Диагностические препараты.
Лечебные сыворотки.
19. Противокоревой гаммаглобулин служит для создания искусственного пассивного иммунитета
с целью лечения и профилактики кори. Препарат готовят из сыворотки крови доноров,
плацентарной и абортной крови. В связи с тем, что смесь большого количества сывороток ,
используемая для приготовления данной серии, содержит антитела не только против кори, но и
других заболеваний, противокоревой гаммаглобулин может быть использован для профилактики
гепатита, коклюша полиомиелита и других инфекций, после перенесения которых в организме
человека сохраняется длительный иммунитет.
20. Противогриппозная сыворотка с сульфаниламидами служит для создания искусственного
пассивного иммунитета с целью профилактики и лечения гриппа. Сыворотку получают от
лошадей, гипериммунизированных вирусами гриппа наиболее часто встречающихся типов А-2 и
В.Введение в состав сыворотки сульфаниламидов позволяет предотвратить развитие вторичной
применения.
21. Антирабический гаммаглобулин служит для создания искусственного пассивного иммунитета
с целью профилактики бешенства.Получают гаммаглобулин методами фракционного осаждения
сернокислым аммонием и спиртом из сывороток лошадей, гипериммунизированных
фиксированным вирусом бешенства.
22. Противодифтерийная сыворотка служит для создания искусственного пассивного
антитоксического иммунитета с целью лечения и профилактики дифтерии. Антитоксическую
противодифтерийную сыворотку получают гипериммунизацией лошадей дифтерийным
анатоксином. За титр антитоксической сыворотки принимают количество антитоксических (АЕ)
минимальное количество сыворотки, которое нейтрализует 100 ДЛМ дифтерийного экзотоксина.
Для очистки сыворотки принимают методы ферментации и диализа (Диаферм).
23.Противостолбнячная сыворотка ( см. противодифтерийная сыворотка).
24. Противоботулиническая сыворотка тип С служит для создания искусственного пассивного
иммунитета с целью лечения и профилактики ботулизма, вызванного палочкой ботулизма типа С.(
далее см. противодифтерийная сыворотка).
Диагностические препараты.
25. Агглютинирующая бруцеллезная сыворотка применяется для постановки реакции
кролика,гипериммунизированного взвесью убитых бруцелл. За титр агглютинирующей сыворотки
принимают то ее наибольшее разведение, которое дает агглютинацию соответствующего
возбудителя. При постановке развернутой реакции агглютинации с указанной сывороткой
реакцию считаю положительной, если получают агглютинацию в разведении, равном
титру,указанном на ампуле или в половине этого титра.
26. Агглютинирующая адсорбированная дизентерийная сыворотка применяется для постановки
реакции агглютинации с целью сероидентификации дизентерийных бактерий.Получают
видов. Адсорбированная сыворотка лишена групповых антител, что достигается методом
истощения по Кастеллани.Препарат предназначен для постановки реакции агглютинации на
стекле.
27. Холерная агглютинирующая сыворотка «О» применяется для постановки реакции
агглютинации с целью определения принадлежности идентифицируемого вибриона к группе
возбудителей холеры. Далее см. агглютинирующая бруцеллезная сыворотка.
28. Преципитирующая сыворотка дизентерийная Флекснера применяется в реакции преципитации
с целью сероиндикации дизентерийного гаптена. Получают сыворотку от кроликов,
принимают то наибольшее разведение антигена, в присутствии которого еще идет реакция преципитации.
29. Противоперфрингенс сыворотка тип «Д» применяется в реакции нейтрализации с целью сероидентификации возбудителя газовой гангрены — клостридиум перфрингенс тип Д. Для постановки этой реакции сыворотку смешивают с бульонной культурой идентифицируемых бактерий и вводят белой мышке. В качестве контроля используют фильтрат культуры в смеси с физиологическим раствором. Выживание мыши в опыте и гибель в контроле позволяет определить вид и серотип испытуемого возбудителя. За титр диагностической антитоксической сыворотки принимают то количество антитоксических ( АЕ) единиц, которое содержится в 1 мл сыворотки.
30. Противогриппозная диагностическая сыворотка тип А2 применяется для постановки реакции торможения гемагглютинации с целью сероидентификации вируса гриппа типа А2 в аллантоисной жидкости зараженного куриного эмбриона или вируссодержащей жидкости на культуре тканей. Сыворотку получают от крыс, гипериммунизированных вирусом гриппа типа А2.
31. Люминесцирующая бруцеллезная сыворотка применяется для постановки прямого
люминесцентно-серологического метода с целью сероидентификации бруцелл. Сыворотка
представляет собой высушенную лиофильным способом глобулиновую фракцию иммунной
сыворотки, к которой химическим путем присоеденен флюоресцирующий краситель. При
части спектра.
32. Гемолитическая сыворотка применяется для постановки реакции связывания комплемента (РСК) в составе индикаторной гемолитической системы. Гемолитическую сыворотку получают от кроликов, гипериммунизированных эритроцитами барана. За титр гемолитической сыворотки принимают то ее наибольшее разведение, в присутствии которого комплемент дает полный гемолиз эритроцитов барана. В РСК гемолитическую сыворотку берут в рабочей дозе, которая в 3 раза превышает титр.
33. Комплемент — это свежая сыворотка морской свинки. Препарат используют для постановки РСК. Перед постановкой РСК комплемент титруют. За титр комплемента принимают то его наименьшее количество, которое дает полный гемолиз эритроцитов барана, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. В реакцию комплемент берут в рабочей дозе, которая на 20-30% превышает титр.
34. Диагностикум из сальмонелл паратифа В применяется для постановки реакции агглютинации (Видаля) с целью серодиагностики брюшного тифа. Препарат представляет собой взвесь убитых бактерий паратифа В. Диагностический титр реакции Видаля 1:200.
35. Брюшнотифозный диагностикум «О» см. пункт 36.
36. Брюшнотифозный диагностикум «Н» применяется для постановки реакции агглютинации (Видаля) с целью серодиагностики брюшного тифа. Преобладание титра «О» антител, выявленная реакция Видаля с названными диагностикумами, позволяет расценить реакцию как «инфекционный Видаль» (человек болен в настоящее время).Преобладание же титра «Н» антител говорит об «анамнестическом Видале»( человек перенес брюшной тиф в прошлом).
37. Единый бруцеллезный диагностикум применяется для постановки реакции агглютинации ( в пробирках — Райта и на стекле — Хеддельсона) с целью серодиагностики бруцеллеза.Диагностикум представляет собой взвесь убитых нагреванием микробов, подкрашенных анилиновым красителем для удобства учета реакции. Диагностический титр реакции Райта — 1:200.
38.Эритроцитарный ВИ-диагностикум применяется для постановки реакции пассивной гемагглютинации с целью серодиагностики брюшнотифозного бактерионосительства. Препарат представляет собой взвесь танизированных эритроцитов человека 1 группы с адсорбированным на них брюшнотифозным ВИ — антигеном.
39. Гриппозный диагностикум А 2 применяется для постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с целью серодиагностики гриппа. Учитывая частоту гриппозной
инфекции, РТГА ставится с парными сыворотками, причем нарастание титра антител в сыворотке больного должно быть не менее, чем в 4 раза.
40. Антиген кардиолипиновый для реакции Вассермана применяется для постановки РСК с целью серодиагностики сифилиса. Антиген неспецифический, представляет собой липидный экстракт мышцы сердца быка. Титром антигена считают то его наибольшее количество , в присутствии которого комплемент дает полный гемолиз эритроцитов барана, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. Рабочая доза антигена составляет половину титра.
41. Антиген Кана применяется для постановки осадочной реакции Кана с целью серодиагностики сифилиса.Антиген неспецифический, представляет собой липидный экстракт мышцы сердца быка,адсорбированный на холестерине.
42. Токсоплазменный антиген для РСК применяется для постановки РСК с целью
серодиагностики токсоплазмоза.Антиген представляет собой экстракт из токсоплазм.
43. Токсин Шика применяется для постановки внутрикожной антитоксической пробы (Шика) с
экзотоксин дифтерийной палочки, который вводится внутрикожно в количестве 1:40ДЛМ. При
наличии противодифтерийного антитоксического иммунитета на месте введения токсина реакции
не наблюдается. При отсутствии в организме антител против дифтерийного экзотоксина на месте
введения препарата будет наблюдаться покраснение.
44.Бруцеллин применяется для постановки внутрикожной (аллергической пробы) Бюрне с целью выявления состояния сенсибилизации к бруцеллам.Препарат представляет собой фильтрат бульонной культуры бруцелл, убитых нагреванием.
45. Тулярин накожный применяется для постановки аллергической скарификационной пробы с
целью выявления состояния сенсибилизации к возбудителю туляремии. Препарат представляет
собой взвесь туляремийных бактерий, убитых нагреванием.
46. Антраксин применяется для постановки аллергической внутрикожной пробы с целью
выявления состояния сенсибилизации к бациллам сибирской язвы. Препарат представляет собой
продукт гидролиза сибириязвенных возбудителей.
47. Токсоплазменный аллерген применяется для постановки аллергической внутрикожной пробы с целью выявления сенсибилизации к токсоплазмам.Препарат представляет собой антигенный комплекс,полученный из перитонеального экссудата белых мышей, зараженных токсоплазмами.
48. Туберкулин очищенный применяется для постановки аллергических проб — скарификационной (проба Пирке) и внутрикожной (проба Манту) с целью выявления состояния сенсибилизации к возбудителям туберкулеза. Препарат готовят из фильтрата культуры туберкулезных микобактерий с последующей очисткой физико-химическими методами.
49. Человеческий лейкоцитарный интерферон предназначен для лечения и профилактики гриппа и других вирусных респираторных заболеваний. Это белок, синтезируемый лейкоцитами человека в ответ на воздействие вируса. Интерферон действует практически на все вирусы, угнетая их размножение в чувствительных клетках.
50. Дизентерийный бактериофаг — это вирус бактерий применяется для лечения и профилактики дизентерии. Препарат получают из фильтрата бульонных культур дизентерийных бактерий, зараженных бактериофагом. Предназначен для перорального применения в виде таблеток с кислотоустойчивой оболочкой.
51. Индикаторный дизентерийный бактериофаг применяется для постановки реакции нарастания титра фага с целью фагодиагностики дизентерии. Препарат представляет собой фильтрат бульонной культуры дизентерийных бактерий, зараженных бактериофагом. Титром бактериофага, определенного методом Грациа, считают количество частиц бактериофага,содержащихся в том его разведении, которое дает лизис дизентерийных бактерий.
©2015 arhivinfo.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.
Диагностические сыворотки
Иммунные диагностические сыворотки получают из крови животных (в основном кроликов), иммунизированных соответствующими бактериями или антигенами.
Ι. Агглютинирующие сыворотки
Агглютинирующую сыворотку получают гипериммунизацией кроликов взвесью бактерий. В сыворотке определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение ее, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом. Агглютинирующие неадсорбированные сыворотки применяются при идентификации бактерий сначала в ориентировочной реакции агглютинации на стекле, далее в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.
1. Агглютинирующая неадсорбированная брюшнотифозная сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью S.enterica var. typhi. Применяется для серологической идентификации возбудителя брюшного тифа в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики брюшного тифа и паратифов.
2. Агглютинирующая неадсорбированная паратифозная В (паратифозная А) сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью S. enterica var.paratyphi B (var.paratyphi A). Применяется для серологической идентификации возбудителя паратифа В (паратифа А) в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики брюшного тифа и паратифов.
3. Агглютинирующая неадсорбированная сальмонелезная сыворотка Бреслау получается путем гипериммунизации животных взвесью S. typhimurium Breslau. Применяется для серологической идентификации сальмонелл Бреслау в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики сальмонеллезов.
4. Агглютинирующая неадсорбированная дизентерийная сыворотка Флекснера (Зонне) получается путем гипериммунизации животных взвесью шигелл Флекснера (Зонне). Применяется для серологической идентификации шигелл Флекснера (Зонне) в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики бактериальной дизентерии.
5. Агглютинирующая неадсорбированная поливалентная эшнрихиозная ОКВ сыворотка представляет собой смесь типовых эшерихиозных ОК сывороток О111:К58, О55:К59, О26:К60, О20:К84. Применяется в бактериологическом методе диагностики колиэнтерита в ориентировочной реакции агглютинации на стекле при отборе окрашенных колоний, выросших на средах Эндо или Левина, подозрительных на энтеропатогенные серовары.
6. Агглютинирующие неадсорбированные типовые эшерихиозные ОК сыворотки (О111, О55 и др.) получают путем гипериммунизации животных взвесью энтеропатогенных эшерихий соответствующего серовара. Применяются для серологической идентификации энтеропатогенных эшерихий в ориентировочной реакции агглютинации на стекле, далее в развернутой реакции агглютинации с живой культурой для определения термолабильного К- антигена и с кипяченой культурой для определения термостабильного О-антигена. Используются в бактериологическом методе диагностики колиэнтеритов.
7. Агглютинирующая неадсорбированная холерная О1 сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью убитых возбудителей холеры. Применяется для серологической идентификации холерных вибрионов в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики холеры.
8. Агглютинирующая неадсорбированная бруцеллезная сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью бруцелл. Применяется для серологической идентификации бруцелл в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики бруцеллеза.
9. Агглютинирующая неадсорбированная туляремийная сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью туляремийных бактерий. Применяется для серологической идентификации возбудителя туляремии в реакции агглютинации. Используется в биобактериологическом методе диагностики туляремии.
10. Агглютинирующая неадсорбированная противодифтерийная сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью возбудителей дифтерии. Применяется для серологической идентификации коринебактерий дифтерии в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики дифтерии.
11. Агглютинирующая неадсорбированная коклюшная сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью возбудителей коклюша. Применяется для серологической идентификации возбудителей коклюша в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики коклюша.
12. Агглютинирующая неадсорбированная паракоклюшная сыворотка паракоклюша. Применяется для серологической идентификации возбудителей паракоклюша в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики паракоклюша.
13. Агглютинирующая неадсорбированная лептоспирозная сыворотка получается путем гипериммунизации животных взвесью лептоспир. Применяется для серологической идентификации лептоспир в реакции агглютинации. Используется в бактериологическом методе диагностики лептоспироза.
В настоящее время многие агглютинирующие сыворотки выпускаются адсорбированными монорецепторными, содержащими только специфические антитела-рецепторы, которые соответствуют определенному виду микроорганизма. Эти сыворотки используются только в реакции агглютинации на стекле и не требуют последующего разведения, т.е постановки развернутой реакции агглютинации.
Для получения таких сывороток применяют метод Кастелляни – метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция только групповых антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки – сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену.
1. Адсорбированная сальмонеллезная О сыворотка рецептор 9 получается путем гипериммунизации животных взвесью убитых нагреванием сальмонелл группы D (например, S. enterica var. typhi). Полученная сыворотка содержит рецепторы 1, 9, 12. Далее проводят адсорбцию групповых рецепторов 1, 12 по методу Кастелляни. Применяется для определения групповой принадлежности сальмонелл к группе D в реакции агглютинации на стекле. Используется в бактериологическом методе диагностики тифо-паратифозных заболеваний и сальмонеллезной инфекции.
2. Адсорбированная сальмонеллезная О сыворотка рецептор 4 получается путем гипериммунизации животных взвесью убитых нагреванием сальмонелл группы В (например S. enterica var.paratyphi B). Полученная сыворотка содержит рецепторы 1, 4, 5, 12. Далее проводят адсорбцию групповых рецепторов 1, 5, 12 по методу Кастелляни. Применяется для определения групповой принадлежности сальмонелл к группе В в реакции агглютинации на стекле. Используется в бактериологическом методе диагностики тифопаратифозных заболеваний и сальмонеллезной инфекции.
3. Адсорбированная сальмонеллезная Н сыворотка рецептор d получается путем гипериммунизации животных взвесью живой культуры S. enterica var. typhi . Полученная сыворотка содержит О рецепторы 1, 9, 12, Vi и H рецептор d. Далее проводят адсорбцию групповых рецепторов 1, 9, 12, Vi по методу Кастелляни. Применяется для определения видовой принадлежности сальмонелл к виду S. enterica var. typhi в реакции агглютинации на стекле. Используется в бактериологическом методе диагностики тифопаратифозных заболеваний.
4. Адсорбированная сальмонеллезная Н сыворотка рецептор i получается путем гипериммунизации животных взвесью живой культуры S.typhimurium Breslau. Полученная сыворотка содержит рецепторы О 1, 4, 5, 12 и H рецепторы i, 1, 2. Далее проводят адсорбцию групповых О рецепторов 1, 4, 5, 12 и Н рецепторов 1, 2 по методу Кастелляни. Применяется для определения видовой принадлежности сальмонелл к виду S. typhimurium Breslau в реакции агглютинации на стекле. Используется в бактериологическом методе диагностики сальмонеллезной инфекции.
I. Учтите и оцените результаты РИФ с синовиальной жидкостью обследуемого с подозрением на бруцеллез и люминесцирующей бруцеллезной сывороткой
Педиатрия
ЗАНЯТИЕ 23
Тема: Микробиологическая диагностика бруцеллеза.
Цель: На основе знаний биологии бруцелл, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновывать тактику микробиологической диагностики, специфическую профилактику и терапию бруцеллеза.
Знать:
1. Правила работы с возбудителями особо опасных инфекций.
2. Классификацию, морфо-биологические особенности возбудителей бруцеллеза.
3. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при бруцеллезе.
4. Материал и методы микробиологической диагностики бруцеллеза.
5. Специфическую профилактику и терапию бруцеллеза.
Уметь:
1. Провести экспресс-диагностику бруцеллеза (РИФ).
2. Провести серо-аллергическую диагностику бруцеллеза.
Контрольные вопросы:
1. Критерии принадлежности бруцеллеза к группе особо опасных инфекций. Правила ТБ при работе с бруцеллами, как возбудителями ООИ.
2. Классификация и морфо-биологические особенности возбудителей бруцеллеза.
3. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при бруцеллезе.
4. Материал и методы микробиологической диагностики бруцеллеза.
5. Специфическая профилактика и терапия бруцеллеза.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Учесть и оценить результаты РИФ с синовиальной жидкостью обследуемого с подозрением на бруцеллез и люминесцирующей бруцеллезной сывороткой. Сделать заключение.
2. Провести серо-аллергическую диагностику бруцеллеза:
2.1.Поставить, учесть и оценить результаты реакции Хеддлсона с сыворотками обследуемых.
2.2.Учесть и оценить результаты реакции Райта с сыворотками тех же обследуемых.
2.3.Учесть и оценить результаты кожно-аллергической пробы Бюрне (см. муляж).
3. Изучить и описать биопрепараты: живая бруцеллезная вакцина, лечебная бруцеллезная вакцина, бруцеллин, люминесцирующая бруцеллезная сыворотка, бруцеллезный диагностикум.
4. Контрольная работа: зоонозные инфекции (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва).
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
I. Учтите и оцените результаты РИФ с синовиальной жидкостью обследуемого с подозрением на бруцеллез и люминесцирующей бруцеллезной сывороткой.
Бруцеллез характеризуется многообразием клинических проявлений. Среди поражений доминируют нарушения опорно-двигательного аппарата, нервной и половой систем.
С целью экспресс-диагностики заболевания из исследуемого материала (синовиальной жидкости, пунктата костного мозга, СМЖ и др.) готовят препараты, которые изучают с помощью РИФ. Обнаружение в исследуемом материале светящихся мелких палочек или коккобактерий является основанием для предварительного диагноза «бруцеллез».
Бруцеллез относится к группе ООИ, поэтому исследование, предусматривающее работу с возбудителем, проводится только в специальных лабораториях.
II. Проведите серо-аллергическую диагностику бруцеллеза:
В обычной бактериологической лаборатории основой микробиологической диагностики бруцеллеза являются серологический и аллергический методы.
Серологический метод при бруцеллезе включает комплекс серологических реакций: РА, РНГА, РСК, РИФн, р. Кумбса, ОФР. Из вышеперечисленных реакций широко используется РА в 2-х модификациях: РА на стекле (р. Хеддлсона) и РА в развернутом ряду (р. Райта).
РА Хеддлсона используется при массовых обследованиях. Преимущества этой реакции заключаются в простоте ее постановки, быстроте получения результата, высокой чувствительности и специфичности. Чувствительность реакции обусловлена тем, что ее ставят с неразведенной сывороткой и концентрируемым диагностикумом. Это дает возможность выявлять специфические антитела, находящиеся в сыворотке в низких титрах. Для определения титра антител и динамики их накопления реакцию агглютинации проводят объемным методом в пробирках.
Аллергизация организма при заболевании бруцеллезом позволяет использовать аллергический метод (в/к проба Бюрне).
При этом разная степень информативности этих методов при острых и хронических формах, в разные периоды заболевания определяет большую диагностическую ценность комплексной серо-аллергической диагностики.
2.1. Поставьте, учтите и оцените результаты реакции Хеддлсона с сыворотками обследуемых.
Методика постановки: обезжиренное предметное стекло размером 9х12 см расчерчивают на 6 квадратов. В первом квадрате записывают номер сыворотки; в последующие квадраты вносят ингредиенты согласно таблице 1.
Таблица 1.
Схема постановки РА Хеддлсона
| № пп | Ингредиент, мл | К в а д р а т | ||||
| 4 (КС) | 5 (КА) | |||||
| 1. | Физ. раствор | — | — | — | 0,03 | 0,03 |
| 2. | Сыворотка | 0,04 | 0,02 | 0,01 | 0,02 | — |
| 3. | Диагностикум | 0,03 | 0,03 | 0,03 | — | 0,03 |
Примечание: физ. раствор, а затем сыворотка вносятся микропипеткой, диагностикум – пастеровской пипеткой.
Содержимое квадратов перемешивают, аккуратно покачивая стекло. Затем стекло равномерно подогревают над пламенем спиртовки до 37° около 2 мин. Стекло необходимо держать высоко над пламенем, чтобы капли не высыхали.
Критерии учета: в случае положительной реакции в первые же минуты появляются хлопья голубого или фиолетового цвета, т. к. бруцеллезный диагностикум окрашен метиленовой синькой или генцианвиолетом. Степень выраженности реакции должна быть не менее ++. Максимальный срок наблюдения 8 мин.
Критерии достоверности: в КС и КА должна отсутствовать спонтанная агглютинация.
Критерии оценки:
— отсутствие агглютинации со всеми дозами сыворотки – результат отрицательный;
— положительная агглютинация с дозой сыворотки 0,04 мл – результат сомнительный;
— положительная агглютинация с дозами сыворотки 0,02-0,01 мл – результат положительный;
— положительная агглютинация на 4 креста со всеми дозами сыворотки – результат резко положительный.
Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный и резко положительный результаты. В этом случае РА ставится в развернутом ряду (р. Райта).
2.2. Учтите и оцените результаты реакции Райта с сыворотками тех же обследуемых.
Реакция Райта ставится с разведениями сыворотки обследуемого и бруцеллезным диагностикумом, разведенным 1:10. Пробирки термостатируют при 37°С в течение 24 ч. Учет осуществляют по обычной схеме (см. занятие № 10). Диагностический титр реакции равен 1:200. При отрицательном или сомнительном результатах рекомендуется через 7-10 дней повторить реакцию.
Реакция Райта может быть положительной не только у больных, но у вакцинированных и переболевших, поэтому для определения инфекционной природы антител проводится исследование парных сывороток. Нарастание титра антител в 2 и более раз является достоверным серологическим подтверждением заболевания бруцеллезом.
2.3. Учтите и оцените результаты кожно-аллергической пробы Бюрне (см. муляж).
Обследуемому в / к вводят в область предплечья 0,1 мл бруцеллина. Учет реакции проводят через 24 и 48 ч, отмечая при этом размер папулы в см (длина и ширина), наличие гиперемии и болезненности по следующей схеме:
— папула отсутствует – отрицательная реакция;
— папула не больше 1х1 см – сомнительная реакция;
— папула размером 1х1-2,5х2,5 см – слабо положительная реакция;
— папула размером 3х3-4х4 см – положительная реакция;
— папула размером 6х6 см – резко положительная реакция.
При оценке результатов необходимо учитывать, что она может быть положительной не только у больных, но у переболевших и вакцинированных.
На основании полученных результатов реакций Хеддлсона, Райта и пробы Бюрне с учетом клинических и эпидемиологических данных сделайте вывод и заполните бланк-направление и бланк-ответ из лаборатории.
III. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты, указав, что они содержат, для чего и как применяются.
IV. При подготовке к контрольной работе по теме «Зоонозные инфекции (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва)» рекомендуется придерживаться следующего плана:
1. Таксономия возбудителя: для бактерий — семейство, род, вид.
2. Характеристика бактериального возбудителя: морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, антигенные свойства, факторы патогенности, резистентность к различным факторам.
3. Вызываемые заболевания: экология, краткая эпидемиологическая характеристика (источники инфекции, механизм, пути и факторы передачи, восприимчивый коллектив), патогенез, основные клинические проявления, особенности иммунитета.
4. Микробиологическая диагностика: исследуемый материал, применяемые методы диагностики; их обоснование.
5. Специфическая профилактика и терапия (вакцины, сыворотки).
Вопросы для самоконтроля:
1. Назовите основные виды бруцелл, вызывающие бруцеллез. Какой из них является наиболее вирулентным для человека.
2. Назовите и обоснуйте меры предосторожности при работе с возбудителями бруцеллеза или / и материалом от больных бруцеллезом.
3. Обоснуйте необходимость проведения противоэпидемических мероприятий в случае контакта с больными бруцеллезом.
4. Назовите методы микробиологической диагностики, которые можно использовать в обычной лаборатории. В чем их суть?
5. Назовите особенности выделения гемокультуры при бруцеллезе.
6. Тактика проведения неспецифической и специфической профилактики при бруцеллезе для лиц, проживающих в городской местности.
7. Тактика проведения неспецифической и специфической профилактики при бруцеллезе для лиц, проживающих в сельской местности.
Литература:
Учебники:
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 423-426, 427.
2. Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – С. 323-329.
3. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. — М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 394-396.
Лекции по микробиологии.
Тесты.
Агглютинирующая противочумная сыворотка :: Туляремийная агглютинирующая сыворотка
Люминесцирующие противочумные антитела – АТ к чумному АГ, полученные путем иммунизации лабораторных животных корпускулярным чумным АГ с последующим присоединением к Ig люминесцирующей метки. Используется в сероиндикации – РИФ: исследуемый материал + люминесцирующие противочумные АТ. Ставится на стекле. Учет в люминесцентном микроскопе.
Суспензионные противочумные антитела – АТ к АГ Yersinia pestis, полученные путем иммунизации лабораторных животных корпускулярным чумным АГ с последующей адсорбцией Ig Fc-фрагментом на эритроцитах 1 группы крови человека, предварительно обработанных формалином или танином для улучшения адсорбционных свойств. Живая туляремийная вакцина – содержит живые микроорганизмы туляремийного вакцинного (аттенуированного) штамма 15 линии НИИЭГ, полученные путем выращивания на искусственной питательной среде, затем высушивания взвеси под вакуумом. Используется для профилактики туляремии по эпидемиологическим показаниям.
Туберкулин – очищенный белок из микобактерий туберкулеза – ППД-Л (пурин-протеин-дериват Линниковой). Используется в методе кожно-аллергических проб – реакция Манту. Вводят внутрикожно, учет через 72 часа. Об инфицировании судят по виражу туберкулиновой пробы (учет по туберкулиновому ряду в динамике). Нормэргическая проба 5-16 мм.
Вакцина БЦЖ – содержит живые микобактерии аттенуированного штамма БЦЖ-1, лиофильно высушенные в 1,5% растворе глютамата натрия. Используется для плановой профилактики туберкулеза. Вводят строго внутрикожно в объеме 0,1 мл на границе верхней и нижней трети наружной поверхности левого плеча. Вакцинируются все новорожденные на 5-7-й день жизни; ревакцинация проводится только детям с отрицательной туберкулиновой пробой в 6-7 лет или 14-15 лет. Агглютинирующая дифтерийная сыворотка – АТ к АГ Corynebacterium diphtheriae, полученные путем иммунизации лабораторных животных корпускулярным дифтерийным АГ с последующим удалением ненужных АТ адсорбцией по Кастеляне. Используется в сероидентификации – РА: чистая культура + агглютинирующая дифтерийная сыворотка. Ставится на стекле. Учет визуальный по выпадению хлопьев.
Токсин Шика – высокоочищенный экзотоксин (гистотоксин) Corynebacterium diphtheriae. Используется в методе кожно-иммунологических проб – реакция Шика с целью определения напряженности антитоксического иммунитета против дифтерии у детей. Вводится в кожу предплечья, учет пробы по диаметру зоны гиперемии и отека: менее 2 см – напряженный, более 2 см – ненапряженный (необходима ревакцинация).
АКДС – вакцина – содержит взвесь инактивированных возбудителей коклюша, дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин, адсорбированные на гидроксиде алюминия. Используется для плановой профилактики коклюша, дифтерии и столбняка у детей в возрасте от 3 месяцев до 3г. Сыворотка противодифтерийная лошадиная антитоксическая – содержит АТ (антитоксины), способные нейтрализовать действие токсина Corynebacterium diphtheriae. Для получения проводят гипериммунизацию лошадей дифтерийным анатоксином, затем их сыворотку очищают от балластных белков и концентрируют. Применяют для лечения больных дифтерией. Вводят внутримышечно по Безредко. При положительной пробе – вводят по жизненным показаниям. Также используется в 3-ем этапе бактериологического метода – идентификация чистой культуры для определения токсигенности штамма – РП в геле: чистая культура + сыворотка противодифтерийная лошадиная антитоксическая. Ставится в чашках Петри с питательной средой. Учет визуальный по образованию усов преципитации рядом с чистой культурой.
Источник: vb.userdocs.ru
Способ получения диагностической сыворотки
Изобретение предназначено для производства высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток. Животных-продуцентов пятикратно иммунизируют авирулентным антигенным материалом внутривенно. Одновременно вводят внутримышечно в качестве иммуномодулятора тималин. В третьей инъекции антигена внутримышечно вводят иммуномодулятор циклофосфан. Отделяют кровь и приготавливают сыворотку. Изобретение повышает специфическую активность диагностических сывороток, упрощает и снижает трудоемкость процесса их получения при высоком выходе целевого продукта.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток при снижении трудоемкости и отхода животных-продуцентов.
Известен способ получения диагностической бруцеллезной агглютинирующей сыворотки, заключающийся в иммунизации кроликов-продуцентов живыми вирулентными клетками Br.abortus 146 и Br.melitensis 565 четырехкратно, три раза через 1 неделю, 4-й раз через 2-3 недели, тотальном обескровливании через 2 недели после заключительной инъекции, причем первые три инъекции проводят в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Сыворотка имеет титр не ниже 1:1600. [Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая сухая. Регламент производства N 273-82. Одесское предприятие бакпрепаратов]. При использовании живой вирулентной культуры необходим строгий противоэпидемический режим, сыворотка недостаточно активна, способ трудоемок, длителен. Известен способ получения иммунных сывороток для тест-системы диагностической иммунофлуоресцентной (непрямой метод) к возбудителям зоонозов: чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы [Тюменцева И.С. «Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций». Автореферат дисс. на соискание уч.ст. доктора мед.наук, Саратов, 1996]. Схема иммунизации по этому способу включает последовательные многоточечные внутрикожные введения смеси антигенов с полным адъювантом Фрейнда. Гипериммунизация включает четыре инъекции с интервалом в шесть дней, месячный перерыв и еще четыре инъекции с шестидневным интервалом. Иммунный ответ с производственными титрами сывороток (1:256 — 1:512), определяемыми в НРИФ, отмечается лишь у 25-30% иммунизируемых кроликов по причине неравнозначного иммунного ответа на отдельные антигенные компоненты, кроме того у животных развивается адъювантная болезнь. Способ длителен и трудоемок. Известен способ получения диагностической видоспецифической чумной сыворотки [Дертева И.И. и др. Сб.научных работ в противочумных учреждениях. — Саратов, 1966, с. 151-162]. Иммунизация животных-продуцентов осуществляется тремя курсами с двухнедельными перерывами между ними. В первые два курса инъекции проводят 3-кратно через 4 суток, в третьем курсе 6 инъекций через 4 суток. В каждом курсе дозы антигена увеличивают с каждой инъекцией. Животных обескровливают на 7-9 сутки после последней инъекции. Агглютинационные титры сыворотки 1:50-1:200. Сыворотка малоспецифична, способ ее получения очень длителен и трудоемок. Известен способ получения сыворотки для производства сибиреязвенных споровых люминесцирующих иммуноглобулинов [Сыворотка диагностическая сибиреязвенная споровая люминесцирующая адсорбированная сухая. Регламент производства N 156-80 СНИПЧИ]. По этому способу иммунизацию кроликов осуществляют авирулентными спорами Bac. anthracis 10-кратно с 3-х дневными интервалами, 5 инъекций подкожно, 5 внутривенно с увеличением дозы микробов. Через 7 дней после последней инъекции проводят обескровливание и приготовление сыворотки. Производственный титр в НРИФ достигает 1:3200. Сыворотка недостаточно активна. Таким образом, все известные способы получения диагностических моно- и поливалентных сывороток имеют общие недостатки, заключающиеся в недостаточной активности получаемых сывороток, трудоемкости процесса их получения, низком выходе целевого продукта, обусловленном высокими отходами животных продуцентов, что не обеспечивает возможности организации массового производства диагностических препаратов. Наиболее близким по существу и назначению к заявленному способу является способ получения диагностических зоонозных сывороток [Патент РФ N 2010577, A 61 K 39/40, от 15.04.94 г., Бюл. N 7]. Схема иммунизации животных-продуцентов включает внутримышечное введение водно-спиртового раствора феракрила, на 5-7-й день введения в лимфоузлы смеси авирулентного антигена с феракрилом с последующей трехкратной иммунизацией этой смесью с промежутками в 4 дня внутримышечно, получение на 30-й день иммунной сыворотки, смешивание ее с антигенным материалом и последующую четырехкратную иммунизацию тех же животных комплексом Аг-Ат с промежутками в 3-4 дня внутривенно, кровопускание на 7-8-й день после последней инъекции. Специфическая активность полученных по этому способу гипериммунных сывороток в НРИФ достигает 1:512-1:2048. Количество антителообразующих кроликов-продуцентов с подобными титрами составляет 95%. Недостатком прототипа является недостаточно высокая специфическая активность сывороток, длительность процесса иммунизации (49-54 дня). Целью изобретения является повышение специфической активности диагностических сывороток, упрощение и снижение трудоемкости процесса их получения при высоком выходе целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что животных-продуцентов пятикратно иммунизируют авирулентным антигенным материалом внутривенно, одновременно вводят внутримышечно в качестве иммуномодулятора тималин, в третью инъекцию дополнительно внутримышечно вводят циклофосфан, отделяют кровь и приготавливают сыворотку. По отношению к прототипу заявляемый способ получения диагностической сыворотки имеет следующие отличительные признаки. Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствует значительному повышению титров специфических сывороточных антител за счет увеличения числа антителообразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных T-клеток. Циклофосфан, являясь классическим иммуносупрессором, также активизирует магрофаги, стимулируя фагоцитарную, цитотоксическую и супрессивную (в отношении главным образом T-лимфоцитов) функции [Лазарева Д.Н., Алехин Е.Н. Стимуляторы иммунитета. М.: Медицина, 1985, с. 67-70, 147-150]. Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора — с другой, служат оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других. Возможность практического использования предлагаемого способа иллюстрируется примерами изготовления сывороток с использованием полной совокупности заявляемых признаков изобретения. Пример 1. Получение чумной диагностической сыворотки. Кроликам-продуцентам вводят внутривенно каждые четыре дня пятикратно фракцию 1 чумного микроба в увеличивающихся дозах: 0,1 мг; 0,15 мг; 0,2 мг; 0,25 мг; 0,3 мг. В эти же сроки внутримышечно инъецируют по 5 мг тималина, а в третью инъекцию дополнительно внутримышечно вводят 100 мг циклофосфана. На 7-й день животных кровопускают. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше, при этом сыворотки отличаются высокой специфичностью. Пример 2. Получение диагностической бруцеллезной сыворотки. Кроликам-продуцентам вводят внутрибрюшинно каждые четыре дня пятикратно водорастворимый полигрупповой антиген из B.abortus 19, B.melitensis Rev-I, B.suis 61 в увеличивающихся дозах: 1 мг; 1,25 мг; 1,5 мг; 1,75 мг; 2 мг. В эти же сроки внутримышечно инъецируют по 5 мг тималина, а в третью инъекцию дополнительно внутримышечно вводят 100 мг циклофосфана. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше. Пример 3. Получение диагностической сибиреязвенной антиспоровой сыворотки. Все операции, связанные с иммунизацией кроликов-продуцентов, выполняются в той же последовательности, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Водорастворимый антиген получают из спор штамма Bac. anthracis I CO, обработанных автоклавированием при 1,5 атм в течение 2 часов. Активность сывороток в РНИФ 1:16384-1:32768. Пример 4. Получение диагностической полигрупповой чумной, туляремийной, бруцеллезной, сапной, мелиоидозной сыворотки. Все операции, связанные с иммунизацией кроликов-продуцентов, выполняются в той же последовательности, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Антигены возбудителей инъецируют в комплексе в следующих дозах: чумы — 0,1 мг; 0,15 мг; 0,25 мг; 0,3 мг, а антигены туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза — по 1 мг; 1,25 мг; 1,5 мг; 1,75 мг; 2 мг. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше по каждому составляющему компоненту. Пример 5. Получение полигрупповой дизентерийной диагностической сыворотки. Водорастворимый полигрупповой антиген получают из типичных для каждого вида шигеллезных штаммов (Sh.dysenteriae, Sh.flexneri, Sh.boydii и Sh. sonnei) и инъецируют в той же последовательности и тех же дозах, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Активность сывороток в РНИФ достигает 1:16384 и выше. Пример 6. Получение трепонемной диагностической сыворотки. Водорастворимый трепонемный ультраозвученный антиген инъецируют в той же последовательности и тех же дозах, что и при получении диагностической бруцеллезной сыворотки. Активность сыворотки в НРИФ достигает 1:16384 и выше. Таким образом, изобретение практически осуществимо. При сопоставлении со способом-прототипом выявлены следующие преимущества: значительное сокращение длительности процесса иммунизации с 49-54 до 27-30 дней за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и одновременных инъекций антигена и иммуномодуляторов, повышение выхода целевого продукта за счет увеличения антителообразования у животных продуцентов и уменьшения расхода антигенных материалов, значительное повышение специфической активности сывороток в НРИФ с 1:512 — 1:2048 до 1:16384 — 1:32768. Использование изобретения в биотехнологии позволит организовать массовый выпуск высокоактивных, специфичных сывороток для производства диагностических препаратов.Формула изобретения
Способ получения диагностической сыворотки, включающий многократную иммунизацию животных-продуцентов авирулентным антигенным материалом в совокупности с иммуномодуляторами, забор крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве иммуномодуляторов используют тималин и циклофосфан, иммунизацию осуществляют пятикратно, антигенный материал вводят внутривенно, иммуномодулятор тималин — внутримышечно одновременно с инъекцией антигена, при этом циклофосфан вводят однократно с третьей инъекцией.Бациллы сибирской язвы
⇐ ПредыдущаяСтр 11 из 17Следующая ⇒Аллерген сибиреязвенный (антраксин). Гидролизат вегетативных форм вакцинного штамма сибиреязвенного микроба СТИ. Предназначен для диагностики сибирской язвы у больных и переболевших, определения иммунологической перестройки организма у вакцинированных. Выпускают по 10 доз/мл. Вводят 0,1 мл внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья (аллергический метод).
Вакцина «СТИ» (сокращенное от санитарно-технический институт).Содержит взвесь живых спор вакцинных штаммов, полученных путем отбора из старых лабораторных культур, утративших способность образовывать капсулу, но сохранивших иммуногенность. Применяют для иммунизации животных и некоторых профессиональных контингентов людей (рабочие шерсте- и кожеобрабатывающих предприятий).
Люминесцирующая сибиреязвенная сыворотка. Меченная флюорохромом сибиреязвенная диагностическая сыворотка используется для люминесцентной микроскопии (экспресс-метод).
Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Сыворотка крови лошади или барана, иммунизированных вакциной СТИ или экстрактом из бацилл. Применяют для реакции кольцепреципитации Асколи при выявлении сибиреязвенного антигена в трупах погибших животных или в поступающем на фабрики сырье (меха, кожа).
Противосибиреязвенный лошадиный глобулин. Получатся из сыворотки лошадей, иммунизированных живой сибиреязвенной вакциной. Предназначен для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы у людей.
Сибиреязвенная сыворотка. Получается из крови лошадей, иммунизированных живой сибиреязвенной вакциной. Используется для лечения и экстренной профилактики сибирской язвы.
Франциселлы
Аллерген туляремийный (тулярин). Взвесь туляремийных микробов вакцинного штамма, убитых нагреванием. Используется для диагностики туляремии, для оценки состояния иммунитета у привитых (аллергический метод).
Туляремийный диагностикум. Состоит из взвеси убитых формалином (0,5%) палочек туляремии используется для реакции простой агглютинации убитых туляремийных микробов. РНГА-диагностикум – предназначен для определения специфических антител в сыворотке крови (серодиагностика).
Туляремийная живая сухая накожная вакцина. Содержит взвесь живых микробов вакцинного штамма возбудителя туляремии. Применяется для активной профилактики туляремии. В неблагополучной местности прививают все население, за исключением детей до 7 лет, при особо угрожаемом положении – детей старше 2 лет. Продолжительность иммунитета от 3 до 6 лет.
Бруцеллы
Аллерген бруцеллезный (бруцеллин). Представляет собой 0,1 %-й раствор полисахаридно-белкового комплекса, полученного из вакцинного штамма В.abortus 19ВА путем уксуснокислого гидролиза. Применяется для выявления аллергической перестройки у инфицированных, больных, переболевших и лиц, вакцинированных против бруцеллёза (проба Бюрне). Вводится 0,1 мл внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья (аллергический метод).
Бруцеллезый диагностикум. Взвесь убитых бруцелл. Применяется для серологической диагностики, при постановке реакции Райта и Хеддельсона, РСК и РНГА. Подкрашивается метиленовым синим, чтобы агглютинат был более четко виден.
Живая бруцеллезная вакцина. Содержит авирулентные бруцеллы коровьего вида (штамм Brucella abortus 19 – ВА). Используется для профилактики бруцеллеза в неблагоприятной по этому заболеванию местности. Продолжительность иммунитета до одного года. Не вакцинируются лица с положительной аллергической и серологической реакциями.
Бруцеллезная лечебная вакцина. Содержит убитые нагреванием бруцеллы коровьего и овечьего видов. Препарат предназначен для лечения больных с подострым и хроническим бруцеллезом в состоянии де- и субкомпенсации. Вакцина стимулирует реакции специфического иммунитета и способствует десенсибилизации.
Поиск по сайту:
Новости Все новости 22.06.2021 Акция на СО2-инкубаторы Heracell Vios с медной камерой Подробнее 25.02.2021 Новое оборудование для перемешивания Подробнее 15.09.2020 Новые серии холодильного и морозильного оборудования Подробнее 11.11.2019 Снятие с производства термостатов Sahara с акриловыми ваннами Подробнее 02.07.2019 Обновление модельного ряда холодильников и морозильников Подробнее 15.04.2019 Снятие с производства морозильников серии Forma 900 Подробнее 15.11.2018 Снятие с производства ряда холодильников Подробнее 08.06.2018 Снятие с производства раскапывателей Multidrop 384 и Multidrop DW Подробнее 31.05.2018 Снятие с производства части оборудования и аксессуаров для водоподготовки Подробнее 11.05.2018 Обновление линейки концентраторов Savant Speed Vac Подробнее 03.05.2018 Новая продукция — мобильные камеры Cell Locker для СО2 инкубаторов Подробнее 20.04.2018 Снятие с производства части оборудования Thermo Scientific ELED Подробнее 04.04.2018 Снятие с производства муфельных печей Thermo Scientific M104 50040488 и 50040489 Подробнее 17.03.2018 Снятие с производства инкубаторов-шейкеров Подробнее 22.01.2018 Снятие с производства спектрофотометров Multiskan GO Подробнее 12.01.2018 Снижение цен на обратноосмотические мембраны Подробнее 27.12.2017 Изменение каталожных номеров аксессуаров для систем водоподготовки Подробнее 20.12.2017 Обновление линейки флуориметров и люминометров Подробнее 15.12.2017 Снижение цен на Varioskan Lux Подробнее 11.10.2017 Представлены новые встраиваемые лабораторные холодильники Подробнее 03.06.2017 Перенос производства оборудования для водоподготовки из Германии в Швецию Подробнее 03.02.2017 Представлен новый рефрижераторный термостат-шейкер Подробнее 12.12.2016 Представлена новая серия рефрижераторных инкубаторов Подробнее Все новости | Коринебактерии
|
% PDF-1.5 % 1 0 объект > эндобдж 2 0 obj > поток конечный поток эндобдж 3 0 obj > / ProcSet [/ PDF / Text] / Font> / Properties >>> / MediaBox [0 0 595 808] / StructParents 1 / Rotate 0 >> эндобдж 5 0 obj > поток HW [o۸ ~ ϯࣴeQwvg — Qdrrw.$ ‘⠨ CIp | 8NmI4 + g} 0Os4 (BbǷP4n ߇ B}} ab_ \ EDvB2 (@ 8Geu? Z: C-T / T_’h $ rǾ = N
Frontiers | Три жгутиковых локуса Brucella ovis PA незаменимы для вирулентности в клеточных моделях и мышах
Введение
Род Brucella состоит из шести классических видов ( B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis, B. ovis и B. neotomae ), вызывающих бруцеллез у наземных млекопитающих, и шесть других видов ( B. ceti, B. pinnipedialis, B.microti, B. inopinata, B. vulpis и B. papionis ), которые были изолированы с 1990-х годов от других наземных или морских млекопитающих (https://lpsn.dsmz.de/genus/brucella). Виды Brucella spp. В последнее время круг хозяев увеличился до земноводных и рыб, причем атипичные штаммы были выделены от нескольких видов лягушек и ската (1, 2). Несмотря на высокий процент гибридизации ДНК-ДНК, обнаруженный среди классических видов Brucella (96 ± 5% по сравнению с B.melitensis 16M) (3) были обнаружены некоторые дифференциальные генетические маркеры, которые различаются по нескольким фенотипическим характеристикам, предпочтениям хозяина и патогенности. Тем не менее, общей чертой является их способность выживать и размножаться внутри фагоцитарных клеток (4-7). Виды Brucella являются гладкими (S) или шероховатыми (R) в зависимости от присутствия или отсутствия, соответственно, O-полисахаридных цепей в липополисахариде (LPS). B. ovis и B. canis — единственные грубые виды Brucella , но вирулентны для их естественных хозяев (овец и собак соответственно), что контрастирует с другими видами Brucella , которые являются гладкими и требуют S- ЛПС для полной вирулентности (8–10).
Хотя в последние годы количество исследований вирулентности штаммов R увеличилось, большая часть работ в этом отношении была проведена с видами S Brucella (в основном с зоонозами B. melitensis, B. abortus и B. suis ). ). Среди генов, участвующих в вирулентности гладкой B. melitensis , жгутиковые гены необходимы для установления хронической инфекции у мышей (11), что представляет собой интригующий признак, поскольку B. melitensis является неподвижным видом ( 1).Фактически, среди бруцелл только атипичных штаммов B. inopinata и Brucella , выделенных от лягушек и ската, являются подвижными (1, 2, 12–14), и по крайней мере изоляты лягушек способны образовывать полярный жгутик в культуре. средний (1). Несмотря на присутствие нескольких псевдогенов в трех основных локусах жгутика (1, 11) и его неподвижный характер (1), B. melitensis 16M способен строить покрытый оболочкой полярный жгутик в ранней экспоненциальной фазе роста (11 ) и, как упоминалось выше, жгутиковые мутанты B.melitensis 16M обладают ослабленной вирулентностью (11). Хотя три локуса жгутиков являются консервативными в роду Brucella с другим паттерном псевдогенизации в большинстве случаев, дополнительных исследований для оценки значимости жгутиковых генов для вирулентности других видов Brucella не проводилось. В соответствии с его грубым фенотипом, его специфическими характеристиками, связанными с внешней мембраной (ОМ) и вирулентностью, а также общим предпочтением овцы-хозяина с B. melitensis (15–21), мы выбрали B.ovis , чтобы расширить знания о роли жгутиковых генов в вирулентности рода Brucella . С этой целью мы создали панель жгутиковых мутантов грубо вирулентных B. ovis PA (с одним, двумя или тремя удаленными локусами жгутиков), которые были охарактеризованы в отношении характеристик роста, свойств, связанных с ОМ, внутриклеточного поведения в клетках. модели профессиональных и непрофессиональных фагоцитов и вирулентности на мышиной модели.
Материалы и методы
Плазмиды, бактериальные штаммы и условия культивирования
Плазмиды pGEM-T Easy (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) и pCVDKan-D (18) были использованы для конструирования рекомбинантных плазмид, содержащих инактивированные локусы жгутиков.Они поддерживались в Escherichia coli JM109 и CC118 (λpir) соответственно. Рекомбинантные штаммы E. coli культивировали при 37 ° C в среде Лурия Бертани (LB) с добавлением 50 мкг / мл ампициллина (плазмиды, полученные из pGEM-T Easy) или канамицина (плазмиды, полученные из pCVDKan-D).
Virulent B. ovis PA использовали в качестве родительского штамма для получения панели жгутиковых мутантов и в качестве эталонного штамма для сравнений в различных анализах. Он был получен из коллекции бактериальных культур, хранящейся в Национальном институте агрономических исследований, Нузилли, Франция. Штаммы B. ovis культивировали в триптическом соевом агаре (TSA) или триптическом соевом бульоне (TSB) (Pronadisa-Laboratorios Conda, Торрехон-де-Ардос, Испания) с добавлением 0,3% дрожжевого экстракта (YE) (Pronadisa-Laboratorios Conda, Торрехон-де-Ардос, Испания) и 5% лошадиной сыворотки (HS) (Gibco-Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Когда требовалось для процедуры мутагенеза, TSA-YE-HS был дополнен канамицином (Kan) в конечной концентрации 50 мкг / мл или 5% сахарозой (Sigma-Aldrich, St.Луис, Миссури, США). штаммов B. ovis культивировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 .
In silico Анализ ДНК и белков, праймеры и методы нуклеиновых кислотГеномы B. melitensis 16M (ATCC 23456) и B. ovis 63/290 (ATCC 25840) были проанализированы по данным GeneBank (номера доступа AE008917 и AE008918 для B. melitensis 16M хромосомы I и II, соответственно. и инвентарные номера NC_009505 и NC_009504 для B.ovis 63/290 хромосом). Данные гена подвижности Brucella sp. B13-0095, выделенный из лягушки Pac-Man, был получен из Центра интеграции ресурсов Pathosystems (PATRIC; идентификатор генома 1867845.3; https://www.patricbrc.org) (22). Ортологи были проанализированы в Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG; https://www.kegg.jp), а выравнивание белков и ДНК было выполнено с помощью LALIGN (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ lalign /) из Европейского института биоинформатики (23). PSORTb v3.0.2 (Лаборатория Бринкмана, Университет Саймона Фрейзера, Британская Колумбия, Канада; https://www.psort.org/psortb/) была использована для прогнозирования субклеточной локализации белка (24). Набор для конструирования генов (GCK 4.5; Textco Biosoftware, Роли, Северная Каролина, США) использовали в качестве вспомогательного инструмента для анализа нуклеотидных последовательностей и схематического изображения локусов жгутиков.
Праймеры ДНК(IDT, Лёвен, Бельгия), используемые для анализа экспрессии генов, а также для конструирования и характеристики мутантных штаммов, описаны в таблице 1.ПЦР-амплификацию выполняли с использованием ДНК-полимеразы AccuPOL (VWR, Лёвен, Бельгия), мастер-микса ДНК-полимеразы Red Taq (VWR, Лёвен, Бельгия) или системы ПЦР с длинным шаблоном Expand TM (Roche, Мангейм, Германия), в зависимости от эксперимента. . Для исследований экспрессии генов РНК экстрагировали с помощью мини-набора RNeasy (Qiagen, Hilden, Германия) из 5 × 10 9 КОЕ B. ovis , которые культивировались в жидкой среде в течение 16 или 49 часов (t16 или t49; экспоненциальная и стационарная фаза роста соответственно).Остаточную ДНК удаляли с помощью ДНКазы RQ1 (Promega, Мэдисон, Висконсин, США), а кДНК синтезировали с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК для ОТ-ПЦР (Roche, Mannheim, Германия), используя случайные гексамеры, поставляемые с набором, в качестве праймеров для обратная транскриптаза (RT). Параллельные контрольные реакции проводили в тех же условиях, но без RT. Последующие реакции ПЦР были выполнены (с использованием кДНК в качестве матрицы и панели пар праймеров, нацеленных на гены в трех жгутиковых локусах) либо с помощью системы Expand TM Long Template PCR System для конечной точки ОТ-ПЦР, либо с помощью KAPA SYBR® Fast Master Mix (Kapa Biosystems, Кейптаун, Южная Африка) для относительной количественной оценки с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (qRT-PCR).Четыре биологических повтора, с тремя техническими повторами в каждом, использовали в анализах qRT-PCR, которые выполняли в приборе StepOnePlus TM (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Уровни экспрессии генов определяли с помощью программного обеспечения StepOne TM v2.3 методом 2 -ΔΔCt с геном 16S в качестве внутреннего стандарта.
Таблица 1 . Праймеры, использованные в данной работе для построения и проверки B.ovis PA жгутиковые мутанты.
Процедура мутагенеза
мутантных штаммов для трех основных жгутиковых локусов (таблица 2) были получены путем делеции в рамке считывания с перекрывающейся ПЦР, как описано ранее (18). Вкратце, для удаления всего локуса I 5′-концевая и вышестоящая ДНК (около 700 п.н.) амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами Flg1MUT-F и Flg1OVL-R и ДНК-полимеразой AccuPOL. Точно так же 3′-конец и нижележащую ДНК амплифицировали с праймерами Flg1OVL-F и Flg1MUT-R. Оба фрагмента были слиты через комплементарные области праймеров Flg1OVL-F и Flg1OVL-R (таблица 1) с перекрывающейся реакцией ПЦР с праймерами Flg1MUT-F и Flg1MUT-R и системой ПЦР с длинной матрицей Expand TM .Полученный фрагмент ДНК был лигирован в pGEM-T Easy, подтвержден секвенированием ДНК, а затем клонирован в плазмиде pCVDKan-D, которая придает устойчивость к канамицину и чувствительность к сахарозе (18). Рекомбинантную плазмиду вводили в исходную B. ovis PA путем электропорации. Колонии B. ovis PA, несущие плазмиду, интегрированную в хромосому, которая, следовательно, содержит одну копию локуса дикого типа и одну копию модифицированного локуса, были обнаружены путем посева на чашки TSA-YE-HS, содержащие канамицин.Колонии проверяли с помощью ПЦР с соответствующими праймерами для обнаружения обеих копий локуса I (промежуточный штамм). Колонии, страдающие вторым событием рекомбинации, приводящим либо к желаемому мутантному штамму, либо к штамму, возвращающемуся к генотипу дикого типа, были обнаружены путем посева промежуточного штамма на чашки с TSA-YE-HS, содержащие сахарозу. Дифференциацию между мутантным штаммом, лишенным жгутикового локуса I, и штаммами промежуточного или дикого типа проводили с помощью серии реакций ПЦР с мастер-смесью ДНК-полимеразы Red Taq и праймерами, расположенными внутри и / или вне удаленной области.Мутанты, лишенные всего локуса II или всего локуса III (таблица 2), были получены аналогично с их специфическими праймерами (таблица 1). Одиночные мутанты для каждого локуса жгутика служили родительскими штаммами для второго раунда мутации, приводящего к делеции дополнительного локуса жгутика. Полученные двойные мутанты (таблица 2) впоследствии были использованы в качестве родительских штаммов для получения панели тройных мутантов B. ovis PA, лишенных трех основных жгутиковых локусов (таблица 2).
Таблица 2 .Наиболее релевантные мутантов B. ovis PA в жгутиковых локусах получены в данной работе a .
Анализы роста, аутоагглютинации и чувствительности
Рост мутантных штаммов в твердой и жидкой среде анализировали, как описано ранее (26). Вкратце, для оценки роста в твердой среде бактериальные суспензии в PBS со значениями оптической плотности 0,2 при 600 нм (OD 600 ) соответствующим образом разбавляли и высевали на планшеты TSA-YE-HS для определения количества КОЕ / мл после Инкубация 5 дней.Кривые роста в жидком TSB-YE-HS были также построены путем измерения эволюции баллов OD 600 и чисел log КОЕ / мл бактериальных суспензий, начиная со значений OD 600 , равных 0,05, и инкубировали при перемешивании в течение 170 часов.
Для оценки способности к аутоагглютинации бактериальные суспензии в TSB-YE-HS со значениями OD 600 0,8 (100% OD 600 ) инкубировали в течение 48 часов в статических условиях для измерения эволюции баллов OD 600 . (18, 27).Чувствительность к полимиксину B, дезоксихолату натрия и H 2 O 2 (все от Sigma-Aldrich) измеряли с помощью дискового анализа следующим образом. Бактериальные суспензии (100 мкл) со значениями OD 600 , равными 0,2, высевали на TSA-YE-HS. Затем диски диаметром 0,9 мм (Los Productos de Aldo, Испания) помещали в середину планшета и пропитывали 20 мкл полимиксина B (250 000 МЕ / мл), дезоксихолатом натрия (10 мг / мл) или 30%. Н 2 О 2 . Диаметр ореола подавления роста регистрировали в четырех повторностях для каждой чашки после 5-дневного периода инкубации, и результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение для трех чашек.
Оценка вирулентности на клеточных моделях и мышах
Внутриклеточное поведение мутантных штаммов изучали на макрофагах J774.A1 и клетках HeLa, как описано ранее (19). Вкратце, 2 × 10 4 J774.A1 макрофагов / лунку или 1,5 × 10 4 клеток HeLa / лунку культивировали в 96-луночных планшетах в течение 24 часов. Бактериям (4 × 10 6 или 8 × 10 6 КОЕ / лунку для клеток J774.A1 или HeLa, соответственно) позволяли интернализоваться в течение 2 часов в клеточных линиях.Внеклеточные бактерии были убиты гентамицином, и внутриклеточные бактерии были подсчитаны в трех лунках для каждого бактериального штамма после лизиса эукариотических клеток и посева на TSA-YE-HS (t0). Остальные лунки инкубировали в присутствии гентамицина для оценки количества внутриклеточных бактерий через 20 и 44 ч (t20 и t44) после инфицирования (p.i.).
Вирулентность мышей оценивали на самках мышей BALB / c в возрасте 6 недель (Charles River Laboratories, Chatillon-sur-Chalaronne, Франция), получавших за 1 неделю до этого.Их внутрибрюшинно инокулировали 10 6 КОЕ родительских B. ovis PA или тройными мутантами жгутиков B. ovis Δ flg1 Δ flg2 Δ flg3, B. ovis Δ flg2 Δ flg2 Δ flg1 Δ flg3 или B. ovis Δ flg3 Δ flg2 Δ flg1 . Количество бактерий в селезенке определяли — как описано ранее (28) — у 5 мышей на группу через 3, 7 и 11 недель p.i. (W3, W7 и W11), которые в г.ovis PA соответствует пику инфекции в острой фазе, хронической фазе и фазе спада инфекции соответственно (26, 27).
Статистический анализ
Статистические сравнения были выполнены с помощью однофакторного дисперсионного анализа и теста наименьших значимых различий Фишера в программе GraphPad Prims Software (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Статистически значимые различия ( P <0,01) установлены с доверительным интервалом 99%.
Результаты
Геномная организация и транскрипция жгутиковых локусов в
B. ovisСогласно аннотированной полногеномной последовательности эталонного штамма B. ovis (29), три жгутиковых локуса B. ovis (рис. 1A) имеют организацию, аналогичную описанной для B. melitensis 16M ( 11) и также расположены в хромосоме II. Поиск в геноме PATRIC подвижной Brucella sp. B13-0095 выявил наличие дополнительных жгутиковых генов motA, motB, fliJ и fliO , которые также были обнаружены в хромосоме I B.melitensis 16M и B. ovis 63/290 (таблица 3). Гипотетические гены motA и motB были ранее идентифицированы в локусе III и локусе I, соответственно, хромосомы II Brucella (1, 11, 13) (Таблица 3), но четыре гипотетических гена жгутиков, обнаруженных в хромосоме I, не были обнаружены. ранее сообщалось в исследованиях, направленных на жгутик Brucella (1, 11, 13). Согласно структуре жгутика, описанной для грамотрицательных бактерий (30–37), FliO д. Быть частью экспортных ворот (Рис. 2), которые простираются от мембраны-супрамембраны (кольца MS) жгутика к цитоплазме.FliJ, вместе с FliI и FliH, будет составлять АТФазный комплекс (Рис. 2) механизма экспорта типа III, хотя в геномах Brucella не было обнаружено ни одного гена, потенциально кодирующего FliH. Сходным образом, fliD , который кодирует белок крышки филамента у флагеллированных бактерий (Рис. 2), не был обнаружен в роду Brucella .
Рисунок 1 . Геномная организация (A) и транскрипция (B, C) трех основных локусов жгутиков, обнаруженных в B.ovis геном. Жгутиковые гены, нацеленные на транскрипционный анализ с штаммами B. ovis PA (B, C) , представлены черным рисунком (A) . Процедура мутагенеза удалила 99% каждого локуса (A) в жгутиковых мутантах, перечисленных в таблице 2. Конечная точка ОТ-ПЦР (B) выполнялась с кДНК, полученной ретротранскрипцией РНК, экстрагированной в t16 из B. ovis PA или тройной мутант Δ flg1 Δ flg2 Δ flg3 (реакции RT +).Реакции синтеза кДНК без ОТ использовали в качестве контроля отсутствия ДНК (ОТ-реакции). Ожидается, что амплификация с праймерами fliC в Δ flg1 Δ flg2 Δ flg3 тройной мутант (B) , поскольку оба праймера гибридизируются рядом, но за пределами удаленного фрагмента (делеция удаляет 80% fliC ). qRT-PCR (C) с fliF выполняли с РНК, экстрагированной в t16 и t49 из родительского штамма B. ovis PA.Уровни экспрессии гена (C) определяли с помощью программного обеспечения StepOne TM v2.3 методом 2 -ΔΔCt с геном 16S в качестве внутреннего стандарта и результатами t16 в качестве контрольного условия. Было проанализировано четыре биологических повтора, по три технических повтора в каждом, и результаты выражены в виде средних значений ± стандартное отклонение.
Таблица 3 . Жгутиковые гены обнаружены в геномах Brucella sp. B13-0095, B. melitensis 16M и B.ovis 63/290 а .
Рисунок 2 . Схематическое изображение жгутика B. melitensis и B. ovis . Рисунок разработан в соответствии с классической структурой жгутика грамотрицательных бактерий (30–37) и жгутиковыми генами, обнаруженными в геномах Brucella (39 генов распределены в трех основных локусах жгутиков хромосомы II и 4 найденных гена). в хромосоме I). Дополнительные белки, обнаруженные в локусах жгутиков, участвующие в биосинтезе жгутика или выполняющие неизвестную функцию, обведены рамкой внизу рисунка.Жгутиковые белки, кодируемые генами, которые по сравнению с таковыми из подвижных белков Brucella sp. B13-0095, содержат сдвиги рамки, преждевременные стоп-кодоны или мутации, влияющие на стартовый кодон, написаны жирным красным шрифтом и представлены незаполненными формами с красными границами. Этот образец также использовался для FliD и FliH, которые не были обнаружены в геномах Brucella . Белки B. ovis с внутренними делециями в рамке считывания в кодирующих генах выделены синим жирным шрифтом. B. ovis motB в хромосоме II содержит сдвиг рамки считывания; на фигуре представлен гомолог MotB, кодируемый в хромосоме I, который короче ортолога B. melitensis из-за внутренней делеции в рамке считывания в кодирующем гене. C-кольцо (цитоплазматическое кольцо), MS-кольцо мембраны надрамембранное кольцо, P-кольцо (пептидогликановое кольцо), L-кольцо (липополисахаридное кольцо), IM (внутренняя мембрана), PG (пептидогликан), OM (внешняя мембрана).
По сравнению с геномом подвижных флагеллированных Brucella sp.B13-0095, выделенный из лягушки Pac-Man (13), B. melitensis 16M и B. ovis , демонстрировал различный паттерн дефектных генов (Таблица 3, Рисунок 2) с характеристиками, перечисленными в Таблице 4. В B. melitensis 16M геном, шесть жгутиковых генов с преждевременными стоп-кодонами или сдвигом рамки считывания были обнаружены (таблицы 3, 4). Кроме того, гипотетический стартовый кодон и сайт связывания рибосомы гена B. melitensis 16M flgA , кодирующего предполагаемый шаперон для белка P-кольца FlgI (чей ген смещен по сравнению с Brucella sp.B13-0095 flgI ) — потеряны из-за удаления 18 нт. В B. ovis 63/290 пять жгутиковых генов содержат внутренние делеции в рамке считывания, укорачивающие кодируемый белок (таблица 3, синие буквы и таблица 4) и шесть дополнительных генов (рисунок 1A, таблица 3, красные буквы и таблица 4) содержат преждевременные стоп-кодоны или сдвиги рамки. Однако ген флагеллина fliC не аннотирован как псевдоген во всей последовательности генома B. ovis . Поскольку в данной работе мы использовали вирулент B.ovis PA, нельзя исключать возможность некоторых отличий от B. ovis 63/290. Однако предыдущие геномные исследования с B. ovis PA дали те же результаты, что и B. ovis 63/290 (18, 19, 38, 39), и все последовательности, которые мы определили в этой работе для конструирования жгутиковых мутантов ( включая внутренние последовательности, не указанные здесь) были идентичны таковым из B. ovis 63/290.
Таблица 4 . Дефектные гены жгутиков в B.melitensis 16M и B. ovis 63/290 a .
Чтобы оценить, транскрибируются ли жгутиковые локусы в B. ovis PA, была проведена ОТ-ПЦР по конечной точке с РНК, экстрагированной на экспоненциальной фазе роста, и праймерами, нацеленными на девять генов, распределенных в трех основных локусах. Транскрипция всех оцениваемых генов была обнаружена в родительском штамме B. ovis PA (рис. 1B), в то время как не наблюдалась амплификация с кДНК, полученной от мутанта Δ flg1 Δ flg2 Δ flg3 , за исключением fliC. (рисунок 1B).Это исключение было ожидаемым, поскольку выбранные праймеры для ОТ-ПЦР амплифицируют 164-нуклеотидный фрагмент 5′-конца fliC , который внешне граничит с удаленным фрагментом ДНК локуса I (делеция удаляет 99% локуса I, который включает 80 % от флик ). Исследования относительной экспрессии в жидкой среде TSB-YE-HS гена локуса I fliF (выполненные с помощью qRT-PCR с использованием 16S в качестве внутреннего эталонного гена) показали, что fliF подвергается понижающей регуляции (примерно с 3.5-кратное снижение) в стационарной фазе роста (t49) по сравнению с экспоненциальной фазой роста (t16) (Рисунок 1C).
Конструкция, рост и свойства ОВ
B. ovis PA Флагеллярные мутантыБыли сконструированы три исходных мутанта B. ovis PA ( B. ovis Δ flg1 , Δ flg2 и Δ flg3 ), в каждом из которых был удален один из трех основных локусов жгутика (локус I, II , и III соответственно). Несмотря на большой размер удаленного фрагмента, в основном это г.ovis Δ flg1 (удалено около 18 т.п.н.), не было обнаружено никаких трудностей при получении трех мутантов. Аналогичным образом были получены двойные и тройные мутанты, сочетающие делецию двух или трех жгутиковых локусов (делеция 32,5 т.п.н. у тройных мутантов). Все возможные комбинации двойных и тройных мутантов были получены для того, чтобы составить панель мутантов, которые можно было бы проанализировать в случае обнаружения различного поведения у одного мутанта и, таким образом, минимизировать риск отнесения различий, вызванных другими нежелательными мутациями, к отсутствию мутаций. жгутиковые локусы.
Никаких различий в росте на твердой среде не наблюдалось у одиночных, двойных или тройных мутантов, которые показали аналогичные значения КОЕ / мл для бактериальных суспензий с OD 600 = 0,2, чем у родительского штамма (данные не показаны). Эквивалентные результаты среди штаммов также наблюдались в жидкой среде TSB-YE-HS с аналогичным изменением значений OD , 600, и КОЕ / мл со временем (дополнительный рисунок 1). В анализе аутоагглютинации не было обнаружено различий между штаммами, поскольку, как и ожидалось для родительского B.ovis PA (26), все они оставались в суспензии (дополнительный рисунок 2). Согласно этим результатам, только три тройных мутанта ( B. ovis Δ flg1 Δ flg2 Δ flg3 , Δ flg2 Δ flg1 Δflg3 и Δ flg3 Δ Δ flg2 flg1 , у которых три локуса жгутиков удалены в другом порядке) были первоначально выбраны для остальных исследований. Другие мутанты будут проанализированы только в том случае, если будут обнаружены различия с тройными мутантами.
Свойства, связанные с ОМ, которые также были связаны с выживаемостью в организме хозяина, были оценены у отобранных тройных мутантов по сравнению с B. ovis PA. Диаметры ореолов ингибирования роста, полученные при воздействии H 2 O 2 , дезоксихолата натрия или полимиксина B, не показали значимых различий между тремя мутантами с тройным жгутиком и родительским штаммом (дополнительный рисунок 3).
Вирулентность
B. ovis PA Флагеллярные мутантыНачиная с г.ovis является внутриклеточным патогеном (6, 17, 19, 26, 40), поведение в клетках J774.A1 и HeLa тройных мутантов оценивалось по сравнению с поведением родительского штамма. Удаление трех основных жгутиковых локусов в B. ovis PA не повлияло на интернализацию бактерии или ее внутриклеточную эволюцию (Рисунки 3A, B). Эти результаты были как-то ожидаемы, поскольку жгутиковые мутанты B. melitensis 16M не показали измененного внутриклеточного паттерна (11), хотя необходимо учитывать, что каждый из этих мутантов был дефектным только в одном единственном гене.
Рисунок 3 . Вирулентность тройных мутантов B. ovis PA в жгутиковых локусах. Анализы вирулентности проводили на клеточных линиях J774.A1 (A) и HeLa (B) и на мышах BALB / c (C, D) . Родительский B. ovis PA был включен в эксперименты для сравнения. В клеточных анализах (A, B) результаты выражаются как среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 3) логарифма КОЕ / лунку в каждый момент времени. Вирулентность у мышей выражается как среднее значение ± стандартное отклонение ( n = 5) логарифма КОЕ / селезенка в каждый момент времени (C) .Масса селезенки у тех же мышей также представлена (D) .
Напротив, в то время как мутанты с одним геном B. melitensis 16M не смогли установить хроническую фазу инфекции у мышей (11), проанализированы три тройных мутанта B. ovis PA, лишенные 32,5 т.п.н. три основных локуса жгутиков не показали ослабления у мышей BALB / c (рис. 3). Таким образом, как количество бактерий в селезенке (рис. 3С), так и вес селезенки (рис. 3D) жгутиковых мутантов показали такую же временную эволюцию, как и у родительского штамма.
Обсуждение
Поскольку классические виды Brucella лишены подвижности (41) и демонстрируют случайные паттерны псевдогенизации (1), возникает соблазн предположить, что жгутиковые локусы, консервативные в роде Brucella , являются остатками экологического предка, который не более длительная необходимая подвижность после эволюционной адаптации к животному-хозяину и к внутриклеточному образу жизни. Однако обнаружение жгутика у B. melitensis 16M и участие жгутиковых генов в его вирулентности у мышей (11, 42, 43) и, вероятно, у коз (44) открывают новую перспективу.Более того, хотя значение вирулентности остается неизученным, недавно сообщенные данные о подвижности атипичных штаммов Brucella (1, 2, 12–14) и их способности, по крайней мере для изолятов земноводных, образовывать полярный жгутик (1) также поощряют дополнительные исследования для выяснения функции жгутиковых генов в роду Brucella . В этой работе мы выбрали вирулентный штамм B. ovis , чтобы построить и охарактеризовать панель мутантов в жгутиковых локусах с основным акцентом на вирулентность.
Хотя профиль дефектных жгутиковых генов, обнаруженных у B. ovis (Рисунок 2, Таблицы 3, 4), делает сборку жгутика маловероятной, B. melitensis 16M также содержит дефектные гены (Рисунок 2, Таблицы 3, 4). ), что было бы несовместимо с синтезом жгутика. Следовательно, вероятно, что либо модифицированные белки являются функциональными, либо B. melitensis 16M способен синтезировать по крайней мере некоторые полноразмерные молекулы путем подавления стоп-кодонов (т.е.е., fliF и flhA ) (11) и компенсации сдвигов рамки считывания ДНК (т.е. flgI, fliG, flgF и fliI ) за счет проскальзывания транскрипции или рибосомного сдвига рамки считывания (45). Соответственно, дефекты, наблюдаемые в некоторых жгутиковых генах B. ovis , не обязательно подразумевают невозможность сборки полной или частичной структуры жгутика, которая может вносить вклад в вирулентность.
Мы обнаружили, что B. ovis PA способно транскрибировать жгутиковые гены, расположенные в трех основных локусах, как описано для B.melitensis 16M (11) уровень транскрипции выше в фазе экспоненциального роста, по крайней мере, для fliF (Рисунки 1B, C). Насколько нам известно, никакие другие исследования не оценивали экспрессию жгутиковых генов у B. ovis ни в культуральной среде, ни внутри фагоцитов, и единственное исследование, в котором анализировался внутриклеточный транскриптом B. ovis , не сообщало о повышении или понижении регуляции жгутиковые гены (46). Однако экспрессия жгутиковых генов B. ovis во внутриклеточной среде, как сообщалось для B.melitensis 16M (11), выбросить нельзя. Хотя этот аспект заслуживает дальнейшего внимания, наши результаты ясно демонстрируют, что все три основных жгутиковых локуса B. ovis PA (что составляет 39 генов) являются незаменимыми для всех оцениваемых свойств, включая внутриклеточную выживаемость и вирулентность на модели мышей (рис. 3 и дополнительные материалы). Таким образом, наиболее вероятно, что B. ovis не образует жгутик или, если это так, он не потребуется для установления инфекции.
Поскольку механизм / механизмы, ответственные за вклад жгутика в вирулентность B. melitensis 16M, не выяснен, трудно предположить, как предполагаемое отсутствие жгутика у B. ovis повлияло на патоген-хозяин. взаимодействие. Жгутики могут участвовать в четырех основных стадиях инфекционного процесса бактериальных патогенов (47): (i) достижение хозяина или целевого сайта (ii) колонизация и инвазия, (iii) поддержание и репликация, и (iv) распространение на новые хосты.Отсутствие подвижности (по крайней мере, in vitro ) и хемотаксических систем исключало бы первую роль у классических видов Brucella . Роль в адгезии и инвазии клеток-хозяев (по крайней мере, в клеточных культурах) также маловероятна, поскольку жгутиковых мутантов B. melitensis не обнаруживают дефектов интернализации в клетках HeLa или в перитонеальных макрофагах крупного рогатого скота (11). Те же клеточные модели также показали, что, хотя промотор fliF индуцируется внутриклеточно, жгутик не требуется для внутриклеточной репликации B.melitensis 16M (11). Кроме того, ослабление у мышей жгутиковых мутантов B. melitensis 16M не было обнаружено при 1W p.i., а только в более поздние моменты времени (11, 43). Однако технология визуализации мышей in vivo показала, что люминесцентный жгутиковый мутант B. melitensis 16M, лишенный четырех генов, кодирующих палочковые белки, имел ограниченную способность к распространению с момента внутрибрюшинной инокуляции (48). Это нарушение распространения может быть связано с невозможностью B.melitensis 16M жгутиковых мутантов для установления хронической инфекции у мышей (11). Но также, если бы это поведение было воспроизведено в естественном хозяине, жгутик мог бы быть ответственным, по крайней мере частично, за тропизм B. melitensis 16M к плаценте. Это утверждение согласуется с тем фактом, что инфекций B. melitensis часто вызывают аборты (21), в то время как B. ovis (которые разделяют с B. melitensis предпочтение овцы-хозяина) проявляют заметный тропизм со стороны мужских половых путей и редко вызывает аборты (20), несмотря на его способность интернализироваться и воспроизводиться в трофобластах (6).Кроме того, следует учитывать вклад жгутика в зоонозный потенциал B. melitensis , самого высокого представителя рода. Дополнительные исследования с участием жгутиковых генов у других видов Brucella , связанных с абортами у их предпочтительных хозяев или способных инфицировать людей, помогут прояснить эти моменты.
Обострение паттерна вирулентности, сопровождающееся гистологическим повреждением селезенки, которое наблюдалось у мышей BALB / c с неполярным мутантом Δ fliC B.melitensis 16M представляет собой еще одно замечательное наблюдение, касающееся жгутиковых генов (43). Было высказано предположение, что флагеллин FliC B. melitensis 16M запускает врожденный иммунный ответ и что жесткая регуляция экспрессии жгутиков у этого штамма является частью скрытой стратегии, которая позволяет поддерживать стойкую инфекцию без серьезного повреждения тканей хозяина (43). . Некоторые другие свидетельства указывают на необходимость тонкой настройки регуляции жгутиковых генов у B.melitensis 16M для установления стойкой инфекции: (i) большое количество зарегистрированных прямых или косвенных регуляторов экспрессии жгутиковых генов: FtcR, FlbT и FlaF, которые кодируются в локусе жгутиков I (рис. 1A) или VjbR, BlxR, RpoE1, BpdA и YbeY (48-54), (ii) результаты, полученные в модели in vivo , моделирующей начало инфекции B. melitensis 16M у крупного рогатого скота (первые 4 часа), показывающие, что три основных жгутиковых локуса были репрессированы, в то время как транскрипция репрессорного гена rpoE1 была активирована (55), и (iii) жгутик покрыт расширением внешней мембраны, оканчивающейся клубоподобной структурой, которая, как предполагается, вносит вклад в сборку FliC субъединицы флагеллина (42) в отсутствие белка крышки филамента FliD (рис. 2), который не был обнаружен в геномах Brucella ; поскольку внешняя мембрана Brucella рассматривается как часть его скрытой стратегии по установлению стойких инфекций (56), оболочка жгутика может способствовать ограничению представления FliC иммунной системе.
В случае B. ovis PA и даже если жгутик не собран, вероятно, будет синтезироваться флагеллин, поскольку этот штамм способен транскрибировать fliC (рис. 1B), а B. melitensis 16M синтезирует FliC даже в отсутствие более глубоких структурных белков жгутиков, таких как FliF (базальный белок тельца) или FlgE (белок-крючок) (53). Следовательно, флагеллин может быть перемещен в цитоплазму клетки-хозяина через систему секреции типа IV (кодируемую опероном virB ), как это было предложено для B.melitensis 16M и вызывают врожденный иммунный ответ, опосредованный цитозольными рецепторами NCRC4 (43). Однако даже если B. ovis PA продуцирует флагеллин и способен перемещать его в цитоплазму клетки-хозяина, это не будет иметь значения для индукции вредного иммунного ответа для бактерии, поскольку жгутиковые мутанты ведут себя как родительский штамм (рисунок 3). Этот факт может быть связан с различиями, обнаруженными в С-концевых остатках FliC у B. ovis по сравнению с белком B.melitensis (таблицы 3, 4). Как N-, так и C-концевые домены участвуют в самополимеризации субъединиц флагеллина (35, 57), но остатки C-конца также были предложены в качестве мишеней для врожденного иммунного ответа, воспринимаемого рецепторами NLRC4 (43). С другой стороны, представление собранных субъединиц флагеллина в открытой структуре жгутика может иметь важное значение для индукции иммунного ответа (и / или взаимодействия с его эффекторами) и паттерна дефектных жгутиковых генов в B.ovis не допускает этого требования.
Еще одно любопытное наблюдение, касающееся жгутика B. melitensis 16M, заключается в контрасте между усилением вирулентности у мышей мутанта Δ fliC (неспособным синтезировать флагеллин и, следовательно, филамент жгутика) и ослаблением Δ fliF. мутант (неспособный синтезировать белки MS-кольца) (43). Эта характеристика предполагает, что жгутиковый экспортный канал B. melitensis 16M может также использоваться для транспорта молекул, необходимых для поддержания хронической инфекции у хозяина.Не выяснено, участвует ли аппарат типа III в специализированном экспорте субъединиц жгутика (32, 33) в экспорт др. Молекул в B. melitensis 16M, которые могут участвовать в вирулентности. Если бы это было так и с учетом полной вирулентности жгутиковых мутантов (рис. 3), такая возможность, по-видимому, не возникает у B. ovis либо из-за естественного дефектного канала, либо из-за отсутствия гипотетических детерминант вирулентности.
Демонстрация того, что жгутиковые гены не обязательны для B.Вирулентность ovis у мышей (рис. 3) представляет собой новую особенность этого грубого вида, дополняющую ранее описанные различия с другими бруцеллами (16–19). Построение профиля дифференциальных характеристик для каждого вида Brucella будет способствовать расшифровке механизмов, лежащих в основе различий патогенности и предпочтения хозяина, которые существуют между классическими видами Brucella , несмотря на их высокое сходство на уровне ДНК. Однако, хотя модель на мышах обычно имитирует результаты, полученные в естественном хозяине для аттенуированных мутантов, у нее есть ограничения (58, 59), и сообщалось о мутантах Brucella , проявляющих полную вирулентность в модели на мышах, но ослабленных в естественном хозяине ( 60).Следовательно, хотя и маловероятно, но нельзя полностью исключить роль жгутиковых генов B. ovis в естественном хозяине. Дополнительные исследования других видов Brucella , включая абортивные и зоонозные виды Brucella и недавно выделенные подвижные штаммы, помогут прояснить значимость жгутиковых генов в роде Brucella .
Заявление о доступности данных
Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью / Дополнительные материалы.
Заявление об этике
Эксперименты на мышах были разработаны в соответствии с испанским и европейским законодательством для исследований на животных (RD 53/2013 и директива 86/609 / EEC). Микробиологические процедуры и эксперименты с мышами были одобрены комитетами по биобезопасности и биоэтике Университета Саламанки и сертифицированы компетентным органом Хунта-де-Кастилья-Леон, Испания.
Авторские взносы
RS-M и NV разработали исследование и написали рукопись.РС-М, КТ и Н.В. участвовали в экспериментальной работе, обсуждении результатов и доработке рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.
Финансирование
Эта работа финансировалась грантом SA151G18, который был присужден Consejería de Educación, Хунта де Кастилья и Леон, Испания.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Мы благодарим сотрудников отдела секвенирования ДНК и экспериментов на животных Университета Саламанки за их эффективное сотрудничество.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2020.00441/full#supplementary-material
Список литературы
1. Аль Дахук С., Келер С., Оккиалини А., Хименес де Багуэс М. П., Хаммерл Дж. А., Айзенберг Т. и др. Brucella spp. амфибий включают геномно разнородные подвижные штаммы, способные к репликации в макрофагах и выживанию в млекопитающих-хозяевах. Научный доклад (2017) 7: 44420. DOI: 10.1038 / srep44420
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
2. Айзенберг Т., Рисе К., Шауэрте Н., Гейгер К., Блом Дж., Шольц Х.С. Выделение нового «атипичного» штамма Brucella из луча ребристого хвоста с синими пятнами ( Taeniura lymma ). Антони Ван Левенгук. (2017) 110: 221–34. DOI: 10.1007 / s10482-016-0792-4
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
3. Verger JM, Grimont F, Grimont PA, Grayon M. Brucella , моноспецифический род, как показывает гибридизация дезоксирибонуклеиновой кислоты. Int J Syst Bacteriol. (1985) 35: 292–5. DOI: 10.1099 / 00207713-35-3-292
CrossRef Полный текст | Google Scholar
4. фон Барген К., Горвель Дж. П., Сальседо С. П..Внутренние дела: исследование внутриклеточного образа жизни Brucella . FEMS Microbiol Rev. (2012) 36: 533–62. DOI: 10.1111 / j.1574-6976.2012.00334.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
5. Чакон-Диас С., Альтамирано-Сильва П., Гонсалес-Эспиноза Г., Медина МС, Альфаро-Аларкон А., Боуза-Мора Л. и др. Brucella canis — это внутриклеточный патоген, который вызывает более низкий провоспалительный ответ, чем гладкие зоонозные аналоги. Infect Immun. (2015) 83: 4861–70. DOI: 10.1128 / IAI.00995-15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
6. Сидху-Муньос Р.С., Санчо П., Вискайно Н. Оценка трофобластов человека и клеточных линий яичка овцы для изучения внутриклеточного патогена Brucella ovis . FEMS Microbiol Lett. (2018) 365: 1–9. DOI: 10.1093 / femsle / fny278
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
7. Уолдроп С.Г., Шриранганатан Н.Внутриклеточная инвазия и выживание Brucella neotomae , еще одного возможного зоонозного вида Brucella . PLoS ONE. (2019) 14: e0213601. DOI: 10.1371 / journal.pone.0213601
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
8. Монреаль Д., Грильо М.Дж., Гонсалес Д., Марин К.М., Де Мигель М.Дж., Лопес-Гони И. и др. Характеристика Brucella abortus O-полисахарида и коровых мутантов липополисахаридов и демонстрация того, что полное ядро требуется для грубых вакцин, чтобы быть эффективными против Brucella abortus и Brucella ovis на мышиной модели. Infect Immun. (2003) 71: 3261–71. DOI: 10.1128 / IAI.71.6.3261-3271.2003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
9. Гонсалес Д., Грильо М.Дж., Де Мигель М.Дж., Али Т., Арсе-Горвель В., Делру Р.М. и др. Вакцины против бруцеллеза: оценка грубых мутантов липополисахаридов Brucella melitensis с дефектом ядра и синтеза и экспорта O-полисахаридов. PLoS ONE. (2008) 3: e2760. DOI: 10.1371 / journal.pone.0002760
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
10.Уахрани-Беттаче С., Хименес Де Багуэс, член парламента, Де Ла Гарза Дж., Фредди Л., Буэсо Дж. П., Лион С. и др. Летальность Brucella microti на мышиной модели инфекции зависит от гена wbkE , участвующего в синтезе О-полисахарида. Вирулентность. (2019) 10: 868–78. DOI: 10.1080 / 21505594.2019.1682762
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
11. Фретин Д., Фоконье А., Кёлер С., Холлинг С., Леонар С., Нийскенс С. и др. Защищенный от оболочки жгутик Brucella melitensis участвует в персистенции на мышиной модели инфекции. Cell Microbiol. (2005) 7: 687–98. DOI: 10.1111 / j.1462-5822.2005.00502.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
12. Айзенберг Т., Хаманн Х.П., Кайм У., Шлез К., Сигер Х., Шауэрте Н. и др. Выделение потенциально новых видов Brucella spp. из лягушек. Appl Environ Microbiol. (2012) 78: 3753–5. DOI: 10.1128 / AEM.07509-11
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
13. Soler-Lloréns PF, Quance CR, Lawhon SD, Stuber TP, Edwards JF, Ficht TA, et al.A Brucella spp. Изолят из лягушки pacman ( Ceratophrys ornata ) обнаруживает характеристики, отличные от классических бруцелл. Front Cell Infect Microbiol. (2016) 6: 116. DOI: 10.3389 / fcimb.2016.00116
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
14. Mühldorfer K, Wibbelt G, Szentiks CA, Fischer D, Scholz HC, Zschöck M, et al. Роль «атипичной» Brucella у земноводных: сталкиваемся ли мы с новыми появляющимися патогенами? J Appl Microbiol. (2017) 122: 40–53. DOI: 10.1111 / jam.13326
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
16. Мартин-Мартин А.И., Санчо П., Техедор С., Фернандес-Лаго Л., Вискайно Н. Различия в свойствах, связанных с внешней мембраной, у шести классических видов Brucella . Вет Дж. (2011) 189: 103–5. DOI: 10.1016 / j.tvjl.2010.05.021
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
17. Silva TM, Paixão TA, Costa EA, Xavier MN, SA JC, Mouracas VS, et al.Предполагаемый переносчик кассеты, связывающей АТФ, необходим для патогенеза Brucella ovis у мышей. Infect Immun. (2011) 79: 1706–17. DOI: 10.1128 / IAI.01109-10
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
18. Мартин-Мартин А.И., Санчо П., де Мигель М.Дж., Фернандес-Лаго Л., Вискайно Н. Определение кворума и регуляция BvrR / BvrS, система секреции типа IV, циклические глюканы и BacA в вирулентности Brucella ovis : сходства и отличия от гладких бруцелл. Infect Immun. (2012) 80: 1783–93. DOI: 10.1128 / IAI.06257-11
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
19. Sidhu-Muñoz RS, Sancho P, Vizcaíno N. Brucella ovis PA мутанты для белков внешней мембраны Omp10, Omp19, SP41 и BepC не изменяются по своей вирулентности и свойствам внешней мембраны. Vet Microbiol. (2016) 186: 59–66. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2016.02.010
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
22.Ваттам А.Р., Дэвис Дж. Дж., Ассаф Р., Бойсверт С., Бреттин Т., Бун С. и др. Улучшения PATRIC, базы данных по бактериальной биоинформатике и аналитического ресурсного центра. Nucleic Acids Res. (2017) 45: D535–42. DOI: 10.1093 / nar / gkw1017
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
23. Madeira F, Park YM, Lee J, Buso N, Gur T., Madhusoodanan N, et al. API-интерфейсы инструментов поиска и анализа последовательности EMBL-EBI в 2019 году. Nucleic Acids Res. (2019) 47: W636–41.DOI: 10.1093 / nar / gkz268
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
24. Yu NY, Wagner JR, Laird MR, Melli G, Rey S, Lo R, et al. PSORTb 3.0: улучшенное предсказание субклеточной локализации белка с уточненными подкатегориями локализации и прогностическими возможностями для всех прокариот. Биоинформатика. (2010) 26: 1608–15. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btq249
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
25. Эльхассанни А.Е., Андерсон Е.С., Меншер Е.А., Руп Р.М. II.Транспортер двухвалентного железа FtrABCD необходим для вирулентности Brucella abortus 2308 у мышей. Mol Microbiol. (2013) 88: 1070–82. DOI: 10.1111 / mmi.12242
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
26. Сидху-Муньос Р.С., Санчо П., Клокерт А., Зигмунт М.С., де Мигель М.Дж., Техедор С. и др. Характеристика множественных мутантов клеточной оболочки Brucella ovis и оценка их вакцинного потенциала на мышах. Front Microbiol. (2018) 9: 2230. DOI: 10.3389 / fmicb.2018.02230
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
27. Каро-Эрнандес П., Фернандес-Лаго Л., де Мигель М.Дж., Мартин-Мартин А.И., Клокерт А., Гриль, —МДж., И др. Роль семейства Omp25 / Omp31 в свойствах внешней мембраны и вирулентности Brucella ovis . Infect Immun. (2007) 75: 4050–61. DOI: 10.1128 / IAI.00486-07
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
28.Санчо П., Техедор С., Сидху-Муньос Р.С., Фернандес-Лаго Л., Вискайно Н. Оценка аттенуированных мутантов Brucella ovis на мышах для использования в качестве живых вакцин против инфекции B. ovis . Vet Res. (2014) 45:61. DOI: 10.1186 / 1297-9716-45-61
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
29. Цолис Р.М., Сешадри Р., Сантос Р.Л., Сангари Ф.Дж., Гарсия Лобо Д.М., де Йонг М.Ф. и др. Деградация генома Brucella ovis соответствует сужению диапазона хозяев и тканевого тропизма. PLoS ONE. (2009) 4: e5519. DOI: 10.1371 / journal.pone.0005519
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
30. Эггенхофер Э., Хаслбек М., Шарф Б. MotE служит новым шапероном, специфичным для периплазматического белка подвижности, MotC, в Sinorhizobium meliloti . Mol Microbiol. (2004) 52: 701–12. DOI: 10.1111 / j.1365-2958.2004.04022.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
34.Чжу С., Кумар А., Кодзима С., Хомма М. Флил связаны со статором для поддержки создания крутящего момента полярного жгутикового двигателя с натриевым приводом Vibrio . Mol Microbiol. (2015) 98: 101–10. DOI: 10.1111 / mmi.13103
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
35. Имада К. Осевое строение жгутика бактерий и его построение. Biophys Rev. (2018) 10: 559–70. DOI: 10.1007 / s12551-017-0378-z
CrossRef Полный текст | Google Scholar
36.Лин Т.С., Чжу С., Кодзима С., Хомма М., Ло СиДжей. Связь FliL со статором жгутика в натриевом двигателе Vibrio , охарактеризованном с помощью флуоресцентной микроскопии. Научный доклад (2018) 8: 11172. DOI: 10.1038 / s41598-018-29447-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
38. Vizcaíno N, Kittelberger R, Cloeckaert A, Marín CM, Fernández-Lago L. Незначительные нуклеотидные замены в гене omp31 в гене Brucella ovis приводят к антигенным различиям в основном белке внешней мембраны, который он кодирует, по сравнению с белками из остальных видов Brucella . Infect Immun. (2001) 69: 7020–8. DOI: 10.1128 / IAI.69.11.7020-7028.2001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
39. Vizcaíno N, Caro-Hernández P, Cloeckaert A, Fernández-Lago L. ДНК-полиморфизм в семействе omp25 / omp31 видов Brucella : идентификация инверсии 1,7 т.п.н. в Brucella cetaceae и геномный остров размером 15,1 т.п.н., отсутствующий в Brucella ovis , связанный с синтезом гладкого липополисахарида. Microbes Infect. (2004) 6: 821–34. DOI: 10.1016 / j.micinf.2004.04.009
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
40. Маседо А.А., Силва А.П., Мол Дж. П., Коста Л. Ф., Гарсия Л. Н., Араужо М. С. и др. Транспортер ABC, кодируемый abcEDCBA , и система секреции типа IV, кодируемая опероном virB , из Brucella ovis имеют решающее значение для внутриклеточного переноса и выживания в макрофагах, происходящих из моноцитов овцы. PLoS ONE. (2015) 10: e0138131.DOI: 10.1371 / journal.pone.0138131
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
41. Альтон Г.Г., Джонс Л.М., Пиц Д.Е. Лабораторные методы при бруцеллезе . Всемирная организация здравоохранения (1975 г.). п. 1–163.
Google Scholar
43. Тервань М., Феруз Дж., Ролан Х.Г., Сан Ю.Х., Атлури В., Ксавье М.Н. и др. Врожденное иммунное распознавание флагеллина ограничивает системную персистенцию Brucella . Cell Microbiol. (2013) 15: 942–60.DOI: 10,1111 / cmi.12088
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
44. Зигмунт М.С., Хагиус С.Д., Уокер СП, Эльзер PH. Идентификация генов Brucella melitensis 16M, необходимых для выживания бактерий в козе-хозяине. Microbes Infect. (2006) 8: 2849–54. DOI: 10.1016 / j.micinf.2006.09.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
45. Аткинс Дж. Ф., Лофран Дж., Бхатт П. Р., Ферт А. Е., Баранов П. В.. Рибосомный сдвиг рамки и проскальзывание транскрипции: от генетической стеганографии и криптографии до случайного использования. Nucleic Acids Res. (2016) 44: 7007–78. DOI: 10.1093 / nar / gkw530
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
46. Цзяо Х., Ли Б., Чжэн З., Чжоу З., Ли В., Гу Г и др. Транскриптомный ландшафт внутриклеточного Brucella ovis , выжившего в иммунной системе макрофагов RAW264.7. Воспаление . (2020). DOI: 10.1007 / s10753-020-01239-4. [Epub перед печатью].
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
47.Чабан Б., Хьюз Х.В., Биби М. Жгутик в бактериальных патогенах: для подвижности и многое другое. Semin Cell Dev Biol. (2015) 46: 91–103. DOI: 10.1016 / j.semcdb.2015.10.032
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
48. Петерсен Э., Чаудхури П., Горли С., Хармс Дж., Сплиттер Г. Brucella melitensis циклическая ди-GMP фосфодиэстераза BpdA контролирует экспрессию жгутиковых генов. J Bacteriol. (2011) 193: 5683–91. DOI: 10.1128 / JB.00428-11
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
49. Delrue RM, Deschamps C, Leonard S, Nijskens C, Danese I, Schaus JM, et al. Регулятор, воспринимающий кворум, контролирует экспрессию как системы секреции типа IV, так и жгутикового аппарата Brucella melitensis . Cell Microbiol. (2005) 7: 1151–61. DOI: 10.1111 / j.1462-5822.2005.00543.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
50.Леонар С., Феруз Дж., Хейн В., Данезе И., Фретин Д., Тибор А. и др. FtcR — новый главный регулятор жгутиковой системы Brucella melitensis . 16M с гомологами в Rhizobiaceae . Дж Бактериол . (2007) 189: 131–41. DOI: 10.1128 / JB.00712-06
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
51. Рамбов-Ларсен А.А., Раджашекара Г., Петерсен Э., Сплиттер Г. Предполагаемый регулятор кворума BlxR из Brucella melitensis регулирует факторы вирулентности, включая систему секреции типа IV и жгутики. J Bacteriol. (2008) 190: 3274–82. DOI: 10.1128 / JB.01915-07
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
52. Феруз Дж., Лемэр Дж., Делори М., Де Болле Х, Летессон Дж. Дж. RpoE1, сигма-фактор с экстрацитоплазматической функцией, является репрессором жгутиковой системы у Brucella melitensis . Микробиология. (2011) 157: 1263–8. DOI: 10.1099 / mic.0.044875-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
54.Будник Дж. А., Шихан Л. М., Колкухун Дж. М., Данман П. М., Уокер Г. К., Руп Р. М. II и др. Эндорибонуклеаза YbeY связана с правильной клеточной морфологией и вирулентностью у Brucella abortus . J Bacteriol. (2018) 200: e00105–18. DOI: 10.1128 / JB.00105-18
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
55. Россетти К.А., Дрейк К.Л., Лоухон С.Д., Нунес Дж. С., Гулл Т., Кхаре С. и др. Системно-биологический анализ временных транскриптомов in vivo Brucella melitensis и крупного рогатого скота позволяет прогнозировать межбелковые взаимодействия между хозяином и патогеном. Front Microbiol. (2017) 8: 1275. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.01275
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
56. Баркеро-Кальво Е., Чавес-Оларте Е., Вайс Д.С., Гусман-Верри С., Чакон-Диас С., Рукавадо А. и др. Brucella abortus использует скрытную стратегию, чтобы избежать активации врожденной иммунной системы в начале инфекции. PLoS ONE. (2007) 2: e631. DOI: 10.1371 / journal.pone.0000631
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
57.Йонекура К., Маки-Йонекура С., Намба К. Полная атомная модель бактериального филамента жгутика с помощью электронной криомикроскопии. Природа. (2003) 424: 643–50. DOI: 10.1038 / nature01830
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
58. Kahl-McDonagh MM, Ficht TA. Оценка защиты, обеспечиваемой немаркированными делеционными мутантами Brucella abortus и Brucella melitensis , проявляющими разные скорости клиренса у мышей BALB / c. Infect Immun. (2006) 74: 4048–57. DOI: 10.1128 / IAI.01787-05
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
60. Беллэр Б.Х., Эльзер П.Х., Хагиус С., Уокер Дж., Болдуин К.Л., Руп RMII. Генетическая организация и чувствительная к железу регуляция оперона биосинтеза 2,3-дигидроксибензойной кислоты Brucella abortus , кластера генов, необходимых для вирулентности дикого типа у беременных крупного рогатого скота. Infect Immun. (2003) 71: 1794–803. DOI: 10.1128 / IAI.71.4.1794-1803.2003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Метод быстрого обнаружения бруцелл с помощью квантовых точек и магнитных шариков, конъюгированных с различными поликлональными антителами | Письма о наномасштабных исследованиях
Источник штамма
Б.melitensis 16M (вирулентный штамм), B. suis , штамм S1 (S1). и B. abortus , штамм 19 (S19) были собраны с Базы профилактики и борьбы с бруцеллезом , Китайские центры по контролю и профилактике заболеваний, город Байчэн, провинция Цзилинь, Китай. Куры были куплены у HaoTai Laboratory Animal Breeding Co., Ltd, Шаньдун. Новозеландского белого кролика купили в Центре экспериментальных животных Университета Цзилинь.
Иммунизация животных
Все процедуры на животных проводились в соответствии с Законом о научных процедурах для животных (1986) и руководящими принципами Комитета по этике Института сельскохозяйственных пищевых продуктов и биологических наук (AFBI).Поликлональные антитела получали путем инъекции кроликам и курицам инактивированной формальдегидом вакцины B. melitensis с полным адъювантом Фрейнда и бустеров с использованием вакцины с неполным адъювантом Фрейнда. Титр антител в сыворотке крови кролика и курицы регулярно контролировали с помощью непрямого иммуноферментного анализа (iELISA). Когда титр сывороточных антител достиг очень стабильного уровня, инактивированные бактерии использовали для окончательного формирования иммунитета.
Производство антител
Двух кроликов казнили путем забора всей крови из их сердец через 10 дней после окончательной иммунизации.Всю сыворотку собирали центрифугированием крови в течение 10 мин при 3000 об / мин. Затем сыворотку очищали 50 и 33% насыщенным сульфатом аммония и получали поликлональные антитела иммуноглобулина G (IgG). Собирали куриные яйца и экстрагировали IgY осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ) [19].
Оценка IgG и IgY
Очищенные IgG и IgY с SDS-PAGE были идентифицированы в соответствии с инструкциями производителя с 5% гелем для стекирования и 12% гелем для разделения.Содержание белка определяли с помощью набора BCA. Титры антител контролировали с помощью оптимизированного непрямого ELISA. Планшеты для микротитрования покрывали инактивированным B. melitensis 16M (вирулентный штамм) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. Затем трижды промывали буферным раствором PBST (0,01 M PBS, pH 7,4, содержащий 0,05% Tween-20). После блокирования 5% -ным обезжиренным молоком ( г / v , буферный раствор PBST) в течение 1 часа при 37 ° C и промывания PBST в планшеты добавляли дважды разведенные IgG или IgY на 1 час при 37 ° C. .После стадии промывки соответственно добавляли разведенное 1: 10000 вторичное антитело HRP козьего против IgG кролика и вторичное антитело козьего HRP против IgG курицы и инкубировали при 37 ° C в течение 0,5 часа. После стадии промывки в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата TMB и выдерживали 20 мин при комнатной температуре в темном месте. Наконец, в каждую лунку добавляли 50 мкл H 2 SO 4 (2M). ОП при 450 нм измеряли с помощью планшет-ридера для ELISA (BioTek, США).
Получение и исследование квантовых точек
Суспензия квантовых точек CdSe была приготовлена в соответствии с литературными данными с небольшой модификацией [20].CdO (0,20 ммоль) и OA (1 ммоль) в ODE (всего 1,5 мл) были сначала приготовлены в качестве предшественника кадмия. Se-TOP получали из порошка Se (1 ммоль) в 5 мл TOP и 5 мл ODE путем барботирования азота в течение 10 мин. OLA (1 мл), предшественник кадмия (2 мл) и ODE (2 мл) загружали в трехгорлую колбу на 50 мл. После перемешивания и откачки вакуума в течение 20 минут при 80 ° C раствор нагревали до 240 ° C, барботируя азот. Se-TOP (1 мл) быстро вводили в раствор при 240 ° C для роста КТ CdSe.С помощью шприца отбирали образцы кончиков игл и растворяли в толуоле для измерений УФ-видимости и ФЛ.
Хорошие флуоресцентные характеристики КТ CdSe / ZnS типа ядро-оболочка были обусловлены пассивацией поверхности ZnS [21, 22]. Раствор CdSe (3 мл), ODE (1 мл) и OLA (1 мл) фиксировали в трехгорлой колбе. Раствор Cd (OA) 2 (0,2 ммоль, Cd: OA = 1: 4) вводили при 130 ° C. Через 20 минут медленно вводили аликвоты раствора S-ODE (0,2 ммоль), и они реагировали в течение 30 минут при 240 ° C. .Для оболочки из ZnS равные мольные отношения Zn (OA) 2 (0.2 ммоль, Zn: OA = 1: 6) и S-ODE использовали в качестве предшественников. Раствор Zn (OA) 2 вводили при 130 ° C и демонстрировали рост при 220 ° C. Раствор S-ODE вводили при 150 ° C и демонстрировали рост при 240 ° C. Этот же процесс повторяли дважды. После завершения реакции реакционный раствор центрифугировали для извлечения непрореагировавших материалов и побочных продуктов. Полученный раствор диспергировали в хлороформе.
Для получения раствора водорастворимых квантовых точек использовали аликвоты хлороформа с квантовыми точками CdSe / CdS / ZnS.В бутыль добавляли 1 мл раствора хлороформа CdSe / CdS / ZnS, 1 мл меркаптопропионовой кислоты и 2 мл деионизированной воды при перемешивании в течение 2 часов. Квантовые точки были перенесены из исходного раствора хлороформа в водный раствор, и после трехкратного центрифугирования квантовые точки рассеялись в деионизированной воде.
Подготовка и оптимизация зонда QD
IgY был ковалентно связан с QD с помощью связывающих агентов N — (3-диметиламинопропил) — N ‘- этилкарбодиимида гидрохлорид (EDC, Sigma) и N -гидроксисуксус (NHS, Sigma) в MEST [23].10 мкл QD смешивали с 200 мкл NHS (10 мг / мл) и 200 мкл EDC (10 мг / мл). Смесь помещали в вертикальный смеситель (Qilinerier, Китай) и подвергали сотрясению в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем раствор центрифугировали при 12000 об / мин в течение 5 минут и трижды промывали фосфатно-солевым буфером с Tween® (PBST), после чего добавляли другое количество IgY и инкубировали еще 2 часа в вертикальном смесителе. Затем его трижды промывали PBST, блокированным 500 мкл 1% BSA ( г / v , буферный раствор PBS) в течение 1 часа.После промывки PBS комплекс можно повторно диспергировать в 200 мкл PBS и хранить при 4 ° C. Это обеспечивает оптимальное количество IgY путем сравнения флуоресценции комплекса, повышенного с помощью флуоресцентного спектрометра при 632 нм.
Подготовка и оптимизация датчика IMB
Подготовка датчика IMB проводилась в соответствии с инструкциями производителя. Конкретные шаги были следующими: 100 мкл IMB (BeaverBeads ™ MagCOOH, 2 мкм) промывали MEST (100 мМ MES, pH 5,0, 0,05% Tween® 20) и трижды разделяли магнитным устройством перед добавлением 200 мкл EDC ( 10 мг / мл, MEST в качестве диспергатора) и 200 мкл NHS (10 мг / мл, MEST в качестве диспергатора) в IMB, подвергнутый удару вертикальным смесителем в течение 30 мин при 25 ° C.Его трижды промывали PBST, добавляли различные количества IgG и встряхивали вертикальным смесителем в течение 2 часов. Затем раствор разделяли магнитным устройством, супернатант сохраняли как резерв, затем трижды промывали PBST, добавляли к 500 мкл 1% BSA ( г / v , буферный раствор PBS) и подвергали электрошоку в течение 1 час После блокирования и промывки полученные биоконъюгации IMB-IgG повторно диспергировали в 400 мкл PBS и хранили при 4 ° C в режиме ожидания. Мы измерили оптическую плотность при A280 нм на ультрафиолетовом спектрофотометре (Persee, Китай), чтобы подтвердить оптимальное количество IgG [24].
Установление метода обнаружения
B. melitensis 16M разделяли зондом IMB, а затем зонд QD использовали в качестве зонда флуоресцентной метки для измерения флуоресценции комплекса, чтобы определить, присутствует ли Brucella . Чтобы установить метод обнаружения, мы можем оптимизировать шаг метода как количество зонда IMB, время IMS, количество зонда QD, время метки и т. Д. [15, 25].
Определение предела обнаружения (LOD) может осуществляться следующим образом [15]: мы приготовили серию десятикратных разведений в диапазоне от 10 до 10 90 10 5 5 90 10 6 КОЕ / мл, LOD был определен как самый низкий уровень концентрации. из Б.melitensis 16M, которые статистически отличались от отрицательного контроля [15]. Специфичность этого метода обнаружения оценивалась путем сравнения результатов зондирования L. monocytogenes (ATCC 19115), E. coli O157 (ATCC 35150) и B. melitensis 16M. Внутривидовую специфичность можно оценить путем обнаружения B. suis , штамм S1 (S1), и B. abortus , штамм 19 (S19) 20, 21.
Обнаружение образца модели
Для обнаруживают образцы асептического молока (Yili) и спиртного напитка, вымоченного из баранины (Haoyue) [26].Ряд различных концентраций 16M был искусственно внесен в пастеризованное молоко и настой из баранины (жидкий состав для притирки ягненка, пропитанный физиологическим раствором в течение 24 часов), а затем обнаружено 16M с помощью этого метода, как описано выше.
| Название: | Оценка полосок бокового потока на основе технологии повышающего преобразования для быстрого обнаружение спор Bacillus anthracis, Brucella spp., и Yersinia pestis | Авторы: | Zhang P. Liu X. Wang C. Zhao Y. Hua F. Li C. Yang R. Zhou L. | Ключевые слова: | бычий сывороточный альбумин точность артикул Bacillus anthracis Bacillus atrophaeus Bacillus cereus Bacillus subtilis бактериальная контаминация обнаружение бактерий биоанализ Бруцелла контролируемое исследование концентрации бруцеллы Brucella 926 контролируемое исследование концентрации Brucella ионная сила лабораторная диагностика макромолекула ошибка измерения нечеловеческий pH тестирование в пункте оказания помощи разработка процесса количественный анализ Salmonella enterica Salmonella enteritidis Salmonella paratyphi чувствительность и специфичность анализ фосфорной полоски с повышением частоты на основе технологии бокового анализа cholerae вязкость Yersinia Yersinia aldovae Yersinia enterocolitica yersinia intermedia yersinia kristensenii Yersinia mollaretii Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis 91 226 Yersinia rohdei Yersinia ruckeri бактериальные споры генетические процедуры больничная информационная система человек люминесценция процедур воспроизводимость Bacillus anthracis биосенсорные методы Brucella Система измерения Воспроизводимость Люминесцентные показатели Lum Измерение результатов Lum и специфичность Споры, бактерии Yersinia pestis | Дата выдачи: | 2014 | Образец цитирования: | Zhang P., Лю X., Ван К., Чжао Ю., Хуа Ф., Ли К., Ян Р., Чжоу Л. (2014). Оценка полос бокового потока на основе технологии повышающего преобразования для быстрого обнаружения спор Bacillus anthracis, Brucella spp. И Yersinia pestis. PLoS ONE 9 (8): e105305. Репозиторий ScholarBank @ NUS. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0105305 | Права: | Атрибуция 4.0 Международная | Резюме: | Bacillus anthracis, Brucella spp. И Yersinia pestis являются зоонозными патогенами и агентами, связанными с биологической войной или биотерроризмом, которые необходимо быстро обнаруживать на месте из различных образцов (например,г., внутренности и пудры). Полоса бокового потока, основанная на люминофорной технологии с повышающим преобразованием (UPT-LF), была разработана для тестирования в месте оказания медицинской помощи (POCT), чтобы удовлетворить требованиям аварийного реагирования первого уровня. Мы разработали UPT-LF POCT для количественного определения трех патогенов в течение 15 минут. Допустимые отклонения выборки и ошибки при выполнении анализа были всесторонне оценены. Чувствительность анализа UPT-LF к обнаружению бактерий достигла 104 КОЕ · мл-1 (100 КОЕ / тест) с линейным количественным диапазоном от 4 до 6 порядков.Результаты показали, что анализ UPT-LF показал высокую специфичность с отсутствием ложноположительных результатов даже при 109 КОЕ · мл -1 неспецифического бактериального загрязнения. Анализ может выдерживать образцы с широким диапазоном pH (от 2 до 12), высокой ионной силой (≥4 моль · л-1 NaCl), высокой вязкостью (≤25 мг · мл -1 PEG20000 или ≥20% глицерина). и высокие концентрации биомакромолекул (≤200 мг · мл-1 бычьего сывороточного альбумина или ≥80 мг · мл-1 казеина). Было определено влияние различных типов порошков и внутренностей (свежих и разложившихся) на эффективность анализа UPT-LF.Операционная погрешность измерения жидкости мало повлияла на чувствительность и специфичность. Разработанный UPT-LF POCT анализ применим в полевых условиях с отличной устойчивостью к сложности образца и эксплуатационным ошибкам. © 2014 Zhang et al. | Название источника: | PLoS ONE | URI: | https://scholarbank.nus.edu.sg/handle/10635/161386 | ISSN: | 1932-6203 | DOI: | 10.1371 / journal.pone.0105305 | Права: | Указание авторства 4.0 Международный |
| Собирается в коллекции: | Публикации сотрудников Элементы |
CDC | Определение случая: Phosphorus
Клиническое описание
Проглатывание элементарного белого или желтого фосфора обычно вызывает сильную рвоту и диарею, которые описываются как «курение», «люминесценция» и запах чеснока. Другие признаки и симптомы тяжелого отравления могут включать аритмию, кому, гипотонию и смерть.Контакт с кожей может вызвать серьезные ожоги в течение нескольких минут или часов (1-4).
Лабораторные критерии диагностики
- Biologic: Специальных тестов на элементарный белый или желтый фосфор не существует; однако повышенный уровень фосфата в сыворотке может указывать на то, что произошло воздействие. Хотя производство фосфата является побочным продуктом метаболизма элементарного фосфора в организме человека, нормальная концентрация фосфата не исключает воздействия элементарного фосфора.
- Окружающая среда: Обнаружение элементарного фосфора в образцах окружающей среды, как определено NIOSH, и повышенный уровень фосфора в продуктах питания, как определено FDA, также могут указывать на воздействие.
Классификация корпуса
- Подозреваемый: Случай, в котором лицо, потенциально подвергшееся воздействию, оценивается медицинскими работниками или должностными лицами здравоохранения на предмет отравления определенным химическим агентом, но никакой конкретной реальной угрозы не существует.
- Вероятный: Клинически совместимый случай, при котором существует высокий индекс подозрения (достоверная угроза или история пациента относительно места и времени) для воздействия элементарного белого или желтого фосфора, или существует эпидемиологическая связь между этим случаем и лабораторно подтвержденным случаем.
- Подтверждено: Клинически совместимый случай, подтверждающий лабораторные исследования проб окружающей среды.
Случай может быть подтвержден, если лабораторные исследования не проводились, поскольку присутствовало преобладающее количество клинических и неспецифических лабораторных доказательств наличия определенного химического вещества или известна 100% достоверность этиологии возбудителя.
Дополнительные ресурсы
- Агентство регистрации токсичных веществ и заболеваний. Токсикологический профиль белого фосфора. Атланта, Джорджия: Агентство токсичных веществ и регистрации заболеваний, Отдел токсикологии; 2001.
- Harbison RD. Фосфор. В: Харбисон Р.Д., изд. Промышленная токсикология Гамильтона и Харди. 5-е изд. Сент-Луис, Миссури: Ежегодник Мосби; 1998: 194-7.
- Саймон Ф.А., Пикеринг Л.К. Острое отравление желтым фосфором: синдром курения стула. JAMA 1976; 235: 1343-66.
- Talley RC, Linhart JW, Trevino AJ, Moore L, Beller BM. Острое отравление элементарным фосфором у человека: сердечно-сосудистая токсичность. Am Heart J 1972; 84: 139-40.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Анализ бокового потока на основе фосфорной технологии для быстрого и чувствительного обнаружения антител IgG к Trichinella spiralis в сыворотке крови свиней | Паразиты и переносчики
Реагенты и материалы
Хлорид натрия (NaCl), Тритон X-100, Твин 20, 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол (Трис), гидроксид натрия (NaOH), глицин , бычий сывороточный альбумин (BSA), раствор красителя кумасси синего и 4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновая кислота (HEPES) были получены от Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай). Улучшенный хемилюминесцентный (ECL) реагент был приобретен в Thermo Fisher Scientific Inc. (Уолтем, Массачусетс, США). Натриевая соль -гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS) и 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимид (EDC) были приобретены у Aladdin Company (Шанхай, Китай). Азид натрия (NaN 3 ) был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Метанол и NaH 2 PO 4 · 2H 2 O были закуплены у Beijing Chemical Reagent Company (Пекин, Китай).Для всех растворов использовали воду Millipore Milli-Q (> 18 МОм см). Конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи антитела против свиного IgG, козьи против свиного IgG, кроличьи против козьих IgG и козьи против кроличьих IgG были приобретены у Beijing Baiolaibo Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай).
NH 2 -модифицированные UCNP (NaYF 4 : Yb 3+ , Er 3+ ) были получены от Shanghai Shunna Biotech Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Пик возбуждения составлял 980 нм, а пик эмиссии — 545 нм.Мембрана из поливинилиденфторида (ПВДФ) 0,45 мкм была приобретена у GE Healthcare (Чикаго, Иллинойс, США). Нитроцеллюлозные мембраны (Hi-Flow Plus HF135) и подушечки для образцов (стекловолокно SureWick) были приобретены у Millipore Corporation, а впитывающие подушечки и пластиковая основа были приобретены у Shanghai Jieyi Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай).
Инструменты
Многофункциональная система визуализации была приобретена у Analytik Jena GmbH (Апланд, Калифорния, США). Диспенсер XYZ3060 Biostrip и гильотинный резак CM 4000 были приобретены у BioDot (Ирвин, Калифорния, США).Вихревой смеситель был получен от Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd. (Пекин, Китай). Центрифуга Allegra ™ X-22 была получена от Beckman Coulter Inc. (Карлсбад, Калифорния, США). Ультразвуковая водяная баня (мощность 20 кГц, максимальная мощность 320 Вт) была получена от Dongguan Kangshijie Ultrasonic Technology Co., Ltd. (Дунгуань, Китай). Просвечивающий электронный микроскоп (ТЕМ, H-7650) был приобретен у Hitachi (Токио, Япония). Система флуоресцентного спектрометра была приобретена у Beijing ZOLIX Instruments Co.(Пекин, Китай). Оптический лазер с длиной волны 980 нм (макс. 4 Вт) был получен от Ningbo Yuanming Laser Technology Co., Ltd. (Нинбо, Китай). Биосенсор на основе люминофорной технологии с повышающим преобразованием (биосенсор на основе UPT) был получен из Шанхайского института оптики и точной механики Китайской академии наук (Шанхай, Китай).
Животные и паразиты
Самки крыс линии Wistar массой приблизительно 120 г были приобретены в Университете медицинских наук Нормана Бетьюна (NBUMS), Китай. Trichinella spiralis (ISS534), хранящаяся в лаборатории пищевых паразитологов ключевой лаборатории зоонозов Университета Цзилинь, подтверждена Центром сотрудничества МЭБ по пищевым паразитам в Азиатско-Тихоокеанском регионе и поддерживается постоянной инфекцией пассажей в нашей лаборатории.
Получение и характеристика ES-антигенов из ML (ML-ES)
Некоторые ранее описанные методы были использованы для получения ES-антигенов [17, 28]. Вкратце, десять крыс Wistar были инокулированы 3000 T. spiralis по мл на крысу пероральным путем. Инфицированных крыс умерщвляли через 35 дней после заражения (dpi), и ML извлекали из мышечных тканей крыс с помощью искусственной жидкости для пищеварения (1% пепсин / HCl) [29]. После трехкратной промывки 0,01 М фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7.2), ML ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Gibco BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), содержащей антибиотики (100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) в концентрации приблизительно 5000 червей / мл, а затем инкубировали при 37 ° С. C в атмосфере, содержащей 5% CO 2 в течение 18 ч. ML удаляли фильтрованием (фильтр 0,22 мкм, Millipore, США), чтобы получить фильтрат, содержащий антигены ES. Фильтрат концентрировали с использованием ультрафильтра 3 кДа (Millipore, США), а затем использовали PBS для замены среды.Концентрацию ES-антигенов из ML измеряли методом бицинхониновой кислоты (BCA Kits, Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Кроме того, ES-антигены характеризовали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттингом (WB). Вкратце, 10 мкг и 15 мкг ES антигенов отдельно инкубировали в загрузочном буфере при 100 ° C в течение 10 мин, и смешанные образцы подвергали SDS-PAGE в геле с 4% концентрацией и геле для разделения 12%. Разделительный гель окрашивали раствором красителя кумасси синего при комнатной температуре (RT) в течение 2 часов, а затем гель регистрировали с помощью камеры.Между тем, антигены ES в параллельных разделительных гелях были перенесены на PVDF-мембраны. После блокирования в TBST-B (25 мМ Трис, pH 8,0, 125 мМ NaCl, 0,05% Tween 20 (об. / Об.), 3,7% BSA) при комнатной температуре в течение 2 ч мембраны инкубировали с первичными антителами (10 000 T .spiralis -инфицированная сыворотка свиньи, 60 dpi или нормальная сыворотка свиньи) в разведении 1: 200 в TBST-B в течение 12 ч при 4 ° C. Вторичные антитела (конъюгированные с HRP козьи анти-свиньи IgG) в разведении 1: 1000 в TBST-B инкубировали с мембранами в течение 2 часов при комнатной температуре.Мембраны реагировали с реагентом ECL и подвергались воздействию многофункциональной системы визуализации. Антигены ES хранили при -80 ° C до использования.
Получение и характеристика UCNP-ES / козьих анти-кроличьих IgG
ES-COOH / козьих анти-кроличьих IgG-COOH предварительно активировали до его сукцинимида с помощью EDC и сульфо-NHS, а затем реагировали с NH 2 -Фрагмент УНП [30]. Вкратце, 1 мл раствора ES / козьего анти-кроличьего IgG (300 мкг / мл в 10 мМ NaH 2 PO 4 , pH 6.0) инкубировали с 10 мкл 50 мг / мл EDC и 10 мкл 50 мг / мл сульфо-NHS в течение ночи при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Затем буфер HEPES (100 мМ, pH 7,4) использовали для замены буфера NaH 2 PO 4 реакционной системы с ультрафильтром 3 кДа. Полученное сульфо-NHS-активированное ES / антитело ковалентно связывали с 500 мкл NH 2 -UCNP (10 мг / мл в HEPES, pH 7,4) в течение ночи при комнатной температуре. После реакции конъюгации UCNPs-ES / козий антикроличий IgG отделяли от свободного ES / козьего антикроличьего IgG центрифугированием при 28,500 × g в течение 10 мин.Затем UCNPs-ES / козий антикроличий IgG ресуспендировали в буфере для хранения UCP (50 мМ глицин, 0,03% тритон и 0,1% NaN 3 , pH 8,0) в концентрации 1 мкг / мкл и хранили при 4 ° C в течение до 6 месяцев. Морфологическое исследование UCNPs-ES / козьих антикроличьих IgG проводили с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM), которую сравнивали с неконъюгированными UCNP, а размеры конъюгированных и неконъюгированных UCNP измеряли с помощью программного обеспечения (Image-Pro Plus). Спектры излучения с повышением конверсии (UC) конъюгированных и неконъюгированных UCNP регистрировали при возбуждающем свете с длиной волны 980 нм, а физические изображения получали в темной и светлой среде, соответственно.
Разработка и оптимизация анализа UPT-LF-ES
Полоска состояла из прокладки для образца, мембраны NC, впитывающей прокладки и пластиковой основы. Схематическое изображение полосы показано на рис. 1а. После того, как полоска была собрана, анализ был оптимизирован для объема козьего анти-свиного IgG (линия T) (400, 600, 800, 1000 нг / 4 мм) и разведения образца (1: 100, 1: 150, 1: 200, 1: 250, 1: 300). В соответствии с результатами оптимизации полоска была приготовлена следующим образом: козий анти-свиной IgG (800 нг / 4 мм) и кроличий анти-козий IgG (100 нг / 4 мМ) в 10 мМ Трис-HCl (pH 8.0) наносились как Т-образная и С-линия на мембране NC соответственно. Мембрану сушили при 37 ° C в течение 2 часов, а затем собирали на пластиковой основе, которая была расположена с перекрытием 2 мм между подушечкой NC и подушкой для образца или поглощающей подушкой. Собранные карты разрезали на полоску шириной 4 мм с помощью гильотинного резака CM 4000. Готовые полоски хранили в контейнере с сухой упаковкой при комнатной температуре (срок годности: 6 месяцев) до тестирования.
Процедура анализа UPT-LF-ES
Схематическое изображение анализа показано на рис.1b. Подробно анализ включал четыре этапа. Буфер для хранения UCP, содержащий UCNPs-ES / козий антикроличий IgG, суспендировали встряхиванием в течение 10 с. Желаемые количества UCNPs-ES (200 нг) и UCNPs-козьего антикроличьего IgG (50 нг) разводили в буфере для анализа UPT-LF-ES (100 мМ HEPES pH 7,5, 270 мМ NaCl, 0,5% об. / Об. Твин. 20, 1% об. / Об. BSA) до конечного объема 100 мкл и обрабатывают ультразвуком для гомогенизации потенциальных агрегатов [26]. 0,7 мкл образца сыворотки добавляли к аналитическому буферу UPT-LF-ES, содержащему UCNPs-ES и UCNPs-goat anti-rabbit IgG, и перемешивали.Смешанный раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 15–20 мин. Смесь добавляли на подушечку для образца полоски UPT-LF-ES, которую помещали на 15 мин при комнатной температуре, а затем на 5–10 мин при 37 ° C. Полоску сканировали биосенсором на основе UPT. Результаты выражаются в виде сигнала отношения (значение UPT T / C).
Порог отсечения
Для оценки клинической специфичности анализ UPT-LF-ES был проведен с использованием 169 известных отрицательных образцов сыворотки свиней, полученных из лаборатории пищевых паразитологов ключевой лаборатории зоонозов Университета Цзилинь.
Образцы сыворотки
Образцы сыворотки от
T. spiralis экспериментальной инфекцииДевять больших белых свиней (самки, возраст 2 месяца, 20 кг) были получены из Центра экспериментальных животных Медицинского университета Нормана Бетьюна (NBUMS). Китай. Перед экспериментом все свиньи были протестированы с использованием обычных анализов крови и фекалий, и результаты показали, что эти свиньи были здоровы. Затем свиней случайным образом разделили на три группы и экспериментально инокулировали 100, 1000 или 10000 т.spiralis ML. Образцы сыворотки были собраны и подготовлены на 0, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 25, 30, 45, 60, 90 и 120 точек на дюйм, в соответствии с методом сбора, описанным в этой статье [31] . Среднее количество личинок на грамм (LPG) было рассчитано и представлено в ранее опубликованной статье из нашей лаборатории [31]. Эти образцы сыворотки также были протестированы в анализе UPT-LF-ES.
Образцы сыворотки с гетерологичными инфекциями
Набор из 8 образцов от свиней, инфицированных Toxoplasma gondii ( n = 2), цистицерками Taenia solium ( n = 2) и Taenia asiatica. ( n = 2) был протестирован для оценки потенциальной перекрестной реактивности с другими паразитарными инфекциями.Эти сыворотки были предоставлены лабораторией пищевых паразитологов ключевой лаборатории зоонозов Цзилиньского университета.
Одинарная слепая экспериментальная проверка
Проверка анализа проводилась с использованием сывороток из 35 положительных образцов, которые включали различные инфекции с разрешением 120 точек на дюйм, и эти образцы были случайным образом распределены между набором из 20 отрицательных образцов. Эти 35 положительных образцов сыворотки были случайным образом отобраны в банке образцов сыворотки нашей лаборатории [31]. Эти 55 образцов сыворотки были подтверждены с использованием метода магнитной мешалки и WB Лабораторией пищевых паразитологов ключевой лаборатории зоонозов, Университет Цзилинь, и были протестированы с помощью этого анализа в эксперименте с одним слепым методом, который проводился обычным тестером, который проводил анализ. не участвовать в ранней разработке этого теста.Результаты этого эксперимента были оценены с помощью теста Стьюдента t и анализа кривой рабочих характеристик приемника (кривой ROC).
Анализ данных
Площади пиков для T- и C-линий были рассчитаны как относительные единицы интенсивности с помощью программного обеспечения Шанхайского института оптики и точной механики Китайской академии наук, а также значения отношения, при котором сигналы T-линии были разделены сигналами C-линии каждой полосы. Данные были введены в Origin 2020b и представлены в виде гистограмм.Коэффициент каппа ( K ) использовался для измерения согласованности между двумя методами, что позволило нам измерить согласованность сверх того, что ожидалось случайно [32, 33]. Общая формула для K :
$$ K = \, (P_ {o} — P_ {e}) / \ left ({1 — P_ {e}} \ right), $$
где P o и P e — наблюдаемые и ожидаемые пропорции согласия [34].