDA в шестилуночных планшетах трансдуцировали с помощью LV-NS5-Flag или LV-control при MOI 40. Через девяносто шесть часов экстрагировали общую РНК и количественно определяли уровни мРНК RIG-I и MDA5 с помощью реальных время ПЦР. Экспрессию TBEV NS5 анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против флага с β-актином, используемым в качестве контроля загрузки. ( C и D ) миРНК против RIG-I / MDA5 ингибирует активацию промотора RANTES с помощью TBEV NS5.Клетки T98G в 48-луночных планшетах трансфицировали 5 нМ миРНК против RIG-I (C) или MDA5 (D). Через восемь часов клетки котрансфицировали 400 нг Flag-tag-tagged экспрессионной плазмидой NS5 или пустым вектором вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Клетки собирали через 40 часов после трансфекции для измерения активности люциферазы. Эффективность нокдауна проверяли вестерн-блоттингом с использованием соответствующих Abs. ( E ) TBEV NS5 увеличивает фосфорилирование IRF-3 посредством индукции RIG-I и MDA5.Клетки T98G в шестилуночных планшетах трансфицировали 3 мкг плазмиды экспрессии NS5, меченной флагом, или пустым вектором. Тридцать шесть часов спустя был проведен вестерн-блоттинг для проверки уровней белков RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1, p-TBK1, IRF-3 и p-IRF-3 с использованием соответствующих Abs. Для вестерн-блоттинга показан один репрезентативный эксперимент из трех. TBEV NS5 был обнаружен с использованием антител против флага, с β-актином, используемым в качестве контроля нагрузки. Для графиков данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполняется в трех экземплярах.*** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05. нс, не имеет значения.

RdRP, но не MTase модуль NS5 важен для индукции RANTES

NS5 имеет два ферментных модуля: N-концевую MTase и C-концевую RdRP (8). Чтобы картировать ключевую область NS5 в индукции экспрессии RANTES, мы сконструировали мутанты усечения NS5, MTase (1-264 аминокислотных остатка) и RdRP (265-903 аминокислотных остатка) (Fig. 6A). Как показано на фиг. 6B, МТаза практически не активировала промотор RANTES, тогда как RdRP значительно активировала промотор RANTES, сравнимый с полноразмерным NS5.Аналогичным образом, RdRP TBEV, но не МТаза, значительно индуцировал продукцию мРНК и белка RANTES на уровнях, аналогичных уровням, индуцированным полноразмерным NS5 (фиг. 6C, 6D). Эти результаты показывают, что RdRP, но не МТаза NS5 важны для индукции экспрессии RANTES. Чтобы проверить, достаточно ли RdRP NS5 для активации промотора RANTES, клетки T98G котрансфицировали различными количествами плазмиды экспрессии RdRP или пустого вектора вместе с pGL2-220 и phRL-TK. Результаты показали, что активация промотора RANTES была положительно связана с экспрессией RdRP (рис.6E). Подобно полноразмерному NS5, RdRP также способен индуцировать продукцию мРНК и белка RANTES в зависимости от дозы (фиг. 6F, 6G). Взятые вместе, эти находки указывают на то, что модуль RdRP TBEV NS5 отвечает за индуцированную экспрессию RANTES.

РИСУНОК 6.

RdRP, но не МТаза TBEV NS5 важны для индукции экспрессии RANTES. ( A ) Карта области усечения NS5: MTase (1–264 аминокислотных остатка), RdRP (265–903 аминокислотных остатка) и D303 (303–903 аминокислотных остатка). ( B ) RdRP, но не МТаза TBEV NS5, активирует промотор RANTES.Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали 400 нг Flag-tag-tagged экспрессирующей плазмидой NS5, усеченным мутантом Flag-tag-tag-NS5 или пустым вектором вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы. ( C и D ) RdRP, но не МТаза, индуцирует продукцию мРНК и белка RANTES. Клетки T98G в 12-луночных планшетах котрансфецировали 1,5 мкг меченой Flag плазмидой экспрессии NS5, мутантом усечения NS5 с меткой Flag или пустым вектором.Спустя 48 часов была извлечена общая РНК и количественно оценена мРНК RANTES с помощью ПЦР в реальном времени (C). RANTES, высвобожденные в супернатантах, определяли с помощью ELISA (D). ( E ) RdRP NS5 активирует промотор RANTES дозозависимым образом. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали различными количествами меченной Flag плазмиды экспрессии RdRP или пустого вектора вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы.( F и G ) RdRP NS5 индуцирует продукцию мРНК и белка RANTES дозозависимым образом. Клетки T98G в 12-луночных планшетах трансфицировали различными количествами плазмиды экспрессии RdRP, меченной Flag, или пустого вектора. Через сорок восемь часов была извлечена общая РНК, и мРНК RANTES была определена количественно с помощью ПЦР в реальном времени (F). RANTES, высвобожденные в супернатантах, определяли с помощью ELISA (G). Для вестерн-блоттинга показан один репрезентативный эксперимент из трех. NS5 TBEV и мутанты усечения были обнаружены с использованием антител против флага с β-актином, используемым в качестве контроля нагрузки.Для графиков данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполняется в трех экземплярах. По сравнению с пустым вектором *** p <0,001. нс, не имеет значения.

RdRP TBEV NS5 способствует индуцированной экспрессии RANTES через сигнальный путь IRF-3 и зависит от RIG-I / MDA5

Последующие эксперименты были проведены для оценки того, сходна ли экспрессия RANTES, запускаемая RdRP TBEV, с экспрессией TBEV NS5. Клетки T98G обрабатывали BX795 после трансфекции плазмидой экспрессии RdRP или пустым вектором вместе с pGL2-220 и phRL-TK.Результаты показали, что активация промотора RANTES с помощью RdRP была значительно подавлена ​​BX795, ингибитором пути передачи сигнала IRF-3 (фиг. 7A). После трансфекции клеток T98G плазмидой экспрессии NS5, мутантом усечения NS5 или пустым вектором выделяли цитоплазматические и ядерные белки для измерения уровня p-IRF-3. Как показано на фиг. 7B, p-IRF-3 увеличивался не только в цитоплазме, но также в ядрах клеток, трансфицированных NS5 или RdRP, но не МТазой. Чтобы еще раз подтвердить, что RdRP может индуцировать транслокацию IRF-3, мы провели иммунофлуоресцентный анализ для анализа распределения IRF-3.Как показано на фиг. 7C, IRF-3 в клетках, трансфицированных NS5 или RdRP, но не транслоцированных МТазой в ядро. Кроме того, двойной отчетный анализ люциферазы показал, что RdRP активировал PRD (III-I) ₄ -Luc, репортерную систему пути IRF-3, дозозависимым образом (рис. 7D). Эти результаты в совокупности указывают на то, что модуль RdRP вносит вклад в индуцированную TBEV NS5 экспрессию RANTES посредством пути IRF-3.

РИСУНОК 7.

Модуль RdRP TBEV NS5 активирует путь передачи сигналов IRF-3 способом, зависящим от RIG-I / MDA5.( A ) Ингибитор сигнального пути IRF-3 подавляет активацию промотора RANTES с помощью RdRP. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфецировали 200 нг меченной Flag плазмидой экспрессии RdRP или пустым вектором вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Через 8 часов после трансфекции клетки обрабатывали BX795 (2 мкМ) или носителем ДМСО в среде в течение 40 часов и собирали для измерения активности люциферазы. ( B ) RdRP, но не МТаза NS5, индуцирует фосфорилирование и ядерную транслокацию IRF-3.Клетки T98G в шестилуночных планшетах трансфицировали 3 мкг меченной Flag экспрессирующей плазмидой NS5, усеченным мутантом NS5 с меткой Flag или пустым вектором. Через 36 часов были выделены цитоплазматические и ядерные белки, и p-IRF-3 был измерен с помощью антител против p-IRF-3. β-актин и PCNA использовали в качестве контроля загрузки для цитоплазматических и ядерных белков соответственно. ( C ) Эффект усечения NS5 на ядерную транслокацию IRF-3, определяемый с помощью непрямой иммунофлуоресценции. Клетки T98G в 35-миллиметровых чашках трансфецировали 3 мкг плазмиды экспрессии NS5 с меткой Flag, мутантом усечения NS5 с меткой Flag или пустым вектором.Тридцать шесть часов спустя клетки были окрашены мышиными антителами против Flag и кроличьими анти-IRF-3 pAb, затем меченными Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (красный) и Alexa Fluor 488-меченными. Козий анти-кроличий IgG (H + L) (зеленый) в качестве вторичных антител соответственно. Ядра клеток (синие) окрашивали DAPI. Изображения были получены с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием объектива 60 ×. Показаны репрезентативные изображения из трех независимых экспериментов. Масштабные линейки, 20 мкм. ( D ) Эффект дозировки RdRP на активацию промотора, чувствительного к IRF-3.Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали различными количествами меченной Flag плазмиды экспрессии RdRP или пустого вектора вместе со 100 нг PRD (III-I) ₄ -Luc и 10 нг phRL-TK. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы. ( E ) RdRP, но не МТаза NS5, увеличивает фосфорилирование IRF-3 посредством индукции RIG-I и MDA5. Клетки T98G в шестилуночных планшетах трансфицировали 3 мкг меченной Flag экспрессирующей плазмидой NS5, усеченным мутантом NS5 с меткой Flag или пустым вектором.Тридцать шесть часов спустя был проведен вестерн-блоттинг для изучения RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1, p-TBK1, IRF-3 и p-IRF-3 с использованием соответствующих Abs. ( F ) Усеченный мутант D303 TBEV NS5 не индуцирует продукцию RANTES или активацию сигнального пути IRF-3. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали 400 нг Flag-меченной экспрессионной плазмидой RdRP, Flag-меченной экспрессионной плазмидой D303 или пустым вектором вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Спустя 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы или для исследования уровней экспрессии RIG-I, MDA5 и p-IRF-3.Для вестерн-блоттинга показан один репрезентативный эксперимент из трех. TBEV NS5 и мутанты усечения были обнаружены с использованием антител против флага, с β-актином, используемым в качестве контроля нагрузки. Для графиков данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполняется в трех экземплярах. По сравнению с пустым вектором *** p <0,001. СЕ, цитоплазматический белок; NE, ядерный белок; нс, не имеет значения; PCNA, ядерный Ag пролиферирующих клеток.

Далее мы провели вестерн-блоттинг для определения уровней эндогенных RIG-I, MDA5, MAVS, TBK1, p-TBK1, IRF-3 и p-IRF-3 после трансфекции плазмидой экспрессии NS5, мутантного усечения NS5 или пустого вектор.Как показано на фиг. 7E, RdRP, но не МТаза, индуцировал уровни белка RIG-I, MDA5, p-TBK1 и p-IRF-3, аналогичные уровням, индуцированным полноразмерным NS5. Эти результаты подтверждают, что модуль RdRP TBEV NS5 активирует путь передачи сигналов IRF-3 способом, зависящим от RIG-I и MDA5. Было обнаружено, что удаление МТазного домена JEV NS5 или линкерной области (остатки 266–275) сохраняло свою полимеразную активность, хотя и на более низком уровне, но дальнейшее удаление N-концевых остатков удлинения 276–303 отменяло активность ( 38).Стоит отметить, что укороченный мутант RdRP D303 TBEV NS5 с удаленным линкером MTase – RdRP и N-концевыми удлинительными остатками 265–303 (фиг. 6A) плохо активировал промотор RANTES и не индуцировал экспрессию RIG-I, MDA5 и p-IRF-3 (фиг. 7F), предполагая важную роль RdRP в этом процессе.

Активность RdRP TBEV NS5 важна для индукции RANTES

Продемонстрировав, что модуль RdRP отвечает за индуцированную TBEV NS5 экспрессию RANTES, мы спросили, опосредуется ли активация его активностью RdRP.Пальмовый домен — наиболее консервативная часть вирусных RdRP, содержащая два каталитических остатка аспарагиновой кислоты (D532 мотива A и D664 мотива C в TBEV NS5), которые абсолютно консервативны во всех односубъединичных полимеразах (50). Чтобы исследовать, влияет ли активность RdRP TBEV NS5 на индукцию RANTES, мы сконструировали и проанализировали мутантный D664A TBEV NS5. Сообщалось, что в отсутствие сигнала функциональной ядерной локализации DENV NS5 не может ни транслоцироваться в ядро, ни взаимодействовать с Daxx для увеличения продукции RANTES (51).Сайт связывания импортина β (сигнал двусторонней ядерной локализации [bNLS]) является высококонсервативным среди DENV и родственных флавивирусов (52). Чтобы выяснить, влияет ли ядерная локализация TBEV NS5 на индукцию RANTES, мы сконструировали и проанализировали мутанты TBEV NS5 R354A, E358A и K359A D361A, которые являются консервативными сайтами bNLS. Как показано на фиг. 8A, D361A, K359A и D664A практически не активировали промотор RANTES, тогда как R354A и E358A активировали промотор RANTES аналогично WT NS5. Вестерн-блоттинг выполняли для определения уровней эндогенных RIG-I, MDA5 и p-IRF-3 после трансфекции клеток T98G различными мутантами NS5.Мутанты NS5 R354A и E358A, но не K359A, D361A или D664A, индуцировали экспрессию RIG-I, MDA5 и p-IRF-3. Известно, что JEV D668 (D664 в TBEV) незаменим для активности RdRP (53). Мы обнаружили, что мутант TBEV D664A потерял способность индуцировать экспрессию RANTES. Все вместе это указывает на то, что активность RdRP является критической для индукции RANTES, опосредованной TBEV NS5. Кроме того, мы провели иммунофлуоресцентный анализ с использованием анти-дцРНК J2 Ab, коммерческого Ab, широко используемого для обнаружения дцРНК (54). Как показано на рис.8B, дцРНК была обнаружена в клетках, трансфицированных TBEV NS5, что указывает на то, что экспрессия NS5 приводит к синтезу дцРНК в отсутствие других белков TBEV. Чтобы подтвердить, что дцРНК действительно может активировать сигнальный путь IRF-3 в клетках T98G, мы использовали синтетическую дцРНК: поли (I: C). Как показано на фиг. 8C, сигнальный путь IRF-3 был активирован в клетках T98G, обработанных поли (I: C), при этом также увеличивалась экспрессия RIG-I / MDA5 и p-IRF-3. Эти результаты вместе указывают на то, что TBEV NS5-опосредованный синтез dsRNA, вероятно, вносит вклад в активацию пути передачи сигналов IRF-3.

РИСУНОК 8.

TBEV NS5-индуцированная продукция RANTES, по-видимому, связана с активностью RdRP. ( A ) Влияние мутанта NS5 на индукцию RANTES. Клетки T98G в 48-луночных планшетах котрансфицировали 400 нг плазмиды экспрессии NS5, меченной флагом; Меченые мутанты NS5 R354A, E358A, K359A и D361A; Плазмида экспрессии D664A; или пустой вектор вместе со 100 нг pGL2-220 и 10 нг phRL-TK. Через 48 часов клетки собирали для измерения активности люциферазы или для исследования RIG-I, MDA5 и p-IRF-3.( B ) TBEV NS5 синтезирует дцРНК в клетках T98G. Клетки T98G в 35-миллиметровых чашках трансфицировали 3 мкг HA-меченной плазмиды экспрессии NS5 или пустым вектором в течение 36 часов. Клетки окрашивали антителами против дцРНК мыши и поликлональными антителами кроликов против НА с последующим вторичным окрашиванием меченными Alexa Fluor 647 козьими антителами против кроличьих IgG (H + L) (красный) и козьими антителами против мышей, меченными Alexa Fluor 488. IgG (H + L) (зеленый) как вторичные Abs соответственно. Ядра клеток (синие) окрашивали DAPI. Изображения были получены с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием объектива 60 ×.Показаны репрезентативные изображения из трех независимых экспериментов. Масштабные линейки, 20 мкм. ( C ) Поли (I: C) может индуцировать экспрессию RIG-I, MDA5 и p-IRF-3. Клетки T98G в шестилуночных планшетах стимулировали 500 нг / мл поли (I: C) или без него в течение 16 часов. Клетки, замененные свежей средой, культивировали в течение 20 ч. Вестерн-блоттинг был проведен для изучения RIG-I, MDA5 и p-IRF-3. Для вестерн-блоттинга показан один репрезентативный эксперимент из трех. TBEV NS5 и мутанты были обнаружены с использованием антител против флага, с β-актином, используемым в качестве контроля нагрузки.Для графиков данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, при этом каждое условие выполняется в трех экземплярах. По сравнению с пустым вектором *** p <0,001. нс, не имеет значения.

Учитывая, что сканирующая мутация аланина в R354, E358, K359 или D361 не влияла на распределение TBEV NS5 (данные не показаны), полимеразную активность мутантов TBEV NS5 R354A, E358A, K359A и D361A анализировали с использованием Праймер-зависимый полимеразный анализ на основе ранее описанных методов (рис.9А) (38). С АТФ и УТФ в качестве единственных субстратов NTP, 10-мерный праймер (P10), как ожидалось, удлинялся на четыре нуклеотида, давая 14-мерный продукт. Для фермента WT удлинение праймера было почти завершено после 5-минутной инкубации, и 14-мер стал доминирующим продуктом с небольшим количеством 15-мер, возможно, полученным из-за низкого уровня неправильного включения (рис. 9B). ). Поэтому мы использовали процент интенсивности 14-15-мерных среди всех 10-15-мерных РНК для количественной оценки полимеразной активности.Среди всех четырех мутантов мутант D361A проявлял гораздо меньшую активность, чем NS5 дикого типа (рис. 9B-F), с более медленным превращением продукта (60 мин для D361A и 5 мин для дикого типа) и более низкой конечной точкой 14–15-мерной интенсивности. процент (54% для D361A и 84% для WT) (фиг. 9B, 9F, 9G, сравните дорожки 2–6 на фиг. 9B, 9F). Мутант K359A проявлял меньшую активность, чем WT NS5, хотя и в меньшей степени (фиг. 9B, 9E, 9G, сравните дорожки 2-6 на фиг. 9B, 9E). Эти биохимические результаты, в целом согласующиеся с результатами иммунологических экспериментов, дополнительно подтверждают наш вывод о том, что активность RdRP TBEV NS5 имеет решающее значение для индукции RANTES.

РИСУНОК 9.

Сравнение полимеразной активности in vitro TBEV NS5 и его мутантов. ( A ) Схема конструкции T33 / P10, используемой в анализах полимеразы in vitro. Цепь матрицы (голубая) и праймер (зеленый) образуют дуплекс длиной 8 п.о. в области выше по течению, а нижележащая матрица складывается обратно, образуя структуру стебель-петля. ( B — G ) Активность полимеразы in vitro для WT TBEV NS5 (B) и его мутантов R354A (C), E358A (D), K359A (E) и D361A (F).Зависимое от времени превращение праймера P10 в 14–15-мерные продукты использовали для оценки активности полимеразы. (G) Основанный на интенсивности процент 14-15-мерных продуктов среди всех 10-15-мерных РНК наносили на график в зависимости от времени реакции. Средний процент, рассчитанный на основе трех повторов реакции, и стандартное отклонение показаны для каждой временной точки.

Обсуждение

ГЭБ структурно состоит из эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, астроцитов, перицитов, нейрональных клеток и базальной мембраны (55).Было высказано предположение, что астроциты, инфицированные ВКЭ, могут быть потенциальным источником провоспалительных цитокинов в головном мозге, которые могут способствовать нейротоксичности, вызванной ВКЭ, и разрушению ГЭБ, которое происходит во время КЭ (56). Действительно, наше предыдущее исследование показало, что инфекция ВКЭ усиливает выработку RANTES в мозге мышей (24). В текущем исследовании путем скрининга вирусных белков, кодирующих TBEV, мы обнаружили, что TBEV NS5 индуцировал продукцию RANTES как в клеточных линиях глиобластомы человека, так и в первичных астроцитах, но не в других неневральных клетках (дополнительный рис.2). В дополнение к TBEV, мы наблюдали, что NS5 из JEV, DENV, WNV и ZIKV могут также активировать экспрессию RANTES (дополнительный рис. 1), предполагая общий механизм, используемый флавивирусами для индукции экспрессии RANTES.

Для нейроинвазивных флавивирусов иммунитет, опосредованный Т-клетками, важен для защиты от болезней и выведения вируса из ЦНС (57-59). Известно, что TBEV-специфические CD4 ⁺ Т-клетки, рекрутируемые RANTES, являются полифункциональными (60). На ранней стадии КЭ у человека большинство клеток, рекрутируемых в ЦНС, являются Т-лимфоцитами (61), что указывает на то, что Т-лимфоциты важны для выведения вируса или патологии КЭ (62, 63).Более того, было обнаружено, что Т-клетки вносят значительный вклад в повреждение нейронов при КЭ человека (63), подтверждая мнение о том, что высвобождение медиаторов воспаления и рекрутирование Т-клеток может способствовать дисфункции нервных клеток при инфекции ВКЭ человека. Аналогичным образом было обнаружено, что уровень RANTES повышен в спинномозговой жидкости пациентов с клещевым энцефалитом, что указывает на влияние RANTES-опосредованного переноса Т-лимфоцитов в ЦНС (64). В текущем исследовании мы продемонстрировали, что RANTES, индуцированный TBEV NS5, может эффективно рекрутировать Т-клетки CD4 ⁺ .Приведенные выше данные вместе показывают, что привлечение Т-клеток с помощью RANTES, индуцированных TBEV, может способствовать дисфункции нервных клеток.

Мы обнаружили, что промотор RANTES, активируемый NS5, ингибируется сверхэкспрессией мутанта с укорочением IRF-3 IRF-3 N или ингибитора BX795 сигнального пути IRF-3. Кроме того, TBEV NS5 активировал фосфорилирование IRF-3 и, следовательно, способствовал связыванию IRF-3 с ISRE промотора RANTES. Помимо ISRE, ряд сайтов связывания для факторов транскрипции аннотированы в промоторе RANTES, включая NF-κB, C / EBP и CREB / AP-1 (65, 66).Множественные цис регуляторные элементы, такие как NF-κB, C / EBP, CREB / AP-1 и ISRE, как было показано, участвуют в индуцированной респираторно-синцитиальным вирусом продукции RANTES (67). NF-κB, AP-1 и C / EBP также участвуют в опосредованной Tat ВИЧ-1 индукции RANTES в астроцитах (68). Известно, что NF-κB и IRFs взаимодействуют для активации транскрипции RANTES в эпителиальных клетках дыхательных путей, стимулированных дцРНК (69). Хотя наши данные подтверждают, что IRF-3-обеспечиваемая ISRE является основным детерминантом NS5-индуцированной экспрессии RANTES, потенциальная роль др. cis регуляторных элементов и др. Транскрипционных факторов не может быть полностью исключена.

Интересно, что наше исследование TBEV NS5-опосредованной активации пути передачи сигналов IRF-3 показало, что NS5 активирует индуцируемые ретиноевой кислотой генные I-подобные рецепторы (RLR) RIG-I и MDA5. Нокдаун RIG-I ингибировал NS5-опосредованную активацию промотора RANTES в большей степени, чем нокдаун MDA5. Это может отражать, что RIG-I и MDA5, вероятно, функционируют в разные моменты времени или что RIG-I играет преобладающую роль в NS5-опосредованной индукции RANTES. Это согласуется с выводами о том, что транскрипты RIG-I и MDA5 активируются при инфицировании DENV кератиноцитов человека (70).Аналогичным образом, было обнаружено, что RIG-I экспрессируется на высоком уровне в мозге мышей, инфицированных JEV (71).

Сообщалось, что повышающая регуляция RIG-I и MDA5 в случае линии клеток медуллобластомы DAOY человека, инфицированной TBEV, может способствовать наблюдаемой индукции IFNs (72). Активированный RIG-I запускает активацию IRF-3, что приводит к индукции IFN типа I, провоспалительных цитокинов и выбранных противовирусных генов, таких как ISG (73). Действительно, в дополнение к RANTES мы также наблюдали, что TBEV NS5 индуцировал продукцию IFN и ISG (дополнительный рис.3). Напротив, другие сообщили, что NS5 из флавивирусов, включая TBEV, могут ингибировать ответы IFN, подавляя путь JAK-STAT (74). Тем не менее, ключевые остатки TBEV NS5 как антагониста IFN были картированы с RdRP 374–380 и 624–647 (75), которые отличаются от тех, которые идентифицированы в текущем исследовании как индуктор RANTES. Более того, нервные клетки из эволюционно различных областей мозга имеют уникальные сигнатуры врожденного иммунитета (76). Например, IFN-ответ по-разному регулируется в разных регионах ЦНС, инфицированных вирусом Лангата (77).Кроме того, глиальные клетки демонстрируют быстрый ответ IFN и высокую экспрессию противовирусных ISG после инфицирования TBEV, JEV или ZIKV (78). Учитывая, что глиальные клетки вызывают ранний и сильный противовирусный ответ, который ограничивает распространение вируса в нейронах, такие подмножества клеток, вероятно, играют важную роль во врожденной противовирусной защите ЦНС (78). Поскольку это самый крупный неструктурный белок, занимающий ~ 34% от общей кодирующей последовательности неструктурного белка, неудивительно, что TBEV NS5 приобрел другие функции в дополнение к тем, которые участвуют в репликации вируса.Приведенные выше данные вместе предполагают, что TBEV NS5, вероятно, играет разные роли в разных клеточных субпопуляциях и / или на разных стадиях инфекции.

Мы обнаружили, что RdRP, но не модуль MTase TBEV NS5, был критическим для индукции RANTES. RdRP находится в цитоплазме, тогда как NS5 находится как в цитоплазме, так и в ядре. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что мутация остатков R354, E358, K359 или D361 в консервативной области bNLS флавивирусов не влияла на распределение TBEV NS5 в клетках T98G.Однако мутация в K359 или D361 не смогла активировать сигнальный путь IRF-3 и промотор RANTES, тогда как мутация в R354 или E358 сохранила активность, аналогичную активности NS5 WT. Эти результаты указывают на то, что ядерная локализация не важна для индуцированной TBEV NS5 экспрессии RANTES. Было документально подтверждено, что область RdRP NS5 содержит полимеразную активность в различных анализах (79, 80). Дальнейшее исследование мутагенеза показало, что D303, укороченный мутант NS5 TBEV с усеченным N-концевым удлинением RdRP, не смог активировать сигнальный путь IRF-3 и промотор RANTES, что указывает на то, что N-концевое удлинение RdRP имеет решающее значение для индукции RANTES. .Сходным образом, для JEV NS5, N-концевые остатки удлинения 276-303 RdRP, как было показано, являются критическими для его активности RdRP (38). Известно, что JEV D668 (D664 в TBEV), который является высококонсервативным у флавивирусов, незаменим для активности RdRP (53). В соответствии с этим мутант D664A TBEV NS5 утратил способность активировать путь передачи сигналов IRF-3 и промотор RANTES. Из-за важной роли RdRP в репликации вируса мы не смогли изучить активность RdRP этих мутаций в контексте инфекции TBEV.Путем проведения полимеразного анализа in vitro мы обнаружили, что мутация D361 TBEV NS5 проявляла гораздо меньшую активность, чем WT NS5, тогда как мутация K359 проявляла более низкую активность, хотя и в меньшей степени. Это означает, что активность RdRP NS5 может быть критической для индукции RANTES. Наше наблюдение, что экспрессия TBEV NS5 приводит к синтезу дцРНК в клетках T98G, и приведенные выше результаты подтверждают наш вывод о том, что индуцированная NS5 экспрессия RANTES, вероятно, является результатом RdRP-опосредованного синтеза дцРНК, которая может распознаваться RLR, такими как RIG- Я и MDA5.

В соответствии с нашими исследованиями, несколько исследований недавно сообщили, что экспрессия вирусного RdRP может активировать врожденную иммунную систему в клетках млекопитающих (81–84). Например, временная экспрессия HCV RdRP NS5B привела к индукции PRR, специфичных для дцРНК, включая RIG-I и MDA5, которые активируют сигнальные пути врожденного иммунитета в гепатоцитах мыши и человека (85, 86). Также было показано, что репликаза вируса леса Семлики превращает РНК клетки-хозяина в 5′-ppp-dsRNA, которая индуцирует IFN-β через пути RIG-I и MDA-5 в эмбриональных фибробластах мыши (82).Кроме того, репликаза норовируса человека может активировать промотор IFN-β (87), тогда как было показано, что репликаза вируса мышиного энцефалита Тейлера увеличивает уровень оснований IFN (81). В соответствии с этим, мыши, трансгенные по RdRP вируса энцефаломиокардита, продуцировали количественно впечатляющую, устойчивую и эффективную противовирусную сеть ISG, и для такого эффекта необходим путь MDA5 – MAVS, подразумевая, что дцРНК, продуцируемые RdRP, являются эффективным триггером (83). Наше исследование является первым, насколько нам известно, раскрывает новую роль TBEV NS5, который активирует иммунный сигнальный путь для увеличения продукции цитокинов в зависимости от активности RdRP, особенно в глиальных клетках.Учитывая, что у TBEV есть стратегия скрытия своей дцРНК во внутриклеточных мембранных везикулах, таким образом задерживая врожденный иммунный ответ (88), преобразованные вирусным NS5 дцРНК хозяина могут представлять собой важный альтернативный источник молекулярных паттернов, связанных с патогенами, которые, как «Сигнал опасности» может вызвать сильный врожденный иммунный ответ и цитокиновый шторм в головном мозге.

В заключение, мы идентифицировали TBEV NS5 как ключевой индуктор RANTES как в клеточных линиях глиобластомы человека, так и в первичных астроцитах, и продемонстрировали, что NS5 индуцирует продукцию RANTES, активируя сигнальный путь IRF-3 способом, зависящим от RIG-I / MDA5.Мы также показываем, что модуль RdRP NS5 является критическим для индукции RANTES, и этот процесс связан с активностью RdRP. Наши результаты подчеркивают важность TBEV NS5 в индукции продукции RANTES, обеспечивая молекулярное объяснение нейровоспаления, вызванного TBEV, и потенциальную цель вмешательства.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Выражение признательности

Мы благодарим доктора Дин Гао из основного центра и технической поддержки Института вирусологии Ухани за техническую помощь в конфокальной микроскопии.

Сноски

• Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2016YFC1200400 — YL), Национальными мегапроектами по инфекционным заболеваниям (2018ZX10301406-002 и 2018ZX10301405-003 — QH), Государственным ключом Лаборатория вирусологии (klv-2016-02 — QH), Китайская академия наук (CXJJ-16M120 — QH) и Программа открытого исследовательского фонда Уханьской национальной лаборатории биобезопасности уровня 4 Китайской академии наук (NBL2017009 — P .G.)

• Онлайн-версия этой статьи содержит дополнительные материалы.

• Сокращения, использованные в статье:

  BBB

  гематоэнцефалический барьер

  bNLS

  сигнал двусторонней ядерной локализации

  ChIP

  иммунопреципитация хроматина

  DENVial

  вирус гликемии кислый белок

  HPDA

  астроцит, производный от предшественника человека

  IRF-3

  IFN-регуляторный фактор 3

  ISG

  IFN-стимулированный ген

  ISRE

  IFN-стимулированный элемент ответа EV

  Вирус энцефита Японии

  J

  LV

  лентивирус

  LV-NS5-Flag

  LV, несущий NS5 с тегом Flag

  MOI

  множественность инфекции

  МТаза

  метилтрансфераза

  P10

  праймер PR10

  10-nt9 PR9 рецептор распознавания патогена

  RdRP

  9096 3 РНК-зависимая РНК-полимераза

  siRNA

  малая интерферирующая РНК

  T33

  33-нуклеотидная РНК-матрица

  TBE

  клещевой энцефалит

  TBEV

  WEV

  вирус клещевого инфицирования вирус

  WT

  дикий тип

  ZIKV

  вирус Зика.

• Получено 31 октября 2017 г.
• Принято 30 апреля 2018 г.

• Авторские права © 2018 Американская ассоциация иммунологов, Inc.

No 34/35 — 2020

Новые случаи клещевой энцефалит (КЭ) в Тисвилде Хегн в Северной Зеландии и на острове Фальстер

Три случая КЭ у лиц, инфицированных в Тисвильде Хегн

В 2019 году Тисвильде Хегн и прилегающие районы были определены как новая зона риска для вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).В период с сентября по июнь 2019 года у четырех пациентов был диагностирован КЭ после того, как они были укушены с большой вероятностью инфицированными клещами в Тисвильде-Хегне и его окрестностях. В 2019 и 2020 годах SSI и Университет Копенгагена продемонстрировали присутствие клещей TBEV, «помечая» (протягивая кусок ткани по растительности) на популярной естественной игровой площадке в северо-восточной части Тисвилде-Хегн и вокруг нее. EPI-NEWS 25/20.

Пока что интенсивное «разведение» Tisvilde Hegn выявило TBEV только на естественной игровой площадке.Исходя из этого, власти решили закрыть естественную игровую площадку в июне 2020 года, чтобы ее можно было перенести в зону, предположительно свободную от клещевого энцефалита. В соответствии с этой мерой в период с июня по середину августа 2020 года было выявлено три случая КЭ у пациентов, которые с большой долей уверенности были укушены клещами в Тисвильде-Хегне и прилегающих районах, но за пределами района, где расположена естественная игровая площадка. . В число этих случаев входят две женщины и мужчина, которые покинули тропинку, проживая в этом месте, остановившись в загородном доме и оставаясь в лесу на короткий период времени, соответственно.

Все пациенты поступили в больницу с типичными симптомами КЭ различной степени тяжести; и на момент постановки диагноза у всех пациентов была повышенная концентрация лейкоцитов в спинномозговой жидкости. В 2018 и 2019 годах один из пациентов в возрасте 76 лет прошел полный график вакцинации против клещевого энцефалита, но даже в этом случае у пациента развились симптомы клещевого энцефалита. Диагноз был поставлен на основании возрастающей концентрации антител IgG к ВКЭ в образцах крови выздоравливающих и путем обнаружения антител IgM к ВКЭ в спинномозговой жидкости пациента, см. Таблицу 1.Энцефалит, вызванный ВКЭ, несмотря на вакцинацию, неоднократно описывается в литературе, и риск, по-видимому, возрастает с возрастом. Это наблюдение является одной из причин, по которой Швеция теперь рекомендует добавить дополнительную вакцинацию к основной серии вакцинации для лиц в возрасте 50 лет и старше, см. Ниже.

Один случай инфицирования КЭ на острове Фальстер

Впервые КЭ был обнаружен на острове Фальстер. Пациентка, женщина в возрасте 60 лет, проживающая на Фальстере, была укушена клещом в мае и прибл.Через 14 дней появились симптомы менингита / энцефалита. Концентрация лейкоцитов была увеличена в спинномозговой жидкости, и антитела против вируса клещевого энцефалита были обнаружены как в крови, так и в спинномозговой жидкости. Пациент регулярно посещает различные леса на Фальстере, поэтому трудно установить точное место заражения, таблица 1. Пациент не ездил и не посещал другие известные места TBEV в период инкубации.

Инфекция ВКЭ

КЭ — воспаление головного мозга, которое может возникнуть в результате инфицирования ВКЭ.ВКЭ обычно передается через укусы клещей, но в редких случаях может также передаваться при приеме внутрь инфицированных вирусом непастеризованных молочных продуктов. Весной 2020 года более 40 человек во Франции заразились ВКЭ в результате употребления в пищу сыра, приготовленного из сырого козьего молока с фермы в регионе Рона-Альпы. Подобные вспышки наблюдались в Финляндии, но еще не описаны в Дании.

Инфекция европейским подтипом TBEV (TBEV-EU) протекает бессимптомно через прибл.75% инфицированных. В оставшихся ок. В 25% случаев наблюдается симптоматическая инфекция, которая обычно имеет две фазы: после 7-14-дневного инкубационного периода после укуса клеща первая фаза начинается с 2-4-дневной лихорадки и нехарактерных гриппоподобных симптомов («летний грипп» »).

Последние симптомы часто полностью исчезают еще через 1-2 недели. Прибл. В одной трети случаев заболевание переходит во вторую фазу с симптомами со стороны нервной системы из-за лимфоцитарного менингита, энцефалита, менингоэнцефалита или менинго-радикулита.На этом этапе у пациента часто образуются специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита в крови и спинномозговой жидкости. У некоторых пациентов начало проявляется симптомами со стороны центральной нервной системы без предшествующего «летнего гриппа». Около 1/3 пациентов с симптомами нервной системы могут испытывать последствия в виде одностороннего пареза и / или когнитивных симптомов, которые не обязательно являются постоянными.

Диагностика

При клиническом подозрении на инфекцию ВКЭ диагноз обычно может быть поставлен путем обнаружения в сыворотке специфических антител IgM и IgG к вирусу клещевого энцефалита с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).Повышенные титры IgM ориентировочно указывают на продолжающуюся или недавно преодоленную инфекцию. Сероконверсия или значительное увеличение титра IgG в образцах крови выздоравливающих подтверждают и подтверждают диагноз, соответственно. Первый образец крови нужно сдавать как можно раньше в процессе заболевания, второй — спустя 1-2 недели. Важно обратить внимание на тот факт, что вакцинированные против TBEV люди будут формировать антитела против TBEV, которые могут быть обнаружены с помощью ELISA, и что может возникать перекрестная реактивность с антителами против других флавивирусов (вируса денге, вируса Западного Нила, вируса японского энцефалита, желтой лихорадки). вирус — для двух последних также антитела из-за вакцинации против этих состояний).Специфические IgM-антитела могут иногда обнаруживаться в спинномозговой жидкости, что подтверждает диагноз. Выявление антител к вирусу клещевого энцефалита проводится по SSI, антителам к вирусу клещевого энцефалита (IgG, IgM) (R-№ 227).

Прямое обнаружение нуклеиновых кислот ВКЭ в спинномозговой жидкости с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) также является диагностическим средством для инфекции ВКЭ. На первой стадии заболевания ВКЭ можно обнаружить в крови с помощью ПЦР. Однако обнаружение вируса в крови не означает, что у пациента обязательно разовьются неврологические симптомы.Вероятность обнаружения ВКЭ в спинномозговой жидкости с помощью ПЦР очень ограничена, поскольку вирус обычно присутствует незадолго до появления неврологических симптомов, то есть до того, как пациент обратится к врачу. Прямое определение нуклеиновых кислот ВКЭ в крови и спинномозговой жидкости проводится в SSI, вирусе клещевого энцефалита (РНК) (R-№ 679) и в отделении клинической микробиологии больницы Орхусского университета.

Меры предосторожности

Риск укуса клещей выше, если вы часто проводите время в лесу или кустарнике за пределами существующих тропинок.Риск укусов клещей можно снизить, если надеть обувь, длинные брюки, а также часто осматривать и быстро удалять клещей. ВКЭ передается в непосредственной близости от укуса клеща (в течение нескольких минут), поскольку вирус присутствует в слюнных железах клеща. Тем не менее, важно как можно скорее удалить клеща, поскольку количество передаваемого вируса зависит от тяжести симптомов.

Вакцинация против клещевого энцефалита

В Дании острова Борнхольм и Тисвилде Хегн и прилегающие районы в настоящее время считаются зонами риска КЭ.Вакцинация может быть рассмотрена, в частности, для пациентов, которые часто посещают эти районы и выходят за пределы существующих тропинок в лесу и в кустах. Как правило, такие люди будут постоянно проживать на территориях или иметь летние резиденции на этих территориях. Кроме того, вакцинация может быть рассмотрена для лиц, которые подвергаются особенно высокому риску заражения и регулярно посещают районы риска КЭ, например, работникам лесного хозяйства, охотникам, ориентировщикам, сборщикам грибов и ягод, а также лицам, использующим лес в качестве постоянного места жительства. для игр, занятий спортом или других хобби.Несколько спорадических случаев энцефалита клещевого энцефалита в 2018 и 2020 годах за пределами острова Борнхольм и Тисвилде Хегн не вызывают изменения текущих датских рекомендаций по вакцинации против вируса клещевого энцефалита, но за развитием событий внимательно следят.

График прививок

В SSI есть две вакцины против клещевого энцефалита: 0,5 мл TicoVac® для лиц старше 16 лет и 0,25 мл TicoVac® Junior для детей от 1 до 16 лет. Согласно сводке характеристик продукта TicoVac®, две дозы вводятся с рекомендуемым интервалом в 1-3 месяца.Третья доза — это ранняя ревакцинация, которую следует вводить через 5–12 месяцев после второй вакцинации, если возможно, непосредственно перед началом сезона клещей в мае. Бустер защищает пациента минимум 3 года.

• Людям, которым на момент вакцинации меньше 60 лет, вторая ревакцинация проводится через 3 года, а затем каждые 5 лет.
• Людям в возрасте 60 лет и старше на момент вакцинации вторая ревакцинация также проводится через 3 года, но затем каждые 3 года.

Что касается минимизации риска неудачной вакцинации, новые шведские данные, как упоминалось выше, поддерживают введение дополнительной дозы вакцины лицам в возрасте 50 лет и старше в рамках базовой программы вакцинации. Это еще не описано в утвержденной сводке характеристик продукта TicoVac® и, следовательно, будет представлять собой использование вакцины не по назначению, которое должно основываться на общем решении, принятом врачом и пациентом.

ВКЭ распространяется в Дании и остальной Европе

TBEV, похоже, географически распространяется в Дании, а также в остальной части Европы, и поэтому мы должны быть готовы к тому, что количество зон риска (микрофокусов) по всей Дании будет увеличиваться.Поэтому врачи должны внимательно относиться к КЭ как дифференциальному диагнозу у всех недиагностированных пациентов с симптомами вирусного энцефалита и соответствующим контактом, независимо от их истории поездок.

(NS Andersen, A. Fomsgaard, MW Rosenstierne, M. Rasmussen, Отдел специальной вирусной и микробиологической диагностики, PH Andersen, Отдел эпидемиологии и профилактики инфекционных заболеваний, MPG Jepsen, Отделение легочной и инфекционной медицины, Госпиталь Северной Зеландии, M .Х. Бестл, отделение интенсивной терапии, больница Северной Зеландии, М.К. Томсен, клиническая микробиология, больница при университете Орхуса), Л.С. Кнудсен, медицина инфекций, больница при университете Зеландии, Р. Бёдкер, кафедра ветеринарии и зоотехники Копенгагенского университета)

Германия сообщает об увеличении заболеваемости клещевым энцефалитом, на Баден-Вюртемберг и Баварию приходится девять из 10 случаев

Автор NewsDesk @infectiousdiseasenews

Институт Роберта Коха (RKI) сообщает (компьютерный перевод) о росте случаев клещевого энцефалита (КЭ) с начала года в Германии.

Германия / CIA

По состоянию на 7 сентября было зарегистрировано 535 случаев заболевания; что на 14 процентов больше, чем за тот же период 2018 года, рекордного года для TBE в Германии.

Восемьдесят девять процентов случаев (477) были зарегистрированы в штатах Баден-Вюртемберг и Бавария на юге Германии.

Представители здравоохранения предполагают, что увеличение может быть связано с рекомендованными мерами по сдерживанию COVID-19, когда люди могут проводить больше времени на открытом воздухе и, таким образом, иметь повышенный риск заражения.

В 2020 году большое количество клещей также наблюдалось в местах, где регулярно собираются пробы. В частности, в этом году количество стадий взрослых клещей необычно велико. Эта стадия клеща имеет более высокий уровень носительства вируса, чем стадия нимфы. Можно предположить, что этот сезон клещей в известных зонах риска КЭ также увеличивает вероятность укуса инфицированного клеща.

КЭ — болезнь, вызываемая вирусом, распространяющимся через укусы клещей. По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), вы также можете заразиться клещевым энцефалитом, употребляя в пищу или употребляя непастеризованные молочные продукты (например, молоко и сыр) от инфицированных коз, овец или коров.

Симптомы включают жар, боль, потерю аппетита, головную боль, тошноту и рвоту. Отек головного и / или спинного мозга, спутанность сознания и сенсорные нарушения возникают у 20-30% людей с КЭ. Один процент людей умирает от этой инфекции.

TBE встречается во многих частях Европы и Азии (от восточной Франции до северной Японии и от северной России до Албании). Ежегодно регистрируется несколько тысяч случаев, но, вероятно, есть много других случаев, о которых не сообщается.Наибольшее количество случаев заболевания происходит в России.

Италия сообщает о местной передаче денге в регионе Венето

Число случаев гонореи в Англии увеличилось на 26 процентов

В сточных водах в Нидерландах обнаружен полиовирус

В этом году Украина сообщила о 16 вспышках сальмонеллы

Швеция сообщила об увеличении случаев инфицирования кампилобактером в этом месяце

Испания: зарегистрированы первые случаи смерти от вируса Западного Нила во время вспышки болезни в Севилье

Инфекционное заболевание, поражающее мозг, которое распространяется клещами, впервые достигло Великобритании | The Independent

Инфекционное заболевание, которое может поражать мозг и передается людям через укусы клещей, было впервые выявлено в Великобритании.

Служба общественного здравоохранения Англии (PHE) подтвердила наличие вируса клещевого энцефалита в Тетфорд-Форест, Норфолк и на границе Хэмпшир-Дорсет.

Хотя PHE заявляет, что риск «очень низок», он исследует, насколько распространены зараженные клещи.

Маленькие паразитические паукообразные становятся все более распространенными в некоторых частях Великобритании, в основном из-за увеличения численности оленей.

Клещи также могут жить в подлеске и цепляться за людей, когда они идут через подлесок и высокую траву.

Новости здоровья в картинках

Показать все 40

1/40 Новости здоровья в картинках

Новости здравоохранения в картинках

Вспышка коронавируса

Коронавирус Covid-19 поразил Великобританию, что привело к гибели двух человек и вызвало предупреждения от Министерства здравоохранения

AFP через Getty

Новости здравоохранения в картинках

По данным статистики, тысячам пациентов неотложной помощи приказывают сесть на такси до больницы

Тысячам 999 пациентов в Англии приказывают сесть на такси до больницы.Число пациентов за пределами Лондона, которым было отказано в помощи машины скорой помощи, выросло на 83% в прошлом году, поскольку спрос на услуги растет. жизни 11 человек в США за последние недели. В Центре США по контролю и профилактике заболеваний более 100 сотрудников расследуют причину загадочной болезни, и он предостерег граждан от курения электронных сигарет до тех пор, пока не станет известно больше, особенно если они были изменены или куплены «на улице».

Getty

Новости здравоохранения в картинках

Лекарство от облысения выглядит на шаг ближе

Исследователи из США утверждают, что преодолели одно из основных препятствий на пути выращивания человеческих фолликулов из стволовых клеток.Новая система позволяет клеткам расти в виде структурированного пучка и выходить из кожи. доза природы всего два часа в неделю способствует лучшему здоровью и психологическому благополучию

Shutterstock

Новости здоровья в картинках

Загрязнение воздуха связано с проблемами фертильности у женщин

Воздействие воздуха с загруженных автомобильным транспортом улиц может оставить женщин исследование показало, что у них меньше лет, чтобы иметь детей.Итальянские исследователи обнаружили, что женщины, живущие в наиболее загрязненных районах, в три раза чаще демонстрируют признаки того, что у них заканчиваются яйца, чем у тех, кто живет в более чистых условиях, что потенциально может вызвать более раннюю менопаузу

Getty / iStock

Новости здоровья в картинках

Рекламы нездоровой пищи могут быть запрещены до водораздела.

Рекламы нездоровой пищи на телевидении и в Интернете могут быть запрещены до 21:00 в рамках правительственных планов по борьбе с «эпидемией» детского ожирения.В целях борьбы с растущим кризисом планы нового водораздела были вынесены на общественное обсуждение, заявило Министерство здравоохранения и социальной защиты (DHSC).

PA

Новости здравоохранения в фотографиях

Разведение с неандертальцами помогло людям бороться с болезнями.

Приблизительно 70 000 лет назад, мигрируя из Африки, люди наткнулись на неандертальцев Евразии. В то время как люди были слабы к болезням новых земель, размножение с местными неандертальцами способствовало лучшему оснащению иммунной системы

PA

Новости здравоохранения в картинках

Дыхательный тест на рак будет испытан в Великобритании

Устройство для биопсии дыхания разработан для выявления признаков рака в молекулах, выдыхаемых пациентами

Getty

Новости здоровья в картинках

В среднем 10-летний ребенок потребляет рекомендованное количество сахара для взрослого

К 10-летнему возрасту дети в среднем уже ели больше сахара чем рекомендуемая сумма для 18-летнего.В среднем 10-летний ребенок потребляет 13 кубиков сахара в день, что на 8 больше, чем рекомендуется Королевский колледж педиатрии и здоровья детей рекомендовал детям избегать использования экранов в течение часа перед сном, чтобы не нарушать сон

Getty

Новости здравоохранения в картинках

Daily Исследование показало, что аспирин не нужен пожилым людям с хорошим здоровьем. Американское исследование показало, что вейпинг может привести к раку

Исследование, проведенное Масонским онкологическим центром Университета Миннесоты, показало, что рак Ногенные химические вещества формальдегид, акролеин и метилглиоксаль присутствуют в слюне пользователей электронных сигарет

Reuters

Новости здоровья в картинках

Все больше детей страдают ожирением и диабетом

Число детей с диабетом 2 типа увеличилось на 41% с 2014 года Национальный педиатрический аудит диабета установил.Ожирение — основная причина

Reuters

Новости здоровья в картинках

Большинство детских антидепрессантов неэффективны и могут вызывать суицидальные мысли

Большинство антидепрессантов неэффективны и могут быть небезопасными для детей и подростков с большой депрессией, считают эксперты. предупредил. В ходе наиболее полного сравнения 14 обычно назначаемых антидепрессантов на сегодняшний день исследователи обнаружили, что только один бренд более эффективен в облегчении симптомов депрессии, чем плацебо.Другой популярный препарат, венлафаксин, увеличивает риск возникновения суицидных мыслей и попыток самоубийства у потребителей

Getty

Новости здоровья в картинках

Взрослые геи, лесбиянки и бисексуалы с повышенным риском сердечных заболеваний, утверждает исследование

Исследователи из Клиника Baptist Health South Florida Clinic в Майами сосредоточила свое внимание на семи областях контролируемого здоровья сердца и обнаружила, что эти группы меньшинств особенно часто курят и имеют плохо контролируемый уровень сахара в крови

iStock

Новости здравоохранения в картинках

Сухие завтраки, предназначенные для детей содержат «стабильно высокий» уровень сахара с 1992 года, несмотря на заявления производителя

Основная группа давления выпустила новое предупреждение об опасно высоком содержании сахара в хлопьях для завтрака, особенно в тех, которые предназначены для детей, и заявила, что уровни практически не снизились. за последние два с половиной десятилетия

Getty

Новости здравоохранения в картинках res

выбоины делают нас толстыми, предупреждает наблюдатель NHS способствует развитию эпидемии ожирения, не давая людям оставаться активными

PA

Новости здравоохранения в картинках

Новые лекарства от менопаузы помогают женщинам избавиться от «изнуряющих» приливов

Новый класс лечения для женщин в период менопаузы может уменьшить количество изнурительных приливов на целых три четверти за считанные дни, как показало исследование.По словам профессора Вальджита Дилло, профессора эндокринологии и метаболизма

, препарат, использованный в исследовании, принадлежит к группе, известной как антагонисты (блокаторы) NKB, которые были разработаны для лечения шизофрении, но «лежат на полке неиспользованными».

REX

Новости здравоохранения в картинках

Врачи должны прописывать больше антидепрессантов людям с проблемами психического здоровья, результаты исследования

Исследования Оксфордского университета показали, что более миллиона дополнительных людей, страдающих психическими расстройствами, выиграют от назначения лекарств и критиковал «идеологические» причины, по которым врачи избегают этого.

Getty

Новости здоровья в картинках

Студент умер от гриппа после того, как NHS посоветовал ему оставаться дома и избегать A&E

Семья подростка, умершего от гриппа, призвала людей не откладывать посещение A&E, если они обеспокоены их симптомы. Мелисса Уайтли, 18-летняя студентка инженерного факультета из Хэнфорда в Сток-он-Трент, заболела на Рождество и через месяц скончалась в больнице.

Just Giving

Новости здравоохранения в картинках

Правительство рассмотрит тысячи вредных вагинальных сетчатых имплантатов

Правительство обязалось рассмотреть десятки тысяч случаев, когда женщинам ввели вредные вагинальные сетчатые имплантаты.

Getty

Новости здравоохранения в фотографиях

Джереми Хант объявляет «нулевые суицидальные амбиции» для NHS

NHS будет предложено пойти дальше, чтобы предотвратить смерть пациентов, находящихся на ее лечении, в рамках «нулевых суицидальных амбиций» запускается сегодня

Getty

Новости здравоохранения в фотографиях

Испытания на людях начинаются с лечения рака, которое заставляет иммунную систему убивать опухоли

Начались испытания на людях новой терапии рака, которая может стимулировать иммунную систему к уничтожению опухолей.Лечение, которое работает аналогично вакцине, представляет собой комбинацию двух существующих лекарств, крошечные количества которых вводятся в твердую массу опухоли.

Нефрон

Новости здравоохранения в фотографиях

По данным крупного исследования, здоровье младенцев ухудшается из-за того, что они рождаются вблизи мест гидроразрыва пласта веса, которые увеличивают их шансы на астму, СДВГ и другие проблемы

Getty

Новости здоровья в картинках

Национальная служба здравоохранения рассматривает тысячи результатов мазков на рак шейки матки после того, как женщинам ошибочно дали все результаты

На рассмотрении находятся тысячи результатов скрининга на рак шейки матки после неудач в лаборатории это означало, что некоторым женщинам было неправильно дано полное разрешение.Некоторым женщинам уже было предложено связаться со своими врачами после выявления «процедурных проблем» в услугах, предоставляемых Первой лабораторией патологии.

Rex

Новости здравоохранения в картинках

Ученые обнаружили потенциальный ключ к остановке распространения рака груди

Большинство пациентов с раком груди умирают не от первоначальной опухоли, а от вторичных злокачественных новообразований (метастазов), в которых раковые клетки способны размножаться. попасть в кровь и выжить, чтобы вторгнуться в новые места.Аспарагин, молекула, названная в честь спаржи, где она была впервые обнаружена в больших количествах, теперь является важным ингредиентом для опухолевых клеток, которые приобретают эти мигрирующие свойства.

Getty

Новости здравоохранения в картинках

Рекордное количество вакансий медсестер в NHS, объявлено более 34 000 должностей

В настоящее время NHS объявляет рекордное количество медсестер и акушерок, при этом более 34 000 должностей в настоящее время вакантны. по последним данным.Спрос на медсестер в период с июля по сентябрь 2017 года был на 19 процентов выше, чем за тот же период два года назад.

REX

Новости здравоохранения в картинках

Экстракт каннабиса может обеспечить «новый класс лечения» психоза

КБД оказывает в целом противоположный эффект дельта-9-тетрагидроканнабинолу (ТГК), главному активному компоненту каннабиса и этого вещества. это вызывает паранойю и беспокойство.

Getty

Новости здравоохранения в картинках

Более 75 000 подписали петицию с призывом к Virgin Care Ричарда Брэнсона вернуть деньги на выплату компенсации в NHS

Компания г-на Брэнсона подала в суд на NHS в прошлом году после того, как проиграла контракт на 82 миллиона фунтов стерлингов на предоставление детских услуг. здравоохранения в графстве Суррей, ссылаясь на озабоченность по поводу «серьезных недостатков» в способе заключения контракта. число людей, принятых на обучение сестринскому делу в Англии, упало на 3% в 2017 году, в то время как число принятых в Уэльсе и Шотландии, где сохранялись стипендии, увеличилось на 8.4 процента и 8 процентов соответственно

Getty

Новости здравоохранения в картинках

Примечательное исследование связывает жесткую экономию тори с 120 000 смертей

В документе установлено, что за первые четыре года эффективности под руководством тори умерло на 45 000 больше, чем могло бы быть. ожидались, если бы финансирование осталось на предвыборном уровне. По этой траектории к концу 2020 года число дополнительных смертей может вырасти почти до 200 000, даже с учетом дополнительного финансирования, выделенного на услуги государственного сектора в этом году.

Reuters

Новости здоровья в фотографиях

Длительные поездки на работу несут риски для здоровья

Часы в пути могут быть утомительно скучными, но новое исследование показывает, что это также может отрицательно сказаться как на вашем здоровье, так и на производительности на работе. Более длительные поездки на работу также оказывают значительное влияние на психическое благополучие: те, кто ездит на работу дольше, на 33% чаще страдают от депрессии

Shutterstock

Новости здоровья в картинках

Вы не можете быть в хорошей форме и толстым

Невозможно иметь избыточный вес и быть здоровым, говорится в новом крупном исследовании.Исследование с участием 3,5 миллионов британцев показало, что даже «метаболически здоровые» люди с ожирением все еще подвержены более высокому риску сердечных заболеваний или инсульта, чем люди с нормальным весом

Getty

Новости здоровья в картинках

Депривация сна

Когда вы чувствуете себя особенно истощенным, вам определенно может казаться, что вам не хватает умственных способностей. Новое исследование показало, что это может быть связано с тем, что хроническое недосыпание может фактически заставить мозг поедать сам себя

Shutterstock

Новости здоровья в картинках

Занятия с упражнениями, предлагающие 45-минутный сон, запуск

Тренажерные залы Дэвида Ллойда запустили новое здоровье и фитнес-класс, который, по сути, представляет собой группу людей, вздремнувших по 45 минут.Фитнес-группа подтолкнула к запуску уроки «наперсника» после того, как исследования показали, что 86% родителей заявили, что они устали. Таким образом, класс в основном ориентирован на родителей, но на самом деле вам не обязательно иметь детей, чтобы принять в нем участие

Getty

Новости здоровья в картинках

«Основное право на здоровье» будет отменено после Брексита, предупреждают юристы

Табак и алкоголь компаниям будет легче выиграть в судебных делах, таких как недавняя битва за простую упаковку сигарет, если будет отменена Хартия основных прав ЕС, сказал барристер и профессор общественного здравоохранения

Getty

Новости здравоохранения в картинках

«Тысячи умирают» из-за страха перед несуществующими побочными эффектами статинов

Новое крупное исследование побочных эффектов препаратов, снижающих уровень холестерина, предполагает, что общие симптомы, такие как мышечная боль и слабость, не вызваны самими препаратами

Getty

Новости здравоохранения в картинках

Дети, рожденные от отцов в возрасте до 25 лет, имеют более высокий риск аутизма

Новое исследование показало, что новорожденные Отцы в возрасте до 25 лет и старше 51 подвержены более высокому риску развития аутизма и других социальных расстройств.Исследование, проведенное Сиверским центром исследования и лечения аутизма на горе Синай, показало, что эти дети в младенчестве на самом деле более продвинуты, чем их сверстники, но затем отстают к тому времени, когда они достигают подросткового возраста

Getty

Новости здравоохранения в картинках

Езда на велосипеде на работу «может вдвое снизить риск рака и сердечных заболеваний»

Пассажиры, которые меняют свой проездной на машину или автобус на велосипед, могут снизить риск развития сердечных заболеваний и рака почти вдвое, как показывают новые исследования, — но участники кампании предупредили, что по-прежнему существует «острая необходимость» в улучшении дорожных условий для велосипедистов.По данным исследования четверти миллиона человек, езда на велосипеде на работу снижает риск развития рака на 45 процентов и сердечно-сосудистых заболеваний на 46 процентов. Исследователи из Университета Глазго обнаружили, что ходьба на работу также приносит пользу здоровью, но не в такой степени, как езда на велосипеде.

Getty

Клещи также могут переносить другие болезни, в том числе болезнь Лайма.

Д-р Ник Фин из PHE сказал: «Это первые результаты исследований, которые указывают на необходимость дальнейшей работы.Однако риск для населения в настоящее время оценивается как очень низкий ».

У большинства людей, зараженных вирусом энцефалита, симптомы гриппа отсутствуют или проявляются только в легкой форме, но они могут поражать мозг и центральную нервную систему и иногда приводить к летальному исходу. Вакцина от клещевого энцефалита доступна в частном порядке.

Вирус клещевого энцефалита уже присутствует в континентальной Европе и некоторых частях Азии.

Считается, что зараженные клещи могли попасть в Великобританию через перелетных птиц.

«Мы напоминаем людям, чтобы они были внимательны к клещам и принимали меры предосторожности, особенно при посещении или работе в местах с высокой травой, таких как леса, вересковые пустоши и парки», — сказал доктор Фин Би-би-си.

Поддерживать свободомыслящую журналистику и посещать независимые мероприятия

Национальная служба здравоохранения сообщает, что укусы клещей можно предотвратить, прикрыв кожу во время прогулки на свежем воздухе, используя существующие тропы и природные тропы, нанося репелленты от насекомых и проверяя свою одежду и волосы после прогулки .

Дополнительный отчет Press Association

Вакцинация мРНК вызывает устойчивость к клещам и предотвращает передачу возбудителя болезни Лайма

История

Получено: 15 июня 2021 г.

Принято: 22 сентября 2021 г.

Опубликовано в Интернете: 17 ноября 2021 г.

Благодарности

Мы благодарим MMH Sung и YK Tam из Acuitas (Ванкувер, Канада) за подготовку наночастиц мРНК.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами NIH [AI152206 (E.F.), AI126033 (E.F. и S.N.) и AI138949 (U.P., E.F. и S.N.)] и Фонд Стивена и Александры Коэн (E.F.).

Вклад авторов: Эта работа была задумана с помощью иммунизации морских свинок и мышей AS, JM, GA, SN, DW и EF, заражения клещами и экспериментов по передаче B. burgdorferi , проведенных AS, JM, CK, KD, GL, NOS и SN КПЦР и культивирование B. burgdorferi были выполнены A.S., J.M., K.D., S.N. и M.-Дж.В. Экспрессия и очистка белков, а также ELISA были выполнены A.S., G.A., M.-J.W. и S.N. Выделение, секвенирование и анализ РНК были выполнены G.A. и X.T. Выделение PBMC и экспрессию цитокинов было выполнено G.A. и, как. мРНК LNP были разработаны и созданы E.F., N.P. и D.W. Анализ и интерпретация данных были выполнены A.S., J.M., G.A., X.T., N.P., U.P., S.N., D.W. и E.F. Рукопись была составлена ​​A.S., J.M., G.A. и E.F., а затем проверена и изменена всеми авторами.

Конкурирующие доли участия: E.F. имеет долю в капитале и выступает в качестве консультанта L2 Diagnostics. Липид и композиция LNP описаны в патенте США US 10,221,127. Д.У., Э.Ф. и С.Н. являются соавторами заявки на патент (US 63/234 508), озаглавленной «МРНК-вакцины против белков слюны клещей и способы их использования». Остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.