Сп3 4: СП3-4АМ, 0.125 Вт, 6.8 кОм, 3-20, 20%, Резистор переменный, Тембр

Разное

Содержание

Потенциометр СП3-4

Справочник количества содержания ценных металлов в Потенциометре СП3-4 согласно справочно технической информации и паспортов-формуляров на изделие. Указана масса драгоценных металлов в граммах (Золото, серебро, платина, палладий и другие) на единицу изделия.

Содержание драгоценных металлов в Потенциометре СП3-4

Золото: 0 грамм.
Серебро: 0,0071008 грамм.
Платина: 0 грамм.
Палладий: 0 грамм.

Источник информации: .

Потенциометр
— регулируемый делитель электрического напряжения, представляющий собой, как правило, резистор с подвижным отводным контактом (движком).

Большинство разновидностей переменных резисторов могут использоваться как в качестве потенциометров, так и в качестве реостатов, разница в схемах подключения и в назначении (потенциометр — регулятор напряжения, реостат — силы тока).

Потенциометры используются в качестве регуляторов параметров (громкости звука, мощности, выходного напряжения и т. д.), для подстройки внутренних характеристик цепей аппаратуры (подстроечный резистор), на основе прецизионных потенциометров построены многие типы датчиков углового или линейного перемещения.

О комплектующем изделии – Потенциометр

Потенциометр – видео.

Характеристики потенциометра СП3-4:

Когда требуется обеспечить плавное изменение напряжения на потребителе (нагрузке), применяются потенциометры. Потенциометр – это регулируемый делитель напряжения, представляющий собой, как правило, резистор с подвижным отводным контактом.

Фото СП3-4:

Потенциометр виды

Купить или продать а также цены на Потенциометры СП3-4:

Оставьте отзыв о СП3-4:

СП3-400

Переменный однооборотный резистор не-индуктивного типа, предназначен для работы в электрических цепях переменного, постоянного и импульсивного тока. Мощность 0,25Вт.

параметры сп3-400ам

Промежуточные значения номинальных сопротивлений соответствуют ряду Е6

с допусками ±20%; ±30% ( свыше 1,0 мОм).
Напряжение шумов перемещения, не более ……………….. 68 мВ
Минимальное сопротивление не более:
Резисторов с функциональной характеристикой А
до 2,2 кОм …………………………………………………………………… 10 Ом
свыше 2,2 кОм до 10 кОм ………………………………………………… 20 Ом
свыше 10 кОм до 100 кОм ……………………………………………….. 50 Ом

свыше 100 кОм, не более( от номинального сопротивления) …….. 0,1%
Переходное сопротивление контактов выключателя, не более ………. 0,1 Ом
Температура окружающей среды:
при номинальной электрической нагрузке …………….. От -35 до + 55°С
при снижении электрической нагрузки до 0,25 Рн …… От -35 до + 75°С
Относительная влажность воздуха при температуре +35°С До 95%
Износоустойчивость:
резистора ……………………………………………………… 20 000 циклов
выключателя ………………………………………………….. 10 000 циклов
Момент статического трения подвижной системы:
СП3-400аМ, СП3-4вМ ……………………………………….. 35-250 г/см
СП3-400дМ …………………………………………………….. 70-350 г/см
Предельное рабочее напряжение постоянного или переменного тока 200 В
Угол поворота подвижной системы 300°
Минимальная нароботка ……………………………………….. 15 000 ч
Срок сохраняемости …………………………………………… 10 лет

 

 

потенциометры (резисторы переменные 0,25W  отечественные)
  СП3-400ам ( СП3-4ам )       
    характеристика А ( линейные )
Производитель розница опт от 100шт.
СП3-400ам   1 ком , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. нет
СП3-400ам   2,2 ком , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. нет
СП3-400ам   3,3 ком , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. нет
СП3-400ам   4,7 ком , хар.А , вал 3/20  Россия 50.00р. 20.00р.
СП3-400ам   6,8 ком , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. нет
СП3-400ам   10 ком , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. 20.00р.
СП3-400ам   22 ком , хар.А , вал 3/20
Россия 50.00р. 20.00р.
СП3-400ам   33 ком , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. нет
СП3-400ам   68 ком , хар.В , вал 3/20 Россия 50.00р. 20.00р.
СП3-400ам   100 ком , хар.А , вал 3/20 , вал 3/12 Россия 50.00р. 20.00р.
СП3-400ам   470 ком , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. 20.00р.
СП3-400ам   470  ом , хар.А , вал 3/20 Россия 50.00р. 20.00р.
СП3-400ам   2,2 мом , хар.А , вал 3/12 Россия 50.00р. 20.00р.

 

Резистор СП3-4БМ | Радиодетали в приборах

Справочник содержания драгоценных металлов в радиодеталях, создан на основе справочных данных организаций занимающихся переработкой лома радиодеталей, паспортах устройств, формулярах, этикетках и других открытых источников. Стоит отметить, что реальное содержание может отличатся на 20-30% в меньшую сторону.

Содержание драгоценных металлов в резисторе: СП3-4БМ

Золото: 0
Серебро: 0.110944
Платина: 0
МПГ: 0
По данным: из переченя Роскосмоса

Какие драгоценные металлы содержатся в резисторах

В постоянных резисторах содержится только серебро, которое нанесено на выводы. С переменными резисторами все лучше, в них может содержатся золото, серебро, платина и сплавы палладия. Особо богаты на драгметаллы претензионные переменные резисторы.

Сопротивление резистора — его основная характеристика. Основной единицей электрического сопротивления является ом (Ом). На практике используются также производные единицы — килоом (кОм), мегаом (МОм), гигаом (ГОм). Драгоценные металлы в основном содержатся в переменных и построечных резисторах, в них часто используется палладий в виде бегунков или проволоки реохорды.

Типы резисторов

Существует три основных типа резисторов:
Переменный резистор — это резистор, у которого электрическое сопротивление между подвижным контактом и выводами резистивного элемента можно изменять механическим способом.
Постоянные резисторы, сопротивление у данного резистора не изменить. Как правило имеют только два вывода. В данных резисторах может содержаться только серебро, в виде посеребренных выводов.
Нелинейные. Сопротивление компонентов этого типа изменяется под воздействием температуры (терморезисторы), светового излучения (фоторезисторы), напряжения (варисторы) и других величин.

Основные характеристики резисторов

Номинальное сопротивление (Ом, кОм, мОм).
Максимальная рассеиваемая мощность (0,25 Вт, 0,5 Вт, 1 Вт, и т.д.)
Допуск или класс точности (от этого значения зависит допустимый разброс параметров резистора).

Примеры буквенно-цифрового обозначения резистора

Примеры буквенно-цифрового обозначения для сопротивления, выраженного целым числом:
47 Ом – 47 R;
47 кОм – 47 K;
47 МОм – 47 M.
Если для выражения величины сопротивления используется десятичная дробь, то порядок расположения цифр и букв будет иным, например:
0,47 Ом – R 47;
0,47 кОм – K 47;
0,47 МОм – M 47.
Если сопротивление выражается числом, отличным от нуля и с десятичной дробью, то буква в обозначении играет роль запятой, например:
4,7 Ом – 4R7;
4,7 кОм – 4K7;
4,7 МОм – 4M7.
Допустимая погрешность обозначается в % и проставляется после номинального значения, например ±7%, ±10%, ±40%. Класс точности может определяться буквой, в зависимости от производителя, – русской или латинской.

Поделиться ссылкой:

Понравилось это:

Нравится Загрузка…

Похожее

Специальные патроны СП-3, СП-4

СП-3

В 1972 году на вооружение КГБ СССР и военной разведки принимается бесшумный пистолетный комплекс МСП «Гроза» со специальным патроном СП-3 калибра 7,62х38. Новый комплекс стал дальнейшим развитием другой системы — С4 с линейкой патронов ПЗ. Как и в случае с предыдущим образцом, новой разработкой занимались инженеры Тульского Оружейного завода (ТОЗ) и ЦНИИ ТочМаш.
Специальный патрон СП-3 на первый взгляд практически неотличим от стандартного промежуточного патрона образца 1943 года. Однако внутреннее устройство этого патрона действительно совершенно необычное. Специальный патрон СП-3 обеспечивает бесшумность, беспламенность и бездымность выстрела за счет блокировки пороховых газов в гильзе специальным поршнем после выстрела. В отличие от предыдущих патронов, использовавших такую схему, новый боеприпас использовал двухступенчатый телескопический поршень-толкатель, что позволило сократить габариты самого патрона и соответственно оружия, под него предназначенного.

В целом процесс выстрела выглядит так: в гильзе помещен небольшой пороховой заряд и металлический толкатель, разделяющий заряд и штатную автоматную пулю от промежуточного патрона калибра 7,62 и упирающийся в дно последней. При выстреле пороховые газы, расширяясь, давят на дно толкателя. Толкатель сообщает движение пуле и выталкивает ее. При этом сам толкатель, продвинувшись вперед на длину внутренней полости гильзы до начала ската (перехода корпуса гильзы к дульцу), нижней диафрагмой упирается во внутреннюю поверхность ската и останавливается, запирая пороховые газы в гильзе.


Патрон СП-3 до (вверху) и после (внизу) выстрела.
1 — гильза, 2 — порох, 3 — поршень-толкатель (исходное положение), 4 — пуля (от патрона 7,62х39), 5 — горячие пороховые газы, 6 — поршень-толкатель (после выстрела)

Пуля покидает ствол оружия с начальной скоростью около 190 метров в секунду, а дульная энергия пули составляет около 150 Дж, что вдвое меньше энергии патрона пистолета Макарова, в свою очередь часто критикуемого за недостаточную мощность. Хотя меньший калибр и остроконечная форма пуль патронов СП-3 увеличивают проникающее действие, поражающее действие все равно остается слабым.

Помимо двуствольного пистолета МСП «Гроза», патрон СП-3 используется и в стреляющем ноже разведчика НРС, в полости рукоятки которого помещается однозарядное стреляющее устройство.


Пистолет МСП «Гроза» и патроны СП-3 в стальной обойме


Стреляющий нож разведчика НРС

СП-4

В конце 70-х годов началась разработка нового бесшумного пистолетного комплекса. Главным отличием от предыдущих образцов было то, что новый пистолет должен был быть самозарядным. Ранее осуществить эту идею было крайне затруднительно из-за особенностей патрона СП-3 и линейки патронов ПЗ, так как поршень-толкатель этих патронов значительно выступал из гильзы после выстрела. В результате в ЦНИИ ТочМаш создан пистолет ПСС (конструкторы В. Левченко и Ю.Крылов) и патрон СП-4 калибра 7,62х41 (конструктор — В. Петров). Новый комплекс принят на вооружение КГБ и ГРУ в 1983 году.

Бесшумный патрон СП-4 (индекс ГРАУ — 7Н36) имеет совершенно другую конструкцию, чем его предшественники. Бесфланцевая гильза СП-4 полностью скрывает пулю цилиндрической формы, которая не выступает за передний срез гильзы. За пулей находится поршень без удлиненного толкателя, далее — пороховой заряд и капсюль в дне гильзы. При выстреле поршень воздействует на пулю вплоть до ее выхода из гильзы, но целиком заклинивается в дульце, не выдвигаясь дальше. После выстрела гильза автоматически извлекается из патронника и удаляется из оружия при движении затвора назад под действием отдачи, как гильза обычного патрона.


Патрон СП-4 до (вверху) и после (внизу) выстрела.
1 — гильза, 2 — порох, 3 — поршень-толкатель, 4 — пуля, 5 — горячие пороховые газы, 6 — поршень- толкатель (после выстрела), 7 — медный ведущий поясок (для следования по нарезам ствола)

Автоматная пуля, использовавшаяся в патронах СП-3 и ПЗ, была заменена на специальную, цилиндрическую пулю калибра 7.62-мм. Пуля представляет собой сплошной цилиндр, имеет медный ведущий поясок в головной части и в снаряженном состоянии полностью утоплена в гильзе патрона. За счет того, что поверхность пули механически не взаимодействует с внутренней поверхностью канала ствола — в нарезы врезается только ведущий поясок, расположенный в головной части пули, — нет необходимости в проталкивании пули по всей длине ствола пистолета. Достаточно, чтобы ведущий поясок прошел нарезную часть ствола. Донная часть пули при этом доводится поршнем до дульца гильзы. Поэтому в стреляной гильзе поршень не выступает за пределы дульца.
Под данный патрон, кроме вышеуказанного пистолета ПСС, были созданы стреляющий нож разведчика НРС-2 и револьвер ОЦ-38. В настоящее время все вышеуказанные образцы состоят на вооружении отечественных спецподразделений различных силовых ведомств.

Тактико-технические характеристики бесшумного патрона СП-4:

Характеристики патрона:

Калибр
7,62×41,5
Длина патрона, мм
41,75…41,85
Масса патрона, г
23,10…23,28
Характеристики порохового заряда:

Тип пороха
бездымный, пироксилиновый
Марка пороха
Сф040
Масса порохового заряда, г
0,37…0,40
Плотность заряжания, г/см3
0,938
Максимальное давление пороховых газов, МПа
287,3
Характеристики пули:

Тип пули
безоболочечная
Масса пули, г
9,98…10,00
Длина пули, мм    
28,25…28,45
Диаметр ведущей части пули, мм
7,82…7,85
Баллистический коэффициент пули, м2/кг
6,62
Материал пули
порошковый композиционный сплав
железа, цинка, свинца и марганца
Характеристики гильзы:

Форма и тип гильзы
бутылочная, бесфланцевая
Масса гильзы с капсюлем, г
11,95…12,20
Длина гильзы, мм
41,30…41,45
Материал гильзы
сталь, плакированная
томпаком
Способ крепления пули
плотная посадка
Дополнительные сведения:

Площадь поперечного сечения канала
ствола (пистолет ПСС), см2
0,476
Начальная скорость пули (пистолет ПСС),м/с
195…205
Дульная энергия пули (пистолет ПСС), Дж
189,7…210,1

При написании статьи были
использованы материалы:
журнал «Братишка»
сайт weaponland.ru
«Патроны к стрелковому оружию»
(справочное пособие)

Tag: Оружие_Каталог_оружия_Боевое_оружие_Боеприпасы
Обсуди статью на форуме

Anti-SP3 / 4 Antibody (C10849) Кролик Поликлональные

Антитело

Anti-SP3 / 4 определяет эндогенные уровни общего белка SP3 / 4. Подтверждено для WB и ELISA. Реагирует на человека, мышь, крысу. AssayBiotechnology — производитель оригинальных антител.

Детали

  • Название продукта

    Антитело SP3 / 4

  • Каталожный №

    C10849

  • Хранение / стабильность

    Стабилен при -20 ° C не менее 1 года.

  • Приложения

    WB, ELISA

  • Клональность

    Поликлональный

  • Виды хозяев

    Кролик

  • Реакционная способность

    Человек, Мышь, Крыса

  • Растворы для нанесения

    WB: 1: 500 ~ 1: 1000 ELISA: 1: 10000

  • Ссылки на базу данных

    Идентификатор гена: 6670/6671, Swiss-Prot #: Q02447 / Q02446, OMIM #: 601804/600540, Unigene #: Hs.531587 / HS.88013

  • Иммуноген

    Антисыворотка была продуцирована против синтезированного пептида, полученного из человеческого SP3 / 4.

  • Диапазон иммуногенов

    671-720

  • МВт

    82 кДа

  • Символ гена NCBI

    SP3 / 4

  • Физическая форма

    Кроличий IgG в фосфатно-солевом буфере (без Mg2 + и Ca2 +), pH 7.4, 150 мМ NaCl, 0,02% азида натрия и 50% глицерина.

  • Очистка

    Антитело очищали от кроличьей антисыворотки с помощью аффинной хроматографии с использованием иммуногена.

  • Специфичность

    Антитело

    SP3 / 4 определяет эндогенные уровни общего белка SP3 / 4.

  • Синонимы

    Фактор транскрипции Sp3, SPR-2, SP3, фактор транскрипции Sp4, SPR-1, SP4

  • Модификация цели

    Без изменений / Всего

Изображения приложений

Вестерн-блоттинг лизатов клеток Jurkat с использованием антитела SP3 / 4.Дорожка справа перекрыта синтезированным пептидом.

Вестерн-блоттинг лизатов клеток Jurkat с использованием антитела SP3 / 4. Дорожка справа перекрыта синтезированным пептидом.

Как доехать до Jalan SP3 / 4, BSP в Sepang на автобусе или MRT & LRT

Общественный транспорт до Jalan SP3 / 4, BSP в Сепанге

Не знаете, как доехать до Jalan SP3 / 4, BSP в Sepang, Малайзия? Moovit поможет вам найти лучший способ добраться до Jalan SP3 / 4, BSP от ближайшей остановки общественного транспорта, используя пошаговые инструкции.

Moovit предоставляет бесплатные карты и маршруты в реальном времени, которые помогут вам сориентироваться в вашем городе. Открывайте расписания, поездки, часы работы и узнайте, сколько займет дорога до Jalan SP3 / 4, BSP с учетом данных Реального Времени.

Ищете остановку или станцию ​​около Jalan SP3 / 4, BSP? Проверьте список ближайших остановок к пункту назначения: Таманский алмаз (Утара) (Lg296).

Вы можете доехать до Jalan SP3 / 4, BSP на автобусе или метро. У этих линий и маршрутов есть остановки поблизости: Автобус: T760

Хотите узнать, есть ли другой маршрут, который приведет вас туда раньше? Moovit поможет вам найти альтернативные маршруты или время.Получите инструкции, как легко доехать до или от Jalan SP3 / 4, BSP с помощью приложения или сайте Moovit.

С нами добраться до Jalan SP3 / 4, BSP проще простого, поэтому более 930 млн. Пользователей, включая жителей Сепанга, доверяют Moovit как лучшему транспортному приложению. Вам не нужно загружать отдельное приложение для автобуса или поезд. Moovit — ваше универсальное транспортное приложение, которое поможет вам узнать самое лучшее из доступных расписаний автобусов и поездов.

Для получения информации о ценах на автобус, MRT и LRT, стоимости и стоимости проезда до Jalan SP3 / 4, BSP, пожалуйста, проверьте приложение Moovit.

Bogen 4er Set NMC SP3-4 Ноэль Марке Feinprofil | Панельный багет | NMC | Бренды

Чтобы иметь возможность использовать stuckleistenprofi.de в полном объеме, мы рекомендуем активировать Javascript в вашем браузере.

Englisch

Настройки файлов cookie

Этот веб-сайт использует файлы cookie, которые необходимы для технической работы веб-сайта и всегда устанавливаются. Другие файлы cookie, которые повышают комфорт при использовании этого веб-сайта, используются для прямой рекламы или для облегчения взаимодействия с другими веб-сайтами и социальными сетями, устанавливаются только с вашего согласия.

Englisch

Размер (Ш * В)

13 см x 13 см

Нравится? В список желаний

дужка SP3-4 из твердого полиуретана, предварительно загрунтованная, для SP3 NMC подробнее
  • Тип профиля
  • декоративный элемент
  • набор
  • на картридж
  • 17-20 Stück
  • расход (мл) / M
  • 15 мл / Stück
  • Производитель фильтров
  • NMC
  • Атрибуты
  • можно перекрывать
  • можно шлифовать
  • ударопрочный
  • предварительно грунтованный
  • подходит для ванны
  • Диаметр клеевого жгута
  • 6 мм
Описание дужка SP3-4 из твердого полиуретана, предварительно загрунтованная, для SP3 NMC

Набор SP3-4 содержит четыре идентичных декоративных угловых элемента, которые идеально сочетаются к лепнине СП3-4 производителя NMC.Как и лепнина СП3-4, элементы декора набора СП3-4 имеют современный дизайн с нежными завитушками. Сделайте привлекательный вид на стене или потолке, комбинируя декоративные угловые элементы с декоративным профилем SP3, чтобы создать элегантный каркас стены. Элементы для украшения набора SP3-4 имеют следующие размеры: 13 см x 13 см. Угловые элементы изготовлены из высококачественного пенополиуретана, устойчивого к ударам и атмосферным воздействиям. Как и другие продукты коллекции Arstyl от производителя NMC, декоративные элементы набора SP3-4 предварительно загрунтованы, и для достижения идеального результата необходимо только покрыть их обычной краской для стен и потолка после укладки.Для монтажа угловых элементов рекомендуем использовать монтажный клей Adefix от производителя NMC, так как он гарантирует прочное сцепление лепного элемента с поверхностью. Чтобы установить угловые элементы набора SP3-4 на стену или потолок, вам нужно всего лишь нанести тонкую полоску клея на обратную сторону элемента, чтобы можно было прикрепить его в нужном месте. Если у Вас возникнут дополнительные вопросы по монтажу лепных изделий или комплекта СП3-4, Вы всегда можете связаться с нами по телефону или почте.

Verfügbare Загрузки zu dem Produkt подробнее

Загрузки

Доступные загрузки для этого продукта

Дополнительная информация о сроках доставки и стоимости доставки. подробнее

Информация о доставке

UPS — United Parcel Service Standard Tariff Europe 1 стоимость доставки около 15,00 €

Europa 1 Фиксированная цена: 15,00 €
плюс указанные транспортные расходы на продукты

Europa 2 Фиксированная цена: 39,00
евро плюс указанные транспортные расходы для продуктов

Самовывоз Посетите нас в Reken
Бесплатная доставка

Набор инструментов для обзоров надежных магазинов: 1.1.5

Этот веб-сайт использует файлы cookie, которые необходимы для технической работы веб-сайта и всегда устанавливаются. Другие файлы cookie, которые повышают удобство использования этого веб-сайта, служат для прямой рекламы или упрощают взаимодействие с другими веб-сайтами и социальными сетями, будут использоваться только с вашего согласия.

Границы | Протокол SP3 для подготовки образцов протеомных растений до ЖХ-МС / МС

Введение

Эффективная пробоподготовка для протеомного анализа растений представляет собой серьезную проблему.Растения содержат низкую концентрацию белков и высокий уровень вторичных метаболитов, потенциально мешающих протеомному анализу (Hussein and El-Anssary, 2018). Для разрушения клеточных стенок необходимо применять суровые условия, обычно механическую силу или высокоэффективную обработку ультразвуком. За этими процедурами часто следуют традиционные протоколы экстракции белков (осаждение TCA / ацетоном или экстракция фенолом) для концентрирования белков и предотвращения деградации белка, вызванной большим количеством протеаз. Поскольку осажденные белки часто трудно реолюбилизировать, протоколы экстракции часто содержат хаотропы и поверхностно-активные вещества (Komatsu, 2008; Wang et al., 2008; Такач и др., 2017; Ниу и др., 2018; Jorrin-Novo et al., 2019). В настоящее время протеомика растений перешла от традиционных стратегий на основе геля, в которых многие низко-распространенные, экстремальные pI и гидрофобные белки были недостаточно представлены, к безгелевым рабочим процессам. Следовательно, подходы к пробоподготовке, включающие удаление веществ, мешающих пищеварению, и анализ МС имеют большое значение (Song et al., 2018; Wang et al., 2018).

В последние годы было введено несколько новых стратегий для подготовки протеомных проб, позволяющих проводить эффективный и надежный восходящий анализ.Многие протоколы были основаны на солюбилизации и денатурации цельного лизатного белка додецилсульфатом натрия (SDS). Однако, поскольку применение SDS может иметь и негативные последствия, подавляя как сигнал MS, так и активность протеазы (Min et al., 2015; Scheerlinck et al., 2015), SDS необходимо исчерпать перед расщеплением и анализом MS. Традиционные подходы к удалению поверхностно-активных веществ и других загрязняющих веществ (хаотропов, солей, буферов, растворителей и меток) до анализа МС были рассмотрены в другом месте (Feist and Hummon, 2015; Tubaon et al., 2017). Совсем недавно было предложено несколько новаторских попыток избавиться от загрязняющих веществ, в том числе наиболее широко применяемая подготовка проб с помощью фильтра (FASP), относительно новая пробоподготовка с твердофазной обработкой в ​​одной емкости (SP3) и улавливание суспензии белков. (Ремень).

В рабочем процессе FASP образец лизата подается в центробежный блок ультрафильтрации с отсечкой 30 кДа. Загрязнения с малой массой вымываются, а затем белки перевариваются на мембране. Пептиды, оставшиеся в растворе, готовы для анализа МС (Wiśniewski et al., 2009, 2011). За прошедшие годы были опубликованы различные полезные модификации классического протокола FASP (Erde et al., 2014, 2017; Huber et al., 2014; Glatter et al., 2015; Nel et al., 2015; Lipecka et al., 2016; Li et al., 2017; Ni et al., 2017; Potriquet et al., 2017; Wiśniewski, 2017, 2018, 2019; Zhang et al., 2020). Однако рабочие процессы FASP дороги и требуют много времени. Более того, следы оставшегося SDS часто обнаруживаются после FASP, и их необходимо удалить дополнительной экстракцией этилацетатом (Yeung and Stanley, 2010).Лишь в нескольких исследованиях использовались стратегии FASP для образцов растений, например, листа Arabidopsis thaliana (Song et al., 2018), листа ячменя (Wang et al., 2018) и листа кукурузы (Balliau et al., 2018).

В качестве альтернативы традиционным протоколам FASP в последнее время для пробоподготовки использовались менее трудоемкие и более быстрые стратегии с одним сосудом, которые включали удаление SDS и других веществ, мешающих пищеварению, и анализ МС. Кригсвельд и его команда представили инновационный метод SP3, основанный на эффективном и быстром неселективном связывании белков на парамагнитных шариках с использованием магнитных шариков, модифицированных карбоксилатом Sera-Mag (Hughes et al., 2014). Белки, иммобилизованные на гранулах, отделяются от обычных загрязнителей, и ферментативное расщепление осуществляется непосредственно на гранулах. Следовательно, МС-анализ пептидов, оставшихся в растворе, можно проводить без какой-либо дополнительной очистки. С момента появления этого новаторского подхода были опубликованы более подробные исследования условий, специфичных для протокола SP3 (Moggridge et al., 2018; Dagley et al., 2019). Hughes et al. (2019) обобщили наиболее важные требования для максимальной эффективности процедуры SP3, включая соотношение гранул / белок, рабочую концентрацию гранул в образце и условия разложения на гранулах.Для автоматизированной технологии SP3 Мюллер (Müller et al., 2020) адаптировал робота для обработки жидкостей в 96-луночном формате, подходящем для клинических образцов с низким вводом, начиная с 100 клеток HeLa. В качестве альтернативы карбоксилированным шарикам также широко изучалась смешанная хроматография гидрофильных взаимодействий на магнитных микрочастицах MagReSyn HILIC (ReSyn Biosciences) (Hughes et al., 2014; Stoychev et al., 2017, 2018). Другая методология с одним сосудом, успешно испытанная для удаления загрязняющих веществ, была основана на улавливании белковой суспензии кварцевым фильтром спин-колонки S-Trap (ProtiFi).Загрязняющие вещества могут быть эффективно удалены в проточном потоке, белковая суспензия также облегчает переваривание протеаз (Zougman et al., 2014; HaileMariam et al., 2018; Ludwig et al., 2018).

Представленные препараты образцов для одного сосуда были протестированы в основном для анализа тканей человека и животных, только несколько исследований касались сложных образцов растений. Не было обнаружено, что ни один метод подготовки образцов может быть универсально применим для всех типов образцов. Song et al. (2018) оценили три протокола пробоподготовки для A.thaliana зеленые листья на основе солюбилизации мочевины, экстракции метанолом / хлороформом или экстракции на основе фенола. Все методы были улучшены в сочетании с FASP. Wang et al. (2018) проанализировали листья ячменя и сравнили два протокола FASP с использованием SDS или дезоксихолата натрия и трех протоколов в растворе. Два протокола на основе спиновых фильтров обеспечили более высокую эффективность, чем другие протоколы. Lewandowska et al. (2019) не очень успешно применили SP3 Carboxy или SP3 HILIC к пыльникам ячменя.На сегодняшний день не было опубликовано ни одного исследования очистки листьев зеленых растений SP3.

Как упоминалось выше, большая часть комплексного сравнительного анализа касалась белков человеческого и животного происхождения. Следующие исследования показали довольно разные результаты: Sielaff et al. (2017) оценили протоколы по карбоксилат-модифицированным гранулам, FASP и in-StageTip (iST) для белков клеток HeLa. Все три рабочих процесса показали одинаковые результаты для 20 мкг белка. В отличие от FASP, как SP3, так и iST обеспечивали высокий уровень протеомного покрытия даже на уровне 1 мкг.Стойчев и др. (2017) изучали экстракт клеток карциномы толстой кишки; рабочий процесс HILIC SP3 обеспечил примерно двукратное увеличение извлечения пептидов и более чем 30% увеличение идентифицированных посттрансляционных модификаций пептидов и уникальных белков по сравнению с FASP или SP3 на карбоксилированных гранулах. Моггридж и др. (2018) обнаружили, что эффективность SP3 на гранулах HILIC по сравнению с карбоксилированными гранулами сопоставима с лизатом клеток HEK; карбоксилированные шарики показали значительную экономию затрат на анализ. Ludwig et al. (2018) оценили S-Trap, FASP и раствор в растворе лизата клеток колоректального рака SW480.S-Traps превосходит другие методы независимо от условий лизиса. HaileMariam et al. (2018) протестировали S-ловушку (одно- или 96-луночный фильтровальный планшет) и FASP для бактериального лизата цельных клеток и мокроты человека; оба дали сходные результаты в отношении идентификации белков и пептидов. Дагли и др. (2019) сравнили SP3 и FASP для лизата HeLa; оба метода обнаружили сопоставимое количество пептидов. Гонсалес-Лозано и др. (2019) объединили протокол иммунопреципитации для белков мозга мыши с очисткой FASP или захватом SP3 на карбоксилированных гранулах; никаких серьезных различий в идентификации не обнаружено.Как описано выше, определенные стратегии очистки могут иметь неоднозначное влияние на образцы различного происхождения.

В этом исследовании мы оценили четыре метода обработки образцов, примененных к модельному растению A. thaliana ; лизаты целых листьев обрабатываются четырьмя рабочими процессами: классическим FASP, двумя протоколами SP3 с использованием карбоксилированных или парамагнитных гранул HILIC и протоколом S-Trap. Оценка эффективности протеомного анализа, а также время, необходимое для подготовки образца, и стоимость одного образца показывают, что протокол SP3 для карбоксилированных гранул может быть выбран в качестве предпочтительного метода.Наконец, представлен надежный оптимизированный протокол SP3, применимый для широкого диапазона вводимых количеств белка, и его производительность сравнивается с протоколом FASP, который обычно используется в нашей лаборатории. Тщательно оптимизированный рабочий процесс SP3 дает возможность превзойти другие стратегии подготовки образцов белка, особенно для малых количеств белка, и может обеспечить прочную платформу для широких протеомных приложений не только на растениях.

Материалы и методы

Растительный материал и условия роста

Arabidopsis thaliana экотипа Columbia 0 растения выращивали на почве, через 3 недели после посадки листья розетки собирали и измельчали ​​в жидком азоте в морозильной камере / мельнице 6870 (SPEX SamplePrep) в трех циклах по 2 мин измельчения и 2 мин охлаждения.Мелкий растительный порошок хранили при -80 ° C.

Экстракция белка

Лизис SDT: аликвоту 1 г замороженного порошка растительной ткани AT солюбилизировали в Thermo Mixer C (Eppendorf) в 1 мл горячего буфера SDT (4% SDS, 100 мМ DTT; 100 мМ Tris-HCl, pH 7,6) в течение 2 дней. ч при 95 ° C и 1000 об / мин. Для удаления нерастворимого материала из образца экстракт центрифугировали при комнатной температуре (RT) 10 мин и 20 000 g.

Анализ флуоресценции триптофана

Для количественной оценки белков и пептидов на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Agilent Technologies) был проведен чувствительный анализ, основанный на флуоресцентной спектрометрии триптофана в буфере, содержащем 8 M мочевины (Wiśniewski and Gaugaz, 2015).Анализ (в отличие от обычных колориметрических белков) полностью совместим с веществами, обычно используемыми для лизиса тканей, такими как поверхностно-активные вещества или восстанавливающие агенты. Экспериментальный выход рассчитывали как отношение соответствующих количеств пептидов, образующихся после переваривания, и количеств входящего белка, полученных на основании измерений флуоресценции триптофана.

Алкилирование и тушение

Алкилирование и тушение белков для протоколов SP3 HILIC, SP3 Carboxy и S-Trap было первоначально выполнено в соответствии с Moggridge et al.(2018). В окончательных протоколах карбоксилированных шариков SP3, йодацетамид (ИУК) добавляли до конечной концентрации 20 мМ, и смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте, Thermo Mixer, 600 об / мин при 24 ° C. Образцы гасили добавлением дитиотреитола (DTT) до конечной концентрации 5 мМ DTT.

Подготовка проб с помощью фильтра

Центробежные фильтры-концентраторы Microcon-30 кДа MRCF0R030 (для загрузки белка 0,1–100 мкг) и блок центробежного фильтра Amicon Ultra-4 UFC803096 (для загрузки 5 мг белка) были приобретены у Merck.В ранее установленной процедуре FASP, описанной Wiśniewski (2019), экстрагированные белки переносили в центрифужные фильтрующие элементы, промывали 8 М мочевиной, а затем 50 мМ бикарбонатом аммония центрифугированием при 14000 g. Белки расщепляли трипсином, фермент / белок 1:50 (или 1: 100 для нагрузки 5 мг) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Согласно Yeung и Stanley (2010) из-за неполного удаления SDS (следы иногда наблюдались во время анализа MS), триптические пептиды всегда экстрагировались в этилацетат, не смешивающийся с водой.

SP3 Карбокси

Магнитные шарики

Sera-Mag, модифицированные карбоксилатом, и SpeedBeads (GE Life Sciences) имеют свободные карбоксильные группы на поверхности для ковалентного связывания целевых молекул. Один слой (Sera-Mag Beads) или два слоя (Sera-Mag SpeedBeads) наносят на сердцевину бусинок. Sera-Mag Beads, гидрофильные твердые вещества, модифицированные карбоксилатом (GE Life Sciences), кат. нет. 24152105050250, были объединены 1: 1 с гидрофобными твердыми веществами, кат. нет. 44152105050250. Подробная пошаговая версия базового протокола SP3 для очистки белка, обрабатывающего нагрузку белка в диапазоне от 0.1–100 мкг доступно в дополнительном материале. Sera-Mag SpeedBeads, гидрофильные твердые вещества, модифицированные карбоксилатом (GE Life Sciences), кат. нет. 45152105050250, были 1: 1 в сочетании с гидрофобными твердыми веществами, кат. нет. 65152105050250. Подробная пошаговая версия протокола Large-Scale SP3 для очистки белка, обрабатывающего нагрузку белка до 10 мг, доступна в дополнительном материале.

SP3 HILIC

Магнитные многомодовые микрочастицы HILIC MagReSyn HILIC (ReSyn Biosciences) использовали в соответствии с инструкциями производителя (руководство по продукту MagReSyn HILIC) и протоколом RAPOBD (протокол для очистки восстановленных и алкилированных белков с расщеплением на гранулах ).Подробная версия протокола доступна в дополнительных материалах.

S-образная ловушка

S-Trap Mini Spin Columns (ProtiFi) использовали в соответствии с немного измененными инструкциями производителя ( S-Trap Mini Spin Column Digestion Protocol 3.6 ). Подробная версия протокола доступна в дополнительных материалах.

Переваривание белков

Трипсин с модифицированной последовательностью

был приобретен у Promega. Переваривание очищенных образцов белка происходило в 50 мМ бикарбонате аммония (AB) при 37 ° C и 1000 об / мин с использованием Thermo Mixer C.Время переваривания указано для отдельных экспериментов и в окончательных протоколах.

Контроль качества пептидов после протоколов карбокси FASP и SP3

Первоначальный контроль качества смеси пептидов и измерения концентрации перед сравнительным тестом методов FASP и SP3 Carboxy и для оптимизации протокола SP3 Carboxy были выполнены системой Ultimate 3000 RSLCnano (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), подключенной к УФ-излучению. -Vis-детектор и масс-спектрометр с ионной ловушкой HCT Ultra (Bruker Daltonics, Бремен, Германия).Обработанную смесь пептидов разделяли на неподвижную фазу C18 (Acclaim PepMap C18, частицы 2 мкм, 75 мкм × 150 мм) с помощью следующих подвижных фаз (A: 0,1% FA в воде; B: 0,1% FA в 80% ацетонитриле, скорость потока 300 нл / мин) и градиент: элюирование начиналось с 2% (0–4 мин) подвижной фазы В, увеличивалось с 2 до 60% (4–44 мин), затем увеличивалось до 80% в течение 1 мин и оставалось на уровне это состояние в течение следующих 5 мин. Концентрацию пептида в образцах получали из калибровочной кривой клеток MEC1.Калибровочная кривая состоит из пяти калибровочных точек и охватывает диапазон 10–500 нг. На основании этих результатов соответствующий объем образца, соответствующий 2 мкг смеси пептидов, вводили во время заключительного анализа ЖХ-МС / МС.

Анализ ЖХ-МС / МС — Сравнение четырех методов подготовки проб, корректировка протокола карбокси SP3

Система

Ultimate 3000 RSLCnano в режиме онлайн, подключенная к гибридному спектрометру Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), использовалась для анализа оценки метода и оптимизации протокола SP3 Carboxy.Перед разделением ЖХ триптические гидролизаты концентрировали и обессоливали, используя улавливающую колонку (100 мкм × 30 мм, 40 ° C), заполненную 3,5-мкм сорбентом X-Bridge BEH 130 C18 (Waters). После промывки улавливающей колонки 0,1% муравьиной кислотой (FA) пептиды элюировали из улавливающей колонки на аналитическую колонку (Acclaim Pepmap100 C18, частицы 3 мкм, 75 мкм × 500 мм, 40 ° C; Thermo Fisher Scientific) и разделены 120-минутной программой нелинейного градиента (подвижная фаза A: 0,1% FA в воде; подвижная фаза B: 0.1% ЖК в 80% ацетонитриле). Уравновешивание улавливающей колонки и колонки было выполнено перед вводом пробы в петлю для проб. Выход аналитической колонки был напрямую подключен к источнику ионов Digital PicoView 550 (New Objective) с опцией защитного газа и эмиттером SilicaTip (New Objective; FS360-20-15-N-20-C12). Установлено устройство активного фонового снижения ионов (ABIRD, ESI Source Solutions). Данные МС были получены в соответствии со стратегией, зависящей от данных, с отбором до 10 основных предшественников на основе содержания предшественников в обзорном сканировании ( m / z 350–2000).Разрешение обзорного сканирования составляло 60 000 (при m / z 400) с целевым значением 1 × 10 6 ионов, одно микросканирование и максимальное время инжекции 1000 мс. Спектры HCD MS / MS были получены с целевым значением 50 000 и разрешением 15 000 (при m / z 400). Максимальное время впрыска для МС / МС составляло 500 мс. Динамическое исключение было включено на 45 с после получения одного МС / МС спектров. Окно изоляции для фрагментации МС / МС было установлено на 2 m / z .

Анализ ЖХ-МС / МС — сравнительный тест FASP и SP3 Carboxy

Для измерения окончательного набора данных использовались следующие материалы и методы.Масс-спектрометрический анализ смеси пептидов проводили с использованием системы RSLCnano (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), подключенной к системе Orbitrap Q-Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). Перед разделением ЖХ триптические гидролизаты были сконцентрированы и обессолены в оперативном режиме с использованием картриджной улавливающей колонки (300 мкм × 5 мм), заполненной сорбентом C18 PepMap100 с частицами 5 мкм (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Пептиды элюировали из улавливающей колонки на аналитическую колонку Acclaim Pepmap100 C18 (частицы 3 мкм, 75 мкм × 500 мм; Thermo Fisher Scientific) и разделяли с помощью следующей программы градиента (подвижная фаза A: 0.1% ЖК в воде; подвижная фаза B: 0,1% FA в 80% ацетонитриле, расход 300 нл / мин). Градиентное элюирование начиналось с 2% (0–5 мин) подвижной фазы B, увеличивалось с 2 до 35% (5–107 мин), затем линейно увеличивалось до 80% (107–115 мин) подвижной фазы B и оставалось на уровне это состояние в течение следующих 5 мин. Уравновешивание улавливающей колонки и колонки было выполнено перед вводом пробы в петлю для проб. Для контроля качества пептиды Biognosys iRT добавляли во время каждого анализа. Выход аналитической колонки был напрямую связан с источником ионов Digital PicoView 550 (New Objective) с опцией защитного газа и эмиттером SilicaTip (New Objective; FS360-20-15-N-20-C12).ABIRD (ESI Source Solutions) был установлен. Данные МС были получены с использованием стратегии, зависящей от данных, с отбором до 20 основных предшественников на основе содержания предшественников в обзорном сканировании ( m / z 350–2000). Разрешение обзорного сканирования составляло 120 000 (при m / z 200) с целевым значением 3 × 10 6 ионов и максимальным временем инжекции 100 мс. Спектры HCD MS / MS были получены с целевым значением 5 × 10 4 и разрешением 15000 (при m / z 200).Максимальное время впрыска для МС / МС составляло 50 мс. Динамическое исключение было включено на 40 с после получения одного МС / МС спектров. Окно изоляции для фрагментации МС / МС было установлено на 1,2 m / z .

Идентификация белков и количественная оценка белков без этикеток

Обработка файлов данных RAW была выполнена с использованием протеомной платформы Maxquant (Cox and Mann, 2008, MQ) (версия 1.6.10.43) со встроенной поисковой системой Andromeda (Cox et al., 2011). Поиск данных проводился по Uniprot A.thaliana (версия от 201) и база данных контаминантов MQ. Потенциальные примеси, обратные последовательности и белки, идентифицированные только сайтом модификации пептида, были отфильтрованы из окончательного списка групп белков. Толерантность первого поискового пептида была установлена ​​на уровне 20 частей на миллион. Для основного поиска были установлены ограниченные значения 4,5 и 20 ppm для ионов-предшественников и фрагментов. Применяли индивидуальную толерантность к пептидной массе. Карбамидометилирование цистеина было задано как фиксированная модификация, тогда как окисление (M) и дезамидирование (N, Q) были заданы как переменные.Трипсин использовали в качестве фермента, расщепляющего белок с одним и двумя пропущенными расщеплениями. Для окончательной оценки данных учитывались только пептиды и белки с ложными показателями обнаружения (FDR; q -значения) <1%. Анализ контроля качества был выполнен с помощью инструмента PTXQC (Bielow et al., 2016; v.1.0.1). Последовательный биоинформатический анализ проводился с использованием Perseus (Тянова, Кокс, 2018; т. 1.6.10.50). Данные масс-спектрометрической протеомики были депонированы в ProteomeXchange Consortium через PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) партнерский репозиторий с идентификатором набора данных PXD022688.

Анализ онтологии генов

Классификация белков и картирование в соответствии с клеточными компонентами (GOCC, клеточный компонент генной онтологии) были выполнены с помощью программного обеспечения Perseus (v. 1.6.10.50). Arabidopsis thaliana Аннотации белков были загружены с https://datashare.biochem.mpg.de/s/qe1IqcKbz2j2Ruf. Для аннотаций идентичность групп белков была суммирована для каждого повтора на уровне белка.Подсчитывали частоту GOCC для каждого выражения и рассчитывали относительное содержание в образцах. Данные были отсортированы по убыванию.

Результаты

В качестве первого шага мы выбрали четыре установленных метода и сравнили их эффективность для обработки типичных образцов растительного белка, SDS-содержащих белковых экстрактов листьев A. thaliana . Затем мы остановились на двух наиболее перспективных техниках. Мы оптимизировали методику SP3 для широкого диапазона нагрузок растительным белком и, наконец, мы сравнили производительность наших протоколов SP3 с методом FASP, который был взят в качестве эталона.

Сравнение четырех методов подготовки проб

Первоначальное сравнение подготовки образцов для восходящей протеомики с использованием 60 мкг общей белковой нагрузки AT было основано на ранее описанных методах: SP3 на карбоксилированных гранулах (Hughes et al., 2014; Moggridge et al., 2018), SP3 on Гранулы HILIC (протокол очистки восстановленных и алкилированных белков с перевариванием на гранулах, получено с http://www.resynbio.com/hilic), S-Trap (Zougman et al., 2014) и FASP (Wiśniewski et al. ., 2009). В этом случае мы применили рекомендованные протоколы для всех четырех методов. Что касается условий переваривания, мы оценили последовательное переваривание трипсином в нашем эксперименте, поскольку сообщалось о снижении активности модифицированного трипсина с блокированным автолизом, которое со временем находилось в растворе (Finehout et al., 2005), а мультиферментное переваривание успешно применялось к белковым экстрактам в основном из млекопитающих. клеточные культуры (Wiśniewski, Mann, 2012). В отличие от сообщенных положительных эффектов мультиферментного переваривания, мы не обнаружили существенных различий при сравнении ночного переваривания трипсином при 37 ° C и переваривания смесью трипсин / LysC в тех же условиях в случае нашего растительного материала (данные не показаны), и мы больше не исследовал вариант мультиэнзима.В случае последовательного переваривания за первым этапом переваривания с 6 мкг трипсина следовала вторая стадия, когда оставшиеся белки впоследствии расщеплялись свежей загрузкой 6 мкг трипсина. Первоначальное соотношение протеаза: белок 1:10 было увеличено до 1: 5 после второго добавления фермента. Все образцы обрабатывали в трех экземплярах.

Мы протестировали в общей сложности 16 комбинаций: четыре рабочих процесса подготовки образца (SP3 на карбоксилированных шариках, SP3 на шариках HILIC, S-Trap и FASP) при различных общих временах разложения (4, 8 и 18 часов), три из них представлены путем двойного добавления трипсина: 2 + 2, 4 + 4, 2 + 16 ч инкубации при 37 ° C.Результаты сравнивали со стандартным непрерывным перевариванием в течение 18 часов. Первоначально мы измерили конечное количество пептида с помощью анализа триптофана и рассчитали восстановление отдельных методов при данных условиях переваривания (рис. 1). Извлечение пептидов методом SP3 Carboxy явно превосходит методы SP3 HILIC и S-Trap. Метод FASP был вторым по эффективности, обеспечивая на 10–20% меньшее извлечение по сравнению с методом SP3 Carboxy. Значения извлечения не корректируются на входное количество трипсина (12 или 6 мкг), поэтому их следует использовать только для сравнительных целей.

Рисунок 1 . Извлечение пептидов основано на концентрации пептидов, полученной с помощью анализа триптофана. Восстановление не корректируется добавлением трипса.

Затем мы оценили влияние общего времени инкубации и / или добавления трипсина на эффективность переваривания на основе результатов анализа ЖХ-МС / МС. Относительное содержание пропущенных расщеплений рассчитывали как среднее из трех повторностей всех идентифицированных пептидных последовательностей, а также долю суммарной интенсивности пептидов (дополнительный рисунок S1), показывающую долю пептидов с одним ошибочным расщеплением в диапазоне 10–18 и 7– 15% соответственно по всем методам при заданных условиях.Наименьшую специфичность показал метод SP3 HILIC (15–18%), но в целом достоверных различий не наблюдалось. На основании этих результатов мы выбрали 18-часовое переваривание без дальнейшего добавления трипсина и соотношение трипсин: белок 1:10 в качестве эталонных условий для дальнейшего анализа данных.

В этих условиях пищеварения мы сравнили количество идентифицированных белковых групп и вариабельность индивидуальных методов.

Что касается количества идентифицированных белковых групп и пептидов, FASP и SP3 Carboxy дали почти идентичные средние числа (рис. 2А; дополнительная таблица 1).SP3 HILIC дал немного меньшее среднее количество идентифицированных групп белков, но наибольшее количество идентифицированных пептидов. Наименьшее среднее количество идентифицированных групп белков было получено с помощью S-Trap. Вероятно, это связано с недостаточным удалением SDS, которое мы не смогли исправить.

Рисунок 2 . Сравнение производительности SP3 Carboxy, FASP, SP3 HILIC и S-Trap (18-часовое переваривание, трипсин: белок 1:10, три повтора). (A) Среднее количество идентифицированных групп белков (гистограмма) и пептидов (линейная диаграмма).Техническая изменчивость группы белков и обнаружения пептидов отображается в виде столбцов ошибок. (B) Коэффициенты вариации интенсивности группы белков (%). Учитывались только общие группы белков ( n = 1986) во всем наборе данных. Применялась нормализация медианы [данные были преобразованы в журнал (2) ].

Чтобы оценить общую корреляцию между отдельными методами, коэффициент детерминации ( R 2 ) был оценен для образцов, переваренных в течение 18 часов (дополнительный рисунок S2).Введенное количество было скорректировано на основе предыдущего анализа контроля качества, и была применена медианная нормализация для устранения систематической ошибки, полученной из небиологических источников. Для расчетов учитывалась средняя интенсивность группы белков в трех повторах и только общие группы белков ( n = 1986) по всему набору данных. Самая высокая корреляция ( R 2 = 0,88) наблюдалась между методами FASP и SP3 Carboxy, с другой стороны самая низкая корреляция ( R 2 = 0.73) находился между методами S-Trap и SP3 HILIC. Для оценки технической изменчивости каждого метода (три повтора) были рассчитаны ящичковые диаграммы для коэффициентов вариации (CV) (рис. 2B). Самый низкий средний CV (12,1%) был показан методом SP3 HILIC, SP3 Carboxy (15,3%) и FASP (15,5%) были почти на одной линии, а самая высокая вариабельность (CV = 23,4%) была получена методом S-Trap.

Таким образом, SP3 Carboxy и FASP и SP3 HILIC обеспечили сопоставимую производительность в случае A.thaliana , белковые экстракты, содержащие SDS. Более того, представленный подход SP3 с карбоксилированными шариками продемонстрировал несколько преимуществ — простоту в обращении, короткое время работы и более низкую стоимость по сравнению с другими протестированными методами. Стоимость одного образца шариков Sera-Mag более чем в десять раз ниже, чем стоимость колонок FASP, HILIC или S-Trap. Воодушевленные результатами сравнительного анализа, мы выбрали для обработки растительного материала рабочий процесс SP3 с карбоксилированными магнитными шариками для дальнейшей оптимизации с последующим всесторонним сравнением с методом FASP.На основании низкого извлечения пептидов (см. Рисунок 1) протоколы SP3 HILIC и S-Trap не были выбраны для дальнейшей оптимизации.

Корректировка протокола Carboxy SP3

Хотя недавно опубликованные протоколы SP3 с использованием карбоксилированных шариков уже были широко оптимизированы (Moggridge et al., 2018; Dagley et al., 2019; Hughes et al., 2019), они единодушно призвали к корректировке выбранных параметров (например, количества шариков). или трипсин) к определенному входу белка. Несмотря на то, что наш протокол был специально разработан в соответствии с рекомендациями, рабочий процесс был разумно изменен с целью гарантировать применимость метода для широкого диапазона белков без необходимости корректировать количество гранул или трипсина в зависимости от входящего белка.Мы оптимизировали протокол SP3 Carboxy для двух репрезентативных общих вводимых количеств белка: 1 мкг и 10 мг в белковом экстракте, содержащем SDS (буфер SDT).

Базовый протокол — до 100 мкг белка на входе

В случае с базовым протоколом мы сосредоточились на производительности SP3 Carboxy для малых вводимых количеств, и мы выбрали входной белок 1 мкг. Наряду с ранее рекомендованными параметрами (Hughes et al., 2019), касающимися соотношения гранул: белок, рабочих объемов и соотношения трипсин: белок, мы уменьшили соотношение гранулы: белок в 10 раз и также протестировали различные соотношения трипсин: белок (Рисунок 3A). .Все остальные параметры, используемые для этого эксперимента (рабочие объемы и т. Д.), Можно найти в основном протоколе (см. Дополнительные материалы). Результаты показывают, что для малых количеств белка в микрограммах большой избыток гранул не вреден; это даже предпочтительно для получения удовлетворительных результатов. Напротив, уменьшение соотношения гранулы: белок в 10 раз привело к снижению среднего количества идентифицированных белков (рис. 3В). Точно так же высокий избыток трипсина (соотношение фермент: белок 2: 1) был полезен для переваривания небольшого количества белка.Уменьшение соотношения трипсин: белок привело к уменьшению количества идентифицированных белков / пептидов и увеличению количества пептидов с одним или несколькими ошибками расщепления (более 30% для соотношения 1:50, рис. 3C).

Рисунок 3 . Сравнение эффективности метода SP3 Carboxy для 1 мкг исходного количества образцов Arabidopsis thaliana . (A) Обзор условий, применяемых в этом эксперименте. (B) Среднее количество белковых групп и пептидов, идентифицированных при данных условиях.Техническая изменчивость белковых групп и обнаружение пептидов отображается в виде столбцов ошибок для трех повторов. (C) Относительное содержание пропущенных расщеплений (%) соответствует количеству идентифицированных пептидов без какого-либо пропущенного расщепления (зеленый) с одним (оранжевый) и двумя (серый) пропущенными расщеплениями. Данные рассчитывались как среднее значение из трех повторов. Стандартное отклонение применялось для расчета планок погрешностей.

Поскольку не наблюдалось отрицательного эффекта значительного избытка гранул для обнаружения низких нагрузок в микрограммах, мы выбрали 600 мкг гранул и 2 мкг трипсина в качестве компромисса в отношении соотношений гранулы: белок и трипсин: белок даже для более широкого диапазона ввода белка, и использовал их для заключительного эксперимента по обработке трехпорядкового диапазона входных белков (0.1–100 мкг), что соответствует содержанию белка в большинстве образцов белка, обработанных в нашей лаборатории.

Крупномасштабный протокол — входные белки, мг

Поскольку огромное количество входящего белкового материала может потребоваться для последующей обработки, предшествующей ЖХ-МС / МС (например, для обогащения иммунопреципитации; ацетиломный анализ; Mo et al., 2015; Lv et al., 2016; Hartl et al. , 2017; Basisty et al., 2018; Liu et al., 2019) 10 мг образца общего белка A. thaliana использовали для тестирования протокола SP3 Carboxy.Опять же, метод SP3 использовался напрямую без какой-либо предыдущей стадии осаждения белка с использованием белкового экстракта, содержащего SDS. Это высокое количество белка предъявляет повышенные требования к эффективности стадии связывания с белком, а также к количественному высвобождению пептидов из гранул. В этом эксперименте были протестированы три соотношения гранул: белок и два соотношения трипсин: белок для оценки правильного переваривания и количественного высвобождения пептидов из гранул (рис. 4). Наибольшее извлечение пептидов мы получили при соотношении гранулы: белок 10: 1 (более высокие отношения не тестировались в отношении потребления гранул).Как и ожидалось, выход пептидов снижался при более низком соотношении гранулы: белок (в случае соотношения 1: 1 в 2,5 раза по сравнению с соотношением 10: 1). Нагрузка трипсином 200 мкг имела незначительный эффект по сравнению с 100 мкг. Чтобы оценить возможные потери образца, мы добавили дополнительные этапы промывки 50 мМ бикарбонатом аммония после сбора раствора гидролизата из шариков. Подробный протокол со всеми другими параметрами, используемыми для этого эксперимента (рабочие объемы и т. Д.), Можно найти в крупномасштабном протоколе (см. Дополнительные материалы).

Рисунок 4 . Сравнение эффективности метода SP3 Carboxy для вводимого количества 10 мг образцов A. thaliana . (A) Обзор условий, применяемых в этом эксперименте. (B) Полученные извлечения (включая первую стадию промывки) для индивидуальных условий.

Количество пептидов на первом этапе промывки составляло до 12% от исходного количества (дополнительный рисунок S3). Количество пептида на второй стадии дополнительной промывки было довольно низким (<3%).Таким образом, объединение дайджеста и первой промывки улучшит качественную и количественную оценку высоконагруженных образцов, и это было реализовано в протоколе.

Таким образом, эти результаты доказали способность метода SP3 Carboxy для обработки образцов белка с высокой нагрузкой до 10 мг, предлагая соотношение гранул: белок 10: 1 и трипсин: белок 1: 100 для эффективной обработки, включая комбинацию одного промывание шариков исходным супернатантом переваривания, как указано выше.

Сравнительный тест динамического диапазона методов карбокси FASP и SP3

Мы сравнили предлагаемые протоколы SP3, в которых используются карбоксилированные магнитные шарики (см. Дополнительные материалы), с установленной процедурой FASP, обычно используемой в нашей лаборатории. Оба метода были протестированы для диапазона 0,1–100 мкг белка AT (Basic SP3), а также для 5 мг белка AT (Large-Scale SP3). Образцы анализировали с помощью ЖХ-МС / МС в трех повторностях. Повторяемость метода оценивалась с помощью пятикратных измерений для 100 мкг введенного белка.Образцы анализировали в порядке возрастания белковой нагрузки. Только половину окончательно переваренной пробы вводили в количестве 0,1 и 1 мкг, чтобы предотвратить потерю пробы из-за технических проблем. В случае более высоких нагрузок образца (≥10 мкг) мы вводили около 2 мкг смеси триптических пептидов только для уменьшения насыщения детектора.

Наблюдалось значительное увеличение среднего количества PG на реплику и количества уникальных PG (сумма на все повторы), идентифицированных для трех наименьших белковых нагрузок (0.1, 1 и 10 мкг) методом SP3 Carboxy. Среднее количество идентифицированных белковых групп составило 766 (1018 уникальных белковых групп) с использованием SP3 Carboxy по сравнению с 504 (690) по FASP в случае нагрузки 0,1 мкг белка и 2755 (3032) PG по сравнению с 2253 (2703) PG, идентифицированными с помощью SP3 Carboxy и FASP соответственно при нагрузке 1 мкг. Среднее количество и количество уникальных белковых групп существенно не различались для нагрузок 100 мкг белка между методами. Среднее количество идентифицированных PG было примерно на 4% ниже в случае ввода 5 мг белка с использованием крупномасштабного SP3, подтверждающего возможность использования крупномасштабного протокола (рисунок 5; дополнительный рисунок S4).

Рисунок 5 . Сравнение среднего количества идентифицированных белковых групп для методов SP3 и FASP превышало проверенный диапазон белковой нагрузки. Стандартное отклонение применялось для расчета планок погрешностей. Данные рассчитывались как среднее значение из 3 или 5 (100 мкг) повторов. Только половину окончательно переваренной пробы вводили в количестве 0,1–1 мкг, чтобы предотвратить потерю пробы из-за технических проблем. В случае более высоких нагрузок образца (≥10 мкг) мы вводили около 2 мкг смеси триптических пептидов.

3% -ный коэффициент вариации для среднего числа идентифицированных белковых групп при нагрузке 100 мкг был обнаружен для обоих методов, с общим максимальным CV 9% для количества идентифицированных белковых групп, превышающих диапазон тестирования. Обнаруженные белки охватывали более шести порядков интенсивности. Диаграмма Венна показывает 88% пересечения уникальных PG, идентифицированных в пятикратном измерении для методов SP3 и FASP (рис. 6A). Оба набора данных имели общие (4821) белковые группы (всего идентифицировано 5 487 PG). Он соответствует 22 371 общему пептиду, что составляет более 52% всех идентифицированных пептидных последовательностей для обоих методов (всего 42 903 уникальных пептида; функциональное соответствие между сериями не используется).

Рисунок 6 . Качественное и количественное сравнение протокола FASP и Basic SP3 (100 мкг белка на входе, пентапликат). (A) Перекрытие идентифицированных уникальных групп белков. (B) График разброса логарифмически трансформированных интенсивностей общих PG. Подходы средней интенсивности и медианы нормализации были использованы для расчета интенсивности группы белков. (C) Коэффициент вариации общих интенсивностей PG.

Об одинаковой эффективности обоих методов на количественном уровне свидетельствует высокое значение коэффициента детерминации, превышающее 0.91, рассчитанный на основе интенсивностей идентифицированных групп белков, обнаруженных во всех 10 образцах (3073 PG). Для оценки повторяемости метода использовали CV для интенсивности группы белков между обоими методами. После нормализации медианы мы получили медианное значение CV 22,12 и 23,53% для методов SP3 Carboxy (базовый протокол SP3) и FASP, соответственно (рисунки 6B, C). В целом оба метода показали высокую количественную воспроизводимость среди пяти технических повторов для нагрузки 100 мкг белка.

Чтобы изучить систематическую ошибку, касающуюся физико-химических свойств пептидов, однозначно идентифицированных в различных методах получения, были исследованы молекулярно-массовые распределения белков и пептидов и индекс GRAVY.Более тщательное изучение первых двух упомянутых особенностей показало минимальную систематическую ошибку между обоими методами. Однако пептидный индекс GRAVY указывает на небольшой сдвиг в распределении пептида SP3 в сторону более гидрофильных значений, в основном видимый в случае пептидов, однозначно обнаруженных индивидуальным методом (фигура 7; дополнительные рисунки S5, S6).

Рисунок 7 . Распределение индекса GRAVY пептида, однозначно идентифицированного методом FASP (оранжевый) или SP3 Carboxy (синий).

Наконец, мы сравнили оба метода с точки зрения биологических свойств идентифицированных белков.GO-анализ не выявил предпочтения метода для какого-либо класса белков. Мы наблюдали более высокое относительное содержание групп белков апопласта и клеточной стенки для нагрузок 0,1 мкг в случае обоих методов (дополнительный рисунок S7). Иными словами, более низкое относительное содержание было обнаружено для белков эндоплазматического ретикулума, интегрального компонента мембранных белков, и белков внеклеточной области. Никаких различий для более высоких нагрузок не наблюдалось. Это несоответствие может быть связано с меньшим охватом выборок с низким входом.Содержание неаннотированных групп белков было менее 8,20%.

Обсуждение

Таким образом, мы продемонстрировали применимость метода SP3 для обработки SDS, содержащего лизаты листьев A. thaliana , без необходимости последующей очистки для широкого диапазона входных белков. Мы предложили два модифицированных протокола. Протокол Basic SP3 успешно применялся для диапазона 0,1–100 мкг входящего белка при постоянных условиях. Мы рекомендуем унифицированные количества гранул (600 мкг) и трипсина (2 мкг), демонстрируя применимость широкого диапазона соотношений гранулы: белок и трипсин: белок от 6000: 1 до 20: 1, соответственно, для 0.1 мкг на входе до 6: 1 и 1:50 на 100 мкг белка на входе. В случае малых количеств (≤10 мкг) высокие соотношения гранулы: белок и трипсин: белок оказались полезными, вероятно, способствуя взаимодействию белков и гранул, обеспечивая лучшие результаты, чем FASP. Применение нашего базового протокола SP3 позволило идентифицировать аналогичное количество пептидов и белков в лизате AT-SDT (для сопоставимых входных белков) по сравнению с более трудоемкими рабочими процессами, реализованными Song et al. (2018), которые включали экстракцию фенолом или экстракцию мочевины / осаждение ацетоном из листьев AT с последующим перевариванием FASP.

При переработке большого количества белка гранулы SP3 сильно агрегировались и становились липкими, что приводило к потенциальным потерям на внутренних пластиковых поверхностях. Следовательно, для применения миллиграммовых входов (до 10 мг) белка в протоколе Large-Scale SP3, мы рекомендуем поддерживать достаточный избыток гранул, поддерживая рабочее соотношение гранул SP3: белок 10: 1 (мас. / Мас.), а также с использованием увеличенного объема образца 0,5 мл. Sera-Mag SpeedBeads рекомендуется для большего количества протеина, поскольку они оседают на магните быстрее, чем классические Sera-Mag Beads; в противном случае SP3 на обоих типах бусинок одинаков.Для переваривания следует использовать отрегулированное количество трипсина в 2 мл 50 мМ AB, чтобы поддерживать соотношение фермента к белку 1: 100.

Дополнительный этап промывки 50 мМ AB (2 мл) после сбора расщепляющего раствора был осуществлен, потому что примерно одна десятая количества пептида осталась на гранулах. Первый дополнительный супернатант объединяли с исходным раствором гидролизата. После вращения при 20000 g, предотвращающего любой потенциальный перенос гранул, образцы пептидов в летучем буфере AB можно напрямую использовать для анализа MS или другой последующей обработки без какой-либо дополнительной очистки.

Заключение

Четыре различных метода подготовки образцов были сравнены для восходящего анализа протеома растений, и два из них в конечном итоге были отобраны и тщательно протестированы: SP3 на карбоксилированных магнитных шариках в качестве альтернативы хорошо зарекомендовавшему себя методу FASP. Оба рабочих процесса были протестированы в широком диапазоне концентраций белка 0,1–100 мкг, 5 и 10 мг. SP3 Carboxy обеспечил большее количество идентифицированных белковых групп и пептидов для низких входов белка (≤10 мкг).Для более высоких поступлений белка оба метода были сопоставимы по всем отслеживаемым характеристикам. Что касается SP3 Carboxy, мы описали два варианта протокола: во-первых, базовый протокол SP3, охватывающий диапазон входящего белка от 0,1 до 100 мкг без необходимости дальнейшей корректировки количества гранул, условий связывания и промывки и / или параметров переваривания, а во-вторых, умеренно модифицированный протокол Large-Scale Protocol, который предназначен для обработки миллиграммов белка. Кроме того, простой в использовании протокол SP3 Carboxy может быть выполнен за 2 часа (или за 90 минут, если этап алкилирования опущен), в то время как довольно трудоемкая процедура FASP занимает около 5 часов и более (рассчитано без учета времени переваривания). .Вместе со значительно более низкими затратами мы предполагаем, что предлагаемые нами протоколы SP3 представляют собой надежный инструмент для экономичной, быстрой и легко автоматизируемой однотрубной подготовки растительных образцов для восходящей протеомики на основе МС, позволяющей использовать SDS без каких-либо компромиссов. Мы предполагаем, что протоколы, разработанные для сложных образцов растений, будут достаточно надежными и для других типов образцов.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, представленные в этом исследовании, можно найти в онлайн-репозиториях.Имена репозитория / репозиториев и номера доступа можно найти по адресу: https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/, PXD022688.

Авторские взносы

HK и ZZ создали опытный образец. RH и HK выполнили пробоподготовку образцов AT. KM и DP выполнили анализ ЖХ-МС / МС и обработку данных. HK, KM, JH и ZZ интерпретировали результаты. Все авторы участвовали в написании рукописи и одобрили окончательную версию рукописи.

Финансирование

Работа поддержана Министерством образования, молодежи и спорта ЧР из Европейского фонда регионального развития — Проект «Центр экспериментальной биологии растений»: No.CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 16_019 / 0000738 и проект «CIISB4HEALTH» (№ CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 16_013 / 0001776). CIISB, Центр Instruct-CZ консорциума Instruct-ERIC EU, финансируемый инфраструктурным проектом MEYS CR LM2018127, выражает благодарность за финансовую поддержку измерений в Core Facility CEITEC Proteomics. Вычислительные ресурсы предоставлены проектом «e-Infrastruktura CZ» (e-INFRA LM2018140) в рамках программы «Проекты крупных инфраструктур исследований, разработок и инноваций».

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.635550/full#supplementary-material

Список литературы

Баллиау, Т., Блейн-Николя, М., и Зиви, М. (2018). Оценка оптимизированных методов пробирки-геля пробоподготовки для крупномасштабной протеомики растений. Протеомы 6: 6. DOI: 10.3390 / протеомы6010006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Басисты, Н., Мейер, Дж. Г., Вей, Л., Гибсон, Б. В., и Шиллинг, Б. (2018). Одновременное количественное определение ацетилома и сукцинилома методом аффинного обогащения «в одном сосуде». Протеомика 18: e1800123. DOI: 10.1002 / pmic.201800123

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Белов, К., Мастробуони, Г., Кемпа, С. (2016). Контроль качества протеомики: программное обеспечение для контроля качества результатов MaxQuant. J. Proteome Res. 15, 777–787. DOI: 10.1021 / acs.jproteome.5b00780

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кокс, Дж., И Манн, М. (2008). MaxQuant обеспечивает высокую скорость идентификации пептидов, индивидуальную точность измерения масс в диапазоне p.p.b. и количественное определение протеина в масштабе всего протеома. Нат. Biotechnol. 26, 1367–1372. DOI: 10,1038 / НБТ.1511

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кокс, Дж., Нойхаузер, Н., Михальски, А., Шелтема, Р. А., Олсен, Дж. В., и Манн, М. (2011). Andromeda: поисковая машина пептидов, интегрированная в среду MaxQuant. J. Proteome Res. 10, 1794–1805. DOI: 10.1021 / pr101065j

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дагли, Л. Ф., Инфузини, Г., Ларсен, Р. Х., Сандов, Дж. Дж., И Уэбб, А. И. (2019). Универсальный твердофазный протеиновый препарат (USP3) для восходящей и нисходящей протеомики. J. Proteome Res. 18, 2915–2924. DOI: 10.1021 / acs.jproteome.9b00217

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эрде, Дж., Лоо, Р. Р. О., Лоо, Дж. А. (2014). Улучшенный FASP (eFASP) для увеличения покрытия протеомом и восстановления образцов для количественных протеомных экспериментов. J. Proteome Res. 13, 1885–1895. DOI: 10.1021 / pr4010019

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эрде, Дж., Лоо, Р. Р. О., и Лоо, Дж.А. (2017). Улучшение протеомного покрытия и восстановления образцов с помощью расширенного FASP (eFASP) для количественных протеомных экспериментов. Methods Mol. Биол. 1550, 11–18. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-6747-6_2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фейст П., Хаммон А. Б. (2015). Протеомные проблемы: методы подготовки образцов для анализа содержания белка в микрограммах из биологических образцов. Внутр. J. Mol. Sci. 16, 3537–3563. DOI: 10.3390 / ijms16023537

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Глаттер, Т., Арне, Э., и Шмидт, А. (2015). Сравнение различных протоколов подготовки образцов выявляет ошибки экстракции, специфичные для лизисного буфера, у грамотрицательных бактерий и клеток человека. J. Proteome Res. 14, 4472–4485. DOI: 10.1021 / acs.jproteome.5b00654

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гонсалес-Лозано, М. А., Купманс, Ф., Палюхович, И., Смит, А. Б., и Ли, К. В. (2019). Быстрый и экономичный протокол подготовки образцов для анализа протеомики взаимодействия. Протеомика 19: 1

7. DOI: 10.1002 / pmic.201

7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

HaileMariam, M., Eguez, R.V, Singh, H., Bekele, S., Ameni, G., Pieper, R., et al. (2018). S-Trap, сверхбыстрый подход к пробоподготовке для протеомики дробовика. J. Proteome Res. 17, 2917–2924. DOI: 10.1021 / acs.jproteome.8b00505

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hartl, M., Füßl, M., Boersema, P.J., Jost, J., Kramer, K., Bakirbas, A., et al. (2017). Профилирование лизинового ацетилома открывает новые белки субстрата гистондеацетилазы у Arabidopsis. Мол. Syst. Биол. 13: 949. DOI: 10.15252 / msb.20177819

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хубер М. Л., Сакко Р., Парапатикс К., Скуча А., Хамина К., Мюллер А. С. и др. (2014). abFASP-MS: основанная на аффинности масс-спектрометрия подготовки проб с фильтром для количественного анализа химически меченых белковых комплексов. J. Proteome Res. 13, 1147–1155. DOI: 10.1021 / pr4009892

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хьюз, С., Фёр, С., Гарфилд, Д. А., Ферлонг, Э. Э., Стейнмец, Л. М., и Кригсвельд, Дж. (2014). Сверхчувствительный протеомный анализ с использованием технологии парамагнитных шариков. Мол. Syst. Биол. 10: 757. DOI: 10.15252 / msb.20145625

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hughes, C. S., Moggridge, S., Мюллер, Т., Соренсен, П. Х., Морин, Г. Б., и Кригсвельд, Дж. (2019). Подготовка проб в одной емкости для протеомных экспериментов с улучшенной твердофазной обработкой. Нат. Protoc. 14, 68–85. DOI: 10.1038 / s41596-018-0082-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хусейн, Р. А., и Эль-Анссари, А. А. (2018). «Вторичные метаболиты растений: ключевые факторы фармакологического действия лекарственных растений» в Фитотерапия . изд. Строитель П. Ф. (Лондон, Великобритания: Intechopen).

Google Scholar

Хоррин-Ново, Дж. В., Комацу, С., Санчес-Лукас, Р., и Родригес де Франсиско, Л. Э. (2019). Протеомика растений на основе гель-электрофореза: прошлое, настоящее и будущее. С 10-летием протеомного журнала! J. Proteome 198, 1–10. DOI: 10.1016 / j.jprot.2018.08.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Левандовска, Д., Чжан, Р., Колас, И., Узрек, Н., и Во, Р. (2019). Применение чувствительного и воспроизводимого протеомного подхода без меток для исследования протеома отдельных пыльников ячменя мейотической фазы. Фронт. Plant Sci. 10: 393. DOI: 10.3389 / fpls.2019.00393

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли С., Цао Х., Ван Ю., Чжу З., Чжан Х., Сюэ С. и др. (2017). Метод протеомного анализа микроводорослей, основанный на модифицированной пробоподготовке с использованием фильтров. Заявл. Biochem. Biotechnol. 183, 923–930. DOI: 10.1007 / s12010-017-2473-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Липецка, Ю., Чхуон, К., Bourderioux, M., Bessard, M. -A., Van Endert, P., Edelman, A., et al. (2016). Чувствительность масс-спектрометрического анализа зависит от формы фильтрующего устройства, используемого для подготовки проб с помощью фильтров (FASP). Протеомика 16, 1852–1857. DOI: 10.1002 / pmic.201600103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Ю., Лу С., Лю К., Ван С., Хуанг Л. и Го Л. (2019). Протеомика: мощный инструмент для изучения реакции растений на биотический стресс. Методы растений 15: 135. DOI: 10.1186 / s13007-019-0515-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Людвиг, К. Р., Шролл, М. М., Хаммон, А. Б. (2018). Сравнение методов расщепления на основе раствора, FASP и S-ловушки для восходящих протеомных исследований. J. Proteome Res. 17, 2480–2490. DOI: 10.1021 / acs.jproteome.8b00235

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lv, B., Yang, Q., Li, D., Liang, W., и Сонг, Л. (2016). Полнопротеомный анализ ацетилирования лизина у растительного патогена Botrytis cinerea. Sci. Отчет 6: 29313. DOI: 10.1038 / srep29313

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мо, Р., Янг, М., Чен, З., Ченг, З., Йи, Х., Ли, К. и др. (2015). Ацетиломный анализ показывает участие ацетилирования лизина в фотосинтезе и углеродном метаболизме у модельной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. J.Proteome Res. 14, 1275–1286. DOI: 10.1021 / pr501275a

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моггридж С., Соренсен П. Х., Морин Г. Б. и Хьюз К. С. (2018). Расширение совместимости подхода обработки парамагнитных гранул SP3 для протеомики. J. Proteome Res. 17, 1730–1740. DOI: 10.1021 / acs.jproteome.7b00913

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мюллер, Т., Кальксдорф, М., Лонгуспе, Р., Каздал, Д. Н., Стензингер, А., Крайгсвельд, Дж. (2020). Автоматическая пробоподготовка с SP3 для клинической протеомики с низкими затратами. Мол. Syst. Биол. 16: e9111. DOI: 10.15252 / msb.20199111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нел, А. Дж. М., Гарнет, С., Блэкберн, Дж. М., и Соарес, Н. К. (2015). Сравнительная переоценка методов FASP и расширенных FASP с помощью ЖХ-МС / МС. J. Proteome Res. 14, 1637–1642. DOI: 10.1021 / pr501266c

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ни, М.-W., Wang, L., Chen, W., Mou, H. -Z., Zhou, J., and Zheng, Z. -G. (2017). Модифицированный метод подготовки образцов с использованием фильтров (FASP) увеличивает идентификацию пептидов и белков для протеомики дробовика. Rapid Commun. Масс-спектрометрия. 31, 171–178. DOI: 10.1002 / RCM.7779

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Perez-Riverol, Y., Csordas, A., Bai, J., Bernal-Llinares, M., Hewapathirana, S., Kundu, D.J., et al. (2019). База данных PRIDE и связанные с ней инструменты и ресурсы в 2019 году: улучшение поддержки количественных данных. Nucleic Acids Res. 47, D442 – D450. DOI: 10.1093 / nar / gky1106

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Потрике, Дж., Лаохавирой, М., Бетони, Дж. М., и Малвенна, Дж. (2017). Модифицированный протокол FASP для высокопроизводительной подготовки образцов белка для масс-спектрометрии. PLoS One 12: e0175967. DOI: 10.1371 / journal.pone.0175967

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Scheerlinck, E., Dhaenens, M., Ван Соом, А., Пилман, Л., Де Саттер, П., Ван Стиендам, К. и др. (2015). Сведение к минимуму технических вариаций во время подготовки образцов перед количественной масс-спектрометрией без маркировки. Анал. Biochem. 490, 14–19. DOI: 10.1016 / j.ab.2015.08.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зилафф, М., Кухарев, Дж., Бон, Т., Халброк, Дж., Бопп, Т., Тензер, С., и др. (2017). Оценка протоколов FASP, SP3 и iST для подготовки протеомных образцов в диапазоне низких микрограммов. J. Proteome Res. 16, 4060–4072. DOI: 10.1021 / acs.jproteome.7b00433

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сонг, Г., Сюй, П. Ю., Уолли, Дж. У. (2018). Оценка и усовершенствование методов пробоподготовки для глубокого и количественного профилирования протеома растений. Протеомика 18: e1800220. DOI: 10.1002 / pmic.201800220

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Стойчев С., Найкер П., Мампута С., Бутхелези, С., Гербер, И., Вестхуйзен, С., и др. (2018). Магнитный HILIC: эффективный и универсальный инструмент для надежных автоматизированных рабочих процессов подготовки проб для МС. Доступно по адресу: https://resynbio.com/hilic/ (по состоянию на 25 февраля 2021 г.).

Google Scholar

Стойчев С., Найкер П., Мампута С., Хумало Ф., Гербер И., Вестхуйзен К. и др. (2017). Универсальная несмещенная очистка до МС с использованием магнитных микрочастиц HILIC для SPE. Доступно по адресу: https://resynbio.com/hilic/ (по состоянию на 25 февраля 2021 г.).

Google Scholar

Тубаон Р. М., Хаддад П. Р. и Квирино Дж. П. (2017). Примеры стратегий очистки для приложений масс-спектрометрии ESI в восходящей протеомике: тенденции с 2012 по 2016 год. Proteomics 17: 1700011. DOI: 10.1002 / pmic.201700011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тянова, С., Кокс, Дж. (2018). Perseus: биоинформатическая платформа для интегративного анализа данных протеомики в исследованиях рака. Methods Mol.Биол. 1711, 133–148. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-7493-1_7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, W. -Q., Jensen, O.N., Møller, I.M., Hebelstrup, K.H., and Rogowska-Wrzesinska, A. (2018). Оценка методов пробоподготовки для протеомного анализа листьев ячменя на основе масс-спектрометрии. Растительные методы 14:72. DOI: 10.1186 / s13007-018-0341-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wiśniewski, J.Р. (2017). «Подготовка проб с помощью фильтрации: универсальный и эффективный метод протеомного анализа» в Методы в энзимологии: Протеомика в биологии, Часть A. Vol. 585. изд. А. К. Шукла (Кембридж, Массачусетс, США: Academic Press, Elsevier).

Google Scholar

Вишневский, Дж. Р., Манн, М. (2012). Последовательное протеолитическое расщепление в ферментном реакторе увеличивает глубину протеомного и фосфопротеомного анализа. Анал. Chem. 84, 2631–2637.DOI: 10.1021 / ac300006b

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вишневский, Дж. Р., Остасевич, П., и Манн, М. (2011). FASP с высокой степенью извлечения, применяемый для протеомного анализа микродиссектированных фиксированных формалином и залитых парафином раковых тканей, извлекает известные маркеры рака толстой кишки. J. Proteome Res. 10, 3040–3049. DOI: 10.1021 / pr200019m

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йунг Й.-Дж. И Стэнли Э.Р. (2010). Быстрое удаление детергента из образцов пептидов с помощью этилацетата для масс-спектрометрического анализа. Curr. Protoc. Protein Sci. 59, 16.12.1–16.12.5. DOI: 10.1002 / 0471140864.ps1612s59

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан З., Дубяк К. М., Хубер П. В. и Довичи Н. Дж. (2020). Миниатюрный метод подготовки образцов с использованием фильтра (MICRO-FASP) для высокопроизводительной и сверхчувствительной протеомной подготовки образцов выявляет протеомную асимметрию у эмбрионов Xenopus laevis . Анал. Chem. 92, 5554–5560. DOI: 10.1021 / acs.analchem.0c00470

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зугман А., Селби П. Дж. И Бэнкс Р. Э. (2014). Метод подготовки образца с захватом суспензии (STrap) для восходящего протеомного анализа. Протеомика 14, 1006–1000. DOI: 10.1002 / pmic.201300553

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sp3, Sp2 и Sp-гибридизация, геометрия и углы связи

Sp³, sp² и sp-гибридизация, или смешение s- и p-орбиталей, которое позволяет нам создавать сигма- и пи-связи, — это тема, которую мы обычно понимаем только для того, чтобы запутаться, когда он снова появляется в молекулах и реакциях органической химии.

Когда я изучал общую химию, я просто запоминал схему геометрии и валентных углов, и я вроде как понимал, что происходит. Но только когда я начал думать об этом по-другому, как я объясню ниже, я окончательно и по-настоящему понял.

В этой статье мы рассмотрим следующее:

  • ЗАЧЕМ нам нужна гибридизация
  • КАК происходит гибридизация
  • Теория VSEPR
  • Sp³ Гибридизация, угол соединения и геометрия (включая видео)
  • Molecular vs.Электронная геометрия
  • Sp² Гибридизация, угол соединения и геометрия (включая видео)
  • Sp Гибридизация, угол соединения и геометрия
  • Ярлык гибридизации
  • Гибридизация Sp³d и sp³d² — Обзор

Итак, давайте углубимся.

Помимо бакалавриата по органической химии, эта тема важна для таких экзаменов, как MCAT, GAMSAT, DAT и другие.

Зачем нужна гибридизация?

Молекулы везде! Как они образуются?
Проще говоря, молекулы состоят из связанных атомов,
Атомы связаны различными типами связей,
причем ковалентные связи являются самыми прочными и распространенными.

Чтобы создать ковалентную связь (видео), каждый участвующий атом должен иметь орбитальное «отверстие» (представьте: пустое пространство) для приема и взаимодействия с электронами другого атома.

Давайте сделаем небольшой обходной путь и рассмотрим электронную конфигурацию с акцентом на валентные электроны, поскольку именно они участвуют в связи.

Чувствуешь себя ржавым? Нажмите, чтобы просмотреть мои Электронная конфигурация + видео с ярлыками .

Возьмем водород.
Он имеет единственный электрон на орбитали 1s. Для заполнения требуется еще один электрон.
Это оставляет отверстие для образования одной одинарной связи.
Отлично подходит для добавления еще одного водорода, но не подходит для создания большой сложной молекулы.

Теперь рассмотрим углерод.
Неслучайно углерод является центральным атомом всех макромолекул нашего тела.
Белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты — все они имеют углерод в центре.
Почему? Потому что углерод способен образовывать 4 связи.

То есть много по химическим меркам!
И если любой из этих других атомов также является углеродом, у нас есть потенциал для создания гигантской молекулярной структуры, такой как АТФ, изображенный ниже, источник энергии и генетический строительный материал внутри клеток.

Как это работает?
Обзор электронной конфигурации углерода показывает нам, что углерод имеет в общей сложности 6 электронов, и только 4 электрона находятся в его валентной оболочке.

Но подождите!
Несмотря на наличие 4 валентных электронов,
Нет 4 пустых мест, ожидающих заполнения… ЕЩЕ !

2s-электроны в углероде уже спарены и, таким образом, не желают принимать новые входящие электроны ковалентной связью.

Это оставляет нам:

  • 2 p-орбитали, каждая с одним неспаренным электроном, способным образовывать ОДНУ связь
  • Пустая p-орбиталь без электрона для инициирования связи

При нынешней конфигурации углерод может образовывать только 2 связи,
Используя свои ДВА неспаренных электрона,
Что не очень помогает, если мы пытаемся построить сложные макромолекулы.

Введите

Гибридизация .

Если мы сможем найти способ переместить ОДИН из парных s-электронов на пустую p-орбиталь, мы получим что-то вроде этого.

Но этого не может произойти, потому что принцип Ауфбау гласит, что электроны должны заполнять атомные орбитали от самой низкой до самой высокой энергии. Это тоже описано в моих видеороликах Electron Configuration .

Итак, что нам делать, если мы не можем следовать принципу Ауфбау?
Начните гибридизацию!

Как происходит гибридизация?

Вот как мне нравится думать о гибридизации.

Мы берем эту орбиталь, содержащую 2 электрона, и даем ей частичный прирост энергии.
В то же время мы отбираем немного p-орбитальной энергии.
Это дает нам 4 вырожденных орбитали, то есть орбитали с одинаковым количеством энергии.

Когда я рос, мы с сестрой делили спальню. Нам это не понравилось, но это имело смысл, учитывая, что мы оба девочки и близки по возрасту.
Когда мы переехали в квартиру с дополнительной спальней, у каждого из нас было свое место. Почему мы решили делиться, если у нас была возможность иметь собственные комнаты?

Электроны такие же.Теперь, когда у нас есть в общей сложности 4 вырожденных орбитали и 4 электрона, зачем нам заставлять их делить «комнату», если им не нужно?
Вместо этого каждый электрон перейдет на свою орбиталь.

Количество движущихся электронов и объединенных орбиталей зависит от типа гибридизации, которую мы хотим создать.
Итак, давайте разберемся.

Сегодня я сосредоточусь на гибридизации sp³, sp² и sp, но я понимаю, что вы можете пойти еще дальше, чтобы создать орбитали, такие как sp³d и sp³d² (краткое упоминание в конце).

Sp³ Гибридизация

Посмотрите видео ниже, чтобы получить краткий обзор гибридизации sp³ с примерами.

Вернемся к нашему примеру с углеродом.

Самая прямая гибридизация достигается путем смешивания единственной 2s-орбитали, содержащей 2 электрона, со всеми тремя p-орбиталями, также содержащими всего 2 электрона.

Теперь, когда у нас есть 4 вырожденных неспаренных электрона, каждый из них способен принять новый электрон от другого атома, чтобы создать в общей сложности 4 связи.

Но как мы называем эти новые «смешанные вместе» орбитали?
Их больше нет, и они больше не p.
Напротив, они где-то посередине.

Будучи вырожденными, каждая орбиталь имеет небольшой процент s и больший процент p.
Математический способ описать это перемешивание — умножение.
Смешивая 1s и 3p, мы по существу умножили s x p x p x p.

Вспомните свой базовый урок математики.
Если у нас есть p раз (3 раза), это будет p x p x p
или p³.

Итак, КАЖДАЯ орбиталь является s x p³ или sp³ гибридной орбиталью,
Потому что они были получены из 1 s и 3 p орбиталей.

Ch5 sp³ Гибридная геометрия

Возьмем простую молекулу метана, Ch5.
Каждая sp³-орбиталь в углероде принимает электрон от другого атома водорода, образуя в общей сложности 4 связи.

Но этот плоский рисунок работает только как простая структура Льюиса (видео) . Как только вы поймете гибридизацию, вы сможете предсказать точную форму (молекулярная или электронная геометрия, которая будет обсуждаться в ближайшее время), а также угол связи для каждого присоединенного атома.

Итак, давайте копнем глубже.
Электроны отрицательны, и, как вы помните,
Противоположности притягиваются (+ и -) и подобные заряды отталкиваются.
И эти отрицательные электроны на орбиталях…

Ну, давайте просто скажем, что они не любят друг друга.

Они настолько отталкивают друг друга, что существует целая теория, описывающая их поведение.

Теория VSEPR

VSEPR — это отталкивание пар электронов валентной оболочки.
Хотя электроны в целом не любят друг друга, им все же нравится иметь «партнера».
Итак, они существуют парами.

Это может быть неподеленная электронная пара, сидящая на атоме, или связующая электронная пара.
Например, см. Воду ниже. Кислород имеет 2 неподеленные пары и 2 электронные пары, которые образуют связи между собой и водородом.

Единственным исключением из этого правила является неподеленный радикальный электрон, поэтому радикалы обладают такой высокой реакционной способностью.

Теория VSEPR, часто произносимая как «теория VES за », говорит нам, что электронная пара отталкивает другие электронные пары как можно дальше от себя.
Если КАЖДАЯ электронная пара отталкивает другие как можно дальше, они найдут максимально возможный угол связи, который КАЖДЫЙ может принять.

Угол и геометрия соединения Sp³

Хотя я в конечном итоге хочу, чтобы вы могли рисовать и распознавать трехмерные молекулы без посторонней помощи, я настоятельно рекомендую вам сначала поработать с модельным набором. Возможность видеть, трогать и манипулировать фигурами в реальном пространстве поможет вам лучше понять эти углы.

Посмотрите это видео, чтобы узнать все о Когда и как использовать модельный набор в органической химии .

Когда к центральному атому, такому как углерод, присоединены 4 эквивалентные группы (подумайте: водород в нашем примере с метаном), теория VSEPR диктует, что они могут разделяться максимум на 109,5 градусов. Это угол связи sp³.

Название этой трехмерной формы — тетраэдр (существительное), которое говорит нам, что молекула, подобная метану (Ch5), или, скорее, центральный углерод в метане, имеет тетраэдрическую форму.
Вы можете использовать термины «тетраэдр» существительное или «тетраэдр» как синонимы.

Утверждается, что углерод в метане имеет тетраэдрическую молекулярную геометрию И тетраэдрическую электронную геометрию.

Сказать что?

Молекулярная и электронная геометрия

Глядя на форму молекулы, мы можем посмотреть на форму, принятую атомами , или форму, принятую электронами .

Каждая электронная пара в метане связана с другим атомом.
Но что, если у нас есть молекула, которая имеет меньше связей из-за наличия неподеленных электронных пар?

Молекулярная геометрия сообщает нам форму самой молекулы, обращая внимание только на атомы, таким образом игнорируя неподеленные пары.

Электронная геометрия сообщает нам форму электронов вокруг центрального атома, независимо от того, существуют ли электроны в виде связи или неподеленной пары.

Рассмотрим подробнее.

Nh4 Гибридизация и геометрия

Аммиак, или Nh4, имеет центральный атом азота.

Беглый обзор его электронной конфигурации показывает нам, что азот имеет 5 валентных электронов.
N = [He] 2s² 2p³

Следующий шаг несколько нелогичен, поскольку N, по-видимому, способен образовывать 3 связи со своими 3 p-орбитальными электронами. Однако неподеленные электронные пары ДОЛЖНЫ БЫТЬ той же энергии, что и сигма-связи, и поэтому он ВСЕГДА должен гибридизировать свои s- и p-орбитали.

Они будут гибридизированы в четыре sp³-орбитали, первая из которых содержит 2 (спаренных) электрона.

Остальные орбитали с неспаренными электронами свободны, каждая из них связана с атомом водорода.

Хотя мы ожидаем, что аммиак будет иметь тетраэдрическую геометрию из-за его sp³-гибридизации, вот модельный набор для визуализации аммиака. Вам он кажется четырехгранным?

Не совсем так!

И все же, согласно его электронной геометрии, он все еще является тетраэдром.
Рассматривая электронную геометрию, просто представьте неподеленную пару как электрон, связанный со своим электроном-партнером.

Однако его молекулярная геометрия, которую вы на самом деле видите с набором, показывает только N и 3 H в заостренной трехногой форме, называемой Trigonal Pyramidal .

Trigonal , потому что он имеет 3 связанные группы.
Пирамидальная , потому что образует пирамидальную структуру.

Trigonal Pyramidal имеет форму трехногой пирамиды.

Гибридизация h3O и геометрия

Эта концепция молекулярной и электронной геометрии меняется еще больше, когда рассматриваемая молекула, все еще будучи sp³, имеет 2 неподеленные пары и, следовательно, только 2 связи.

Молекула воды имеет центральный атом кислорода с 6 валентными электронами.

O = [He] 2s² 2p4
6 валентных электронов кислорода находятся на гибридизированных sp³-орбиталях, давая нам 2 парных электрона и 2 свободных электрона.

Поскольку кислород воды является sp³-гибридизированным, электронная геометрия по-прежнему напоминает углерод (например, метан).

Но модельный комплект показывает только 2 присоединенных атома H, что дает воде Bent Molecular Geometry.

Sp² Гибридизация

Что делать, если я НЕ , ищу 4 вырожденных орбитали?
Что, если я смогу обойтись только двумя или тремя гибридными орбиталями, окружающими центральный атом?

Видео ниже содержит краткий обзор sp² и sp-гибридизации с примерами.

Каждая облигация, которую мы видели до сих пор, была сигма-облигацией или одинарной облигацией. Но вы можете вспомнить, что пи-связи имеют более высокую энергию И что они используют p-орбиталь, а не гибридную орбиталь.

Пустые орбитали (например, карбокатион) встречаются реже, но с негибридизированными p-орбиталями.

Для того, чтобы создать эту пи-связь или карбокатион, нам нужно сохранить p-орбиталь до гибридизации остальных. Взгляните на рисунок ниже.

На приведенном выше рисунке я сохранил одну из p-орбиталей, у которой был одиночный электрон для использования в пи-связи.

Затем я смешал оставшиеся s-орбитали (два электрона) и 2 p-орбитали (только один электрон), чтобы получить 3 совершенно новые орбитали, содержащие всего 3 электрона.

Поскольку эти орбитали были созданы с помощью s, p и p, математический результат будет s x p x p,
или s x p², который мы можем просто назвать sp² .

Напоминание. Двойная связь состоит из ДВУХ связей — одинарной или сигма-связи, соединенных со второй «двойной» связью или пи-связью. Сигма-связь не отличается от связей, которые мы видели выше для CH 4 , NH 3 или даже H 2 O.Мы просто добавляем пи-связь поверх сигмы, чтобы создать двойную связь (и вторую пи-связь, чтобы создать тройную связь).

Пи-связь находится частично выше и частично ниже плоскости молекулы как перекрытие негибридизованных р-орбиталей.

Угол и геометрия соединения Sp²

Давайте взглянем на центральный углерод в пропаноне или ацетоне, обычном полярном апротонном растворителе для последующих реакций замещения.

Как вы можете видеть, центральный углерод имеет двойную связь с кислородом и одинарную связь с двумя атомами углерода метильной группы.Это дает углероду всего 4 связи: 3 сигма и 1 пи .
Скорее всего, вы увидите это нарисованное как скелетную структуру для почти трехмерного представления, а именно:

Согласно теории VSEPR, мы хотим, чтобы каждая из 3 групп находилась как можно дальше от других. Если вы подумаете о центральном углероде как о центре круга на 360 °, вы получите 360/3 = 120 °

.

Техническое название этой формы — тригонально-планарная.

Trigonal сообщает нам, что есть 3 группы.
Planar говорит нам, что он плоский.

Гибридная геометрия sp² представляет собой плоский треугольник.

Поскольку углерод в ацетоне не имеет неподеленных пар, как его молекулярная геометрия (то, что вы видите на основе атомов), так и его электронная геометрия (конфигурация электронов) являются тригонально плоскими.

Что, если у нас ДЕЙСТВИТЕЛЬНО есть одиночные пары?
Как и sp³, эти неподеленные пары также находятся на гибридных орбиталях, что делает кислород в ацетоне также гибридным sp².

Гибридизация озона или O3 и геометрия

Озон — интересная молекула, для которой можно нарисовать несколько структур Льюиса из-за резонанса. Давайте посмотрим на его основные составляющие структуры.

Игнорируя (+) и (-) формальные заряды, центральный атом кислорода имеет одну двойную связь (сигма и пи), одну одинарную связь (только сигма) и одну неподеленную пару. 2 сигма-связи и 1 неподеленная пара существуют в 3-х вырожденных sp2-гибридных орбиталях.

Хотя тригональная плоская электронная геометрия похожа на ацетон, когда мы смотрим ТОЛЬКО на атомы, мы получаем форму Bent для молекулярной геометрии.

Гибридизация Bh4 или BF3 и геометрия

Гибридизация

Sp² не всегда должна включать пи-связь.
Возьмите такую ​​молекулу, как Bh4 или BF3, и вы заметите, что центральный атом бора имеет в общей сложности 3 связи для 6 электронов. Это допустимое исключение из правила октетов.

3 связи требуют всего ТРИ вырожденных орбиталей. Смешивая s + p + p, у нас остается одна пустая p-орбиталь.

В случае ацетона эта p-орбиталь использовалась для образования пи-связи.В случае бора пустая p-орбиталь просто сидит там пуста, ничего не делая, потенциально ожидая атаки, как вы позже увидите в Гидроборации реакции алкенов.
То есть … кто не хочет разбиться на пустой орбите?


Угол и геометрия связи гибридизации Sp

Просмотрите видео выше (начало раздела sp²) для обзора гибридизации sp² AND sp.

Атом может иметь до 2 пи-связей, иногда с одним и тем же атомом, например, углерод с тройной связью в HCN (ниже) или 2 двойные связи с разными атомами, например с центральным углеродом в CO2 (ниже).

В обоих примерах каждая пи-связь образована одним электроном на негибридизированной «сохраненной» p-орбитали следующим образом.

Чтобы получить sp-гибрид, мы просто смешиваем полную s-орбиталь с одной пустой p-орбиталью. 2 электрон-содержащих p-орбитали сохраняются для образования пи-связей.

Так как этот гибрид получается из s + p, математическое обозначение s x p или просто sp .

Согласно теории VSEPR, поскольку полученная молекула имеет только 2 связанные группы, группы будут отходить как можно дальше друг от друга, то есть к противоположным концам молекулы.

Это дает нам форму Linear как для sp Electronic, так и для молекулярной геометрии, с углом связи 180 °.

Гибридизация HCN и геометрия

Мы не обсуждали это до сих пор, но всякий раз, когда у вас есть связанный атом водорода, его связь должна существовать на s-орбитали, потому что у водорода нет p-орбиталей для использования или гибридизации.

Остальные атомы C и N в HCN оба связаны друг с другом тройной связью.
Обратите внимание, что, хотя углерод также имеет одинарную связь с водородом, у азота нет другой связи, только одинокая пара.

Оба эти атома sp-гибридизованы.
Углерод имеет одну сигма-связь с H и N.
N имеет одну сигма-связь с C, а другая sp-гибридная орбиталь существует для неподеленной электронной пары.

И C, и N имеют по 2 p-орбитали каждая, зарезервированные для тройной связи (2 пи-связи наверху сигмы). Это делает HCN Линейной молекулой с углом связи 180 ° вокруг центрального атома углерода.

Гибридизация CO2

Углекислый газ, или CO2, представляет собой интересную, а иногда и сложную молекулу, потому что она гибридизована IS sp, но не из-за тройной связи.

Взгляните на центральный атом.
Углерод связан двойной связью с 2 разными атомами кислорода.
Каждое взаимодействие C-O состоит из одной сигма-связи и одной пи-связи.
Сигма-связь требует гибридной орбитали, в то время как пи-связь требует только p-орбитали.

Это означает, что углерод в СО2 требует 2 гибридных sp-орбиталей, по одной на каждую сигму кислорода, и 2 нетронутых p-орбиталей, чтобы образовать одинарную пи-связь с обоими атомами кислорода.
Вот почему углерод является sp-гибридным, несмотря на отсутствие ожидаемой тройной связи, которую мы видели выше в примере с HCN.

Интересно, что если вы посмотрите на оба атома кислорода, вы заметите, что каждый из них содержит:
1 сигма-связь
1 пи-связь
2 неподеленные пары

Сигма-связи и неподеленные пары существуют в гибридных орбиталях. Поскольку нам нужно 3 гибридных орбитали, оба атома кислорода в CO2 гибридизуются sp².

Ярлык гибридизации — рассчитывайте свой путь

Возвращаясь к общей химии, я помню, как изучал двухстраничную таблицу, пытаясь запомнить, как идентифицировать каждый тип гибридизации. (Мы должны были знать sp, sp², sp³, sp³d и sp³d².)
У вас нет времени на все это в органической химии.

Вот как определить гибридизацию путем быстрого подсчета групп :

1- Подсчитайте ГРУППЫ вокруг каждого рассматриваемого атома.

Каждая следующая группа считается ОДНОЙ группой:

  • Одинокая электронная пара
  • Односвязанный атом
  • Атом с двойной связью
  • Атом с тройной связью

Другими словами, группы включают связанные атомы (одиночные, двойные или тройные) и неподеленные пары.

2- Начните читать орбитали по порядку, пока не достигнете того же числа.

Используя примеры, которые мы уже видели в этом руководстве:

Ch5 имеет 4 группы (4 H). Счетчик 1, 2, 3, 4.
1: s
2: p¹
3: p²
4: p³

Просто посчитав свой путь вверх, вы наткнетесь на правильную гибридизацию — sp³.

Nh4 имеет 4 группы — 3 связанных атома H и 1 неподеленную пару.
1, 2, 3, 4 = s, p¹, p², p³ = sp³

Кислород в ацетоне имеет 3 группы — 1 углерод с двойной связью и 2 неподеленные пары.
1, 2, 3 = s, p¹, p² = sp²

Центральный углерод в СО2 имеет 2 атома кислорода с двойной связью и ничего больше.
1, 2 = s, p¹ = sp

Щелкните правой кнопкой мыши приведенную ниже таблицу ярлыков гибридизации, чтобы загрузить / сохранить.

Sp³d и sp³d² Гибридизация

Хотя гибридизация sp³d и sp³d² обычно не рассматривается в органической химии и в целом обсуждается реже, вы все равно видите их на своем MCAT, GAMSAT, PCAT, DAT или аналогичном экзамене.

Выполните тот же трюк, описанный выше, чтобы увидеть, что sp³d-гибридизация происходит в результате смешения 5 орбиталей (1s, 3p и 1d) с получением 5 «групп», как показано в примере с пентахлоридом фосфора (PCl5) ниже.

Гибридизация

Sp³d² происходит в результате смешения 6 орбиталей (1s, 3p и 2d) с образованием 6 «групп», как показано в примере гексафторида серы (SF6) ниже.

Заключение

Гибридные орбитали создаются путем смешивания s- и p-орбиталей, чтобы помочь нам создать вырожденные (равные энергии) связи.sp³, сделанный из s + 3p, дает нам 4 гибридных орбитали для тетраэдрической геометрии и валентных углов 109,5 градусов. Sp², созданный из s + 2p, дает нам 3 гибридные орбитали для тригональной плоской геометрии и валентных углов 120 градусов. sp, состоящий из 1 каждого s и p, дает нам линейную геометрию со связующим углом 180 градусов.

Готовы применить то, что знаете? Посмотрите практическое видео ниже:

CIO-SP3 SB — Foxhole Technology, Inc.

Директор по информационным технологиям — решения и партнеры 3 (CIO-SP3) Государственный контракт на закупку (GWAC) для малого бизнеса — это 10-летний неопределенный срок поставки / неопределенное количество (IDIQ). ) контракт, который обеспечивает упрощенное получение и быстрое предоставление.Благодаря потолку в 20 миллиардов долларов, гибким типам контрактов и возможности заключать контракты с модульными приращениями и включать функции, основанные на производительности, CIO-SP3 для малого бизнеса (SB) и для предприятий, принадлежащих ветеранам с ограниченными возможностями обслуживания (SDVOSB), предлагает оптимизированные заказы и обработку, а также сберегательные агентства. и время, и деньги.

Этот контракт предоставляет решения и услуги в области информационных технологий (ИТ), как это определено в FAR 2.101 (b) и дополнительно разъясняется в Законе Клингера-Коэна 1996 г., которые включают, помимо прочего, ИТ-услуги, связанные со здравоохранением и биомедицинскими технологиями, для удовлетворения научные, медицинские, административные, операционные, управленческие и информационные требования.Контракт также содержит общие ИТ-услуги, поскольку медицинские системы должны быть интегрированы в более широкие ИТ-архитектуры, которые требуют системного подхода к реализации и надежной инфраструктуры для работы.

областей задач
  • Область задач 1: ИТ-услуги для биомедицинских исследований, медицинских наук и здравоохранения

  • Область задач 2: Поддержка главного информационного директора (CIO)

  • Область задач 4: аутсорсинг

  • Область задач 5: ИТ-операции и обслуживание

  • Область задач 6: Службы интеграции

  • Область задач 7: Защита критически важной инфраструктуры и обеспечение информации

  • Область задач 10: Разработка программного обеспечения

Важно Ссылки и информация:
CIO-SP3 теперь имеет два отдельных трека — SDVOSB и Small Business.Информация о контрактах и ​​ценах для каждой дорожки следующая:

1. CIO-SP3 Small Business — SDVOSB Track
• CIO-SP3 Small Business — SDVOSB Government Site Rates
• CIO-SP3 Small Business — SDVOSB Contractor Тарифы на сайте
• Выданная стандартная форма
• Согласованный контракт
• Срок исполнения: 02.04.2018 — 29.04.2022
• Код контракта NAICS: 541512
• Максимальный потолок контракта: 20 млрд долларов США
• Условия своевременной оплаты: нетто 30 Условия своевременной оплаты соответствуют FAR 52.232-25, как предусмотрено в генеральном контракте.

2. CIO-SP3 Small Business — Small Business Track
• CIO-SP3 Small Business — Small Business Track Государственные тарифы на сайт
• CIO-SP3 Small Business — Сайты для подрядчиков малого бизнеса
• Присваивается стандарт Форма
• Согласованный договор
• Срок исполнения: 11.05.2020 — 14.07.2022
• Код договора NAICS: 541512
• Максимальный предел договора: 20 млрд долларов
• Условия своевременной оплаты: нетто 30.Условия своевременной оплаты соответствуют FAR 52.232-25, как это предусмотрено в генеральном контракте.

контактная информация для cio-sp3

Стюарт Керр, менеджер программы
Телефон: 301-540-1040
[email protected]

CIO-SP3 SB снижает сборы, увеличивая конкуренцию GWAC

В предыдущих статьях EZGovOpps освещала историю и преимущества государственных закупочных контрактов (GWAC), включая NASA SEWP — решения для закупок в масштабе предприятия — и главного информационного директора — Solutions and Partners 3 Small Business (CIO-SP3 SB).Недавно Центр приобретения и оценки информационных технологий NIH (NITAAC) объявил о новой, более низкой плате за доступ к контрактам для агентств, использующих GWAC, а также о предельном размере комиссии в размере 70 000 долларов США для любого заказа на сумму более 20 миллионов долларов США через механизм CIO-CS.

NITAAC — исполнительный агент, учрежденный через NIH с целью федеральных закупок ИТ. (С любезного разрешения NIH)

CIO-SP3 SB — Успешная машина для малого бизнеса

CIO-SP3 SB, средство для малого бизнеса и одно из трех средств в программе CIO-SP3, было создано «для предоставления индивидуальных решений и услуг в области информационных технологий (ИТ) для малых предприятий в 5 социально-экономических категориях.«Этот автомобиль уже имел большой успех с момента его первоначального награждения в 2012 году, когда многие малые предприятия переросли свой статус SB в ходе предоставления услуг CIO-SP3. Стремясь еще больше расширить использование SB GWAC, NITAAC снизила плату за доступ к контракту с 0,75% до 0,55%. Это, в сочетании с возможностью в 2016 г. для большего числа малых предприятий присоединиться к CIO-SP3, рассматривается NITAAC как попытка конкурировать с другими GWAC, такими как SEWP, а также с IT Schedule 70 GSA, за который не взимается плата. снижение кепки более чем за десять лет.

CIO-SP3 продолжает набирать обороты в качестве конкурирующего GWAC, а в 2016 году Департамент по делам ветеранов объявил о решении использовать CIO-SP3 для VA «Корпоративные облачные сервисы для модернизации ИТ-инфраструктуры», отчасти потому, что NITAAC включал ИТ в сфере здравоохранения как отдельная сфера услуг в GWAC. Прочие зоны обслуживания:

  1. Директор по информационным технологиям (CIO) Поддержка
  2. Изображения
  3. Аутсорсинг
  4. Эксплуатация и обслуживание ИТ
  5. Службы интеграции
  6. Защита критически важной инфраструктуры и обеспечение информации
  7. Цифровое правительство
  8. Планирование ресурсов предприятия
  9. И разработка программного обеспечения

По мере того, как ИТ в сфере здравоохранения продолжает развиваться как отрасль, и все больше агентств начинают искать облачные услуги, CIO-SP3 предоставит большие возможности для малых предприятий, желающих воспользоваться этими растущими федеральными тенденциями в области ИТ.Хотя портал NITAAC e-GOS недоступен для общественности, компании, которые упустили последнюю возможность CIO-SP3 SB on-ramp, могут по-прежнему использовать EZGovOpps для поиска отчетов по заказам задач, основных держателей контрактов и эксклюзивных обновлений программы, что позволяет объединяться возможности и лучшая информация для будущих открытий на рампе.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *