Санпин для детей сирот: Библиотека государственных стандартов

( a ) COUP-TFII Уровни мРНК в сердечных тканях человека безотказного (NF, n = 6) и идиопатического DCM ( n = 13) из GSE1869. ( b ) Стратегия индуцируемой экспрессии COUP-TFII в миокарде взрослой мыши. ( c ) Общий вид сердца 16-го дня. Масштаб линейки под всеми изображениями монтировок — 1 мм. ( d , e ) Временная эхокардиограмма. День 0 указывает день перед индукцией экспрессии COUP-TFII.LVIDd, внутренний размер левого желудочка в диастолу. N = 5 (CTRL) и 7 (OE). ( f ) Выживаемость девяти мышей CTRL и восьми мышей OE с течением времени. ( г, ) Проявление сигнатуры гена COUP-TFII в образцах сердца человека (GSE1869). COUP-TFII Сигнатура гена курируется из всех нижестоящих мишеней COUP-TFII в сердцах мышей, которые идентифицированы с помощью анализа микрочипов. ( h ) Основные биологические процессы, измененные сверхэкспрессией COUP-TFII, идентифицированные анализом пути изобретательности.*** P <0,001 ( t -тест) между CTRL и OE. Планки погрешностей обозначают стандартную ошибку среднего (s.e.m.).

Мы обнаружили, что в ответ на стресс, вызванный трансаортальным сужением (ТАС), у мышей индуцировалась экспрессия желудочковой мРНК COUP-TFII (дополнительный рис. 1а). Этот результат согласуется с предыдущими данными о повышенных уровнях белка COUP-TFII в этой модели ¹⁷ . Точно так же желудочки трансгенных мышей calcineurin (CnTg), у которых развивается гипертрофия и последующий DCM, также демонстрируют повышенную экспрессию гена COUP-TFII (дополнительный рис.1б). Кроме того, уровни белка COUP-TFII были увеличены в изолированных кардиомиоцитах мышей CnTg (дополнительный рис. 1c). Вместе эти результаты указывают на сильную связь повышенной экспрессии COUP-TFII с кардиомиопатией у мышей и людей.

COUP-TFII индуцирует DCM

Возможная связь с кардиомиопатией побудила нас исследовать, может ли повышенная экспрессия COUP-TFII у мышей влиять на развитие сократительной дисфункции. С этой целью мы скрестили ранее установленный аллель сверхэкспрессии COUP-TFII CAG-S-COUP-TFII с cre-драйвером Myh6-MerCreMer ( Myh6-MCM ) с линией ^14,19 для сверхэкспрессии COUP. -TFII, особенно в кардиомиоцитах после завершения развития сердца, при введении тамоксифена (рис.1б). Функционально сверхэкспрессия COUP-TFII (OE, Myh6-MCM; CAG-S-COUP-TFII ) у 2-месячных мышей приводила к значительному увеличению сердца по сравнению с мышами CTRL ( Myh6-MCM ) ( Фиг.1c) через 16 дней после индукции трансгена COUP-TFII (D16). Эхокардиография также показала, что мыши OE демонстрируют характеристики DCM, включая увеличенный внутренний размер левого желудочка (рис. 1d и дополнительный рис. 1e), уменьшение фракционного укорочения (рис. 1e) и уменьшение относительной толщины стенок (RWT; дополнительный рис.1е, правая панель). Прогрессивное нарушение сердечной функции привело к увеличению смертности мышей OE после активации экспрессии COUP-TFII (рис. 1f). Примечательно, что сердца OE на 16 день также имели 5,3-кратное увеличение уровней мРНК COUP-TFII по сравнению с CTRL (дополнительный рис. 1g). К этому времени в OE-сердцах наблюдалась серьезная дилатация и сократительная дисфункция, аналогичная терминальной стадии DCM у пациентов-людей. Уровни сверхэкспрессии мРНК COUP-TFII между образцами человека (3,2X, рис.1a) и OE сердца (5.3X, Supplementary Fig. 1g) не слишком далеко друг от друга, предполагая, что модель мыши актуальна. Наиболее важно то, что активированный трансген COUP-TFII увеличивает уровни белка COUP-TFII в кардиомиоцитах (дополнительный рисунок 1d) в той же степени, что и CnTg (дополнительный рисунок 1c), что дает нам уверенность в использовании этой модели для анализа роль COUP-TFII в кардиомиопатии. Таким образом, наша модель на животных показывает, что повышенная экспрессия COUP-TFII в сердце достаточна для индукции DCM с высоким уровнем смертности.

На молекулярном уровне в желудочках OE наблюдались пониженная αMHC , повышенная βMHC и пониженная SERCA2a экспрессия гена (дополнительный рис. 1h), аналогично молекулярным изменениям, наблюдаемым у пациентов с DCM человека и других моделей мышей. Чтобы получить представление об эффекте COUP-TFII на сердце, мы определили молекулярный профиль сердца OE на 16 день с помощью анализа микроматриц с использованием желудочковых компартментов. Беспристрастный анализ генной онтологии профиля OE показал значительное обогащение категории «DCM» в Киотской энциклопедии генов и геномов ( P = 2.2 × 10 ⁻⁴ ), дополнительно подтверждая ключевую роль COUP-TFII в DCM. Более того, используя профиль OE в качестве транскриптомной сигнатуры активности COUP-TFII, мы обнаружили, что сигнатура COUP-TFII значительно выше у пациентов с DCM, чем у группы CTRL (рис. 1g). Это открытие предполагает более сильное присутствие активности COUP-TFII в сердцах DCM в результате более высоких уровней экспрессии COUP-TFII (рис. 1a). В совокупности наши данные показывают, что передача сигналов COUP-TFII также существует в человеческих сердцах и положительно коррелирует с патологическим профилем DCM.

Механически анализ пути изобретательности показывает «митохондриальную дисфункцию», «β-окисление жирных кислот» и «гликолиз» как наиболее важные пути, на которые влияет избыточная экспрессия COUP-TFII в кардиомиоцитах (рис. 1h). Этот результат предполагает, что COUP-TFII изменяет гомеостаз сердечной энергии посредством модуляции экспрессии генов, важных для производства энергии, использования топлива и функции митохондрий.

Нарушение использования сердечного топлива

Профиль OE показывает значительно сниженную экспрессию многих генов, контролирующих использование топлива.Количественный анализ обратной транскрипции-ПЦР (qRT-PCR) показал, что гены захвата, связывания, доставки в митохондрии и окисления жирных кислот все проявляют пониженную экспрессию в OE-сердцах уже на 4-й день (Рис. 2a). Эти данные позволяют предположить, что использование жирных кислот в сердце OE может быть ограничено. Действительно, OE сердца демонстрируют более низкую скорость окисления олеата ex vivo (Fig. 2b), как предсказано молекулярным профилем OE сердец.

( a ) Относительные уровни мРНК по данным qRT – PCR в желудочки 4, 9 и 16 дней. N = 5 (CTRL) и 7 (OE). Цветовая кодировка уровней мРНК отображает относительные складки OE по сравнению с контрольными сердцами. ( b — d ) Измерение скорости окисления олеата ( b ), окисления глюкозы ( c ) и потребления кислорода ( d ) в изолированных цельных сердцах на 9 день с помощью препарата Лангендорфа. N = 5 (CTRL) и 7 (OE). ( e ) Анализ ChIP-qPCR на сердце 4 дня. N = 3 для каждого генотипа. На диаграмме справа показаны гены утилизации топлива, на которые влияет COUP-TFII OE. Зеленым отмечены гены с пониженной регуляцией, а красными метками — гены с повышенной регуляцией в ответ на повышенную экспрессию COUP-TFII. Экспрессия генов с белым фоном не изменяется COUP-TFII. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 ( t -тест) между CTRL и OE. Планки погрешностей обозначают s.e.m.

Всесторонний анализ генов, участвующих в использовании глюкозы в OE-сердцах, показал снижение уровней мРНК Glut4 , Hk2 и Pfkm (рис.2а) гены, необходимые для захвата глюкозы, фосфорилирования и последующего гликолиза соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что сердца OE также имеют дефект в использовании глюкозы. Это было подтверждено сниженной скоростью окисления глюкозы в ex vivo OE сердцах (рис. 2c). Интересно, что мы также наблюдали увеличение экспрессии подмножества генов гликолитических путей (рис. 2а). Однако эти изменения, которые могут быть компенсирующим эффектом, не смогли компенсировать ухудшение утилизации глюкозы.Снижение скорости окисления жирных кислот и глюкозы сопровождается снижением скорости потребления кислорода (OCR) в OE-сердцах (рис. 2d), что свидетельствует о дефекте окислительного фосфорилирования для производства энергии.

Сеть PGC-1 критически важна для регуляции генов, необходимых для сердечного метаболизма ^10,13 . Поскольку экспрессия PGC-1α повышается в жировой ткани гетерозиготных мутантных мышей COUP-TFII ²⁰ , вероятно, что экспрессия PGC-1α также изменяется, когда сверхэкспрессия COUP-TFII в сердцах .В самом деле, экспрессия PGC-1α снижается, когда COUP-TFII сверхэкспрессируется (Fig. 2a). Более того, уровни других членов сети PGC-1 , включая PGC-1β , ERRα , ERRγ и PPARα , все снижены в сердечных тканях в OE-сердцах (Fig. 2a). Представление о том, что COUP-TFII подавляет сеть PGC-1 , подтверждается обратной зависимостью COUP-TFII и PGC-1α / β ¹¹ , ERRα ²¹ и PPARα ²² подписи (дополнительный рис.2). Эти результаты показывают, что COUP-TFII является основным метаболическим регулятором, который играет центральную роль в управлении метаболизмом сердечного топлива.

Поскольку PGC-1α является прямой нижестоящей мишенью COUP-TFII в адипоцитах ²⁰ , вполне вероятно, что тот же регуляторный механизм действует и в сердце. Используя иммунопреципитацию хроматина (ChIP) -количественную ПЦР (qPCR), мы обнаружили, что COUP-TFII действительно связывается с ранее идентифицированным интронным сайтом связывания COUP-TFII в адипоцитах (рис.2д) ²⁰ . Этот результат подтверждает, что PGC-1α , вероятно, является прямой мишенью COUP-TFII в сердце и что механизм действия, с помощью которого COUP-TFII регулирует PGC-1α , сохраняется среди различных типов клеток. В дополнение к PGC-1α , COUP-TFII также напрямую связывается с генами ERRα , ERRγ и PPARα в анализах ChIP (рис. 2e). В совокупности наши результаты указывают на прямую регулирующую роль COUP-TFII для этих основных метаболических регуляторов.

Развитие митохондриальной дисфункции

Далее мы исследуем, являются ли митохондрии дисфункциональными в OE-сердцах, основываясь на подавлении экспрессии многих генов, которые кодируют компоненты в комплексах I, II, III и IV митохондриальной ETC (рис. 3a). . Анализ транскриптов дополнительно подтвердил подавление экспрессии гена ETC через 9 дней после индукции экспрессии COUP-TFII, когда сердца OE находятся на ранней стадии сердечной недостаточности (дополнительный рис. 3a). Эффект измененной экспрессии гена ETC проявляется в снижении активности ферментов комплексов I, II, III и IV в изолированных митохондриях желудочков OE (рис.3б). Этот дефект ферментных комплексов ETC может вызывать чрезмерное производство ROS и увеличивать окислительный стресс. Кроме того, сниженная экспрессия митохондриального гена мусорщика ROS Sod2 в OE-сердцах (рис. 3a и дополнительный рис. 3a) может снижать способность к детоксикации ROS и способствовать увеличению уровней ROS. В соответствии с этим профилем экспрессии генов более высокие уровни окисленных белков наблюдались в митохондриях сердец на 9-е сутки OE в анализе Oxyblot (рис. 3c). В результате функция митохондриальных белков нарушается в сердце OE, что отражается в снижении активности митохондриальной аконитазы, которая очень чувствительна к окислительному стрессу (рис.3d). Контрольные эксперименты, проведенные в восстановленном состоянии, показывают, что без воздействия окисления общие активности аконитазы сопоставимы у мышей CTRL и OE, что свидетельствует о чрезмерном окислении как основной причине снижения активности ферментов. Последствия повышенного окислительного стресса проявляются в снижении митохондриального OCR (рис. 3e) и более низком содержании митохондриального АТФ (дополнительный рис. 3b), что свидетельствует о снижении способности окислительного фосфорилирования и продукции АТФ в митохондриях сердец 9-го дня OE.Примечательно, что количество и плотность митохондрий сопоставимы между OE и CTRL сердцами, на что указывает сходное содержание митохондриальной ДНК и объемная плотность (дополнительные рис. 3c, d, соответственно). Неудивительно, что количество и плотность митохондрий не изменяются в ответ на снижение уровней PGC-1α и PGC-1β , поскольку Martin et al. уже сообщил о подобных наблюдениях у взрослых PGC-1α / β DKO сердца ¹¹ . Возможно, скорость биогенеза митохондрий замедляется на взрослой стадии, делая эффект потери PGC-1α / β менее выраженным по сравнению с перинатальным периодом, когда митохондрии быстро размножаются.Таким образом, наши результаты показывают, что снижение производства АТФ в митохондриях из-за повышенного окислительного стресса, а не из-за изменения количества митохондрий, является одним из основных факторов нарушения метаболизма энергии, наблюдаемого в сердце OE.

( a ) Профиль экспрессии пораженных митохондриальных генов в сердце на 16 день. Синие отметки отрицательно регулируются, а красный цвет обозначает активированные гены.( b — e ) Сердца 9-го дня. ( b ) Активность митохондриальных ферментов ETC, нормализованная до активности цитрат-синтазы (CS). ( c ) Оксиблот-анализ статуса окисления митохондрийных белков. Hsp60 служит для контроля загрузки. ( d ) Активность митохондриальной аконитазы в нативной и восстановленной формах, нормализованная к общему уровню митохондриального белка. N = 3 для каждого генотипа. ( e ) Скорость потребления кислорода митохондриями. ( f , g ) День 4 сердца.( f ) Уровни экспрессии ключевых митохондриальных генов-поглотителей ETC и ROS. N = 6 (CTRL) и 10 (OE). ( г ) Результаты ChIP-qPCR связывания COUP-TFII в геномных локусах генов ETC и скавенджеров ROS. N = 3 для каждого генотипа. RCR, коэффициент респираторного контроля. Олиго, эффект олигомицина. N = 3 для каждого генотипа. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 ( t -тест) между CTRL и OE. Планки погрешностей обозначают букву s.Эм.

Чтобы подтвердить, что наблюдаемые изменения митохондриального метаболизма в сердце вызваны сверхэкспрессией COUP-TFII и не являются вторичными по отношению к сердечной недостаточности, мы исследуем экспрессию генов-мишеней COUP-TFII в более ранний момент времени до начала сердечной недостаточности. День 4, вероятно, является самой ранней точкой времени для индукции экспрессии COUP-TFII после 3-дневного лечения тамоксифеном перед проявлением дефектов функции сердца. Как и ожидалось, результаты эхокардиограммы действительно не показывают значительной разницы в размере желудочковой камеры, толщине стенки и фракции выброса между CTRL и OE сердцами (дополнительный рис.3e – g), указывая на то, что на 4-й день OE сердца структурно и функционально сопоставимы с CTRL. Результаты анализа qRT – PCR на 4-й день сердца подтверждают, что подавление экспрессии генов с помощью COUP-TFII предшествует развитию грубых различий между генотипами (рис. 3f). Более того, мы также обнаружили усиленное привлечение COUP-TFII в геномные локусы генов Ndufs1 , Ndufs6 , Ndufaf4 , Sdha и Sod2 с помощью анализов ChIP в 4-е сутки сердца OE (рис.3g), подтверждая мнение о том, что COUP-TFII, вероятно, напрямую регулирует экспрессию этих генов. Важно отметить, что частота дыхания митохондрий также ниже в сердцах на 4-й день OE, чем у CTRL (дополнительный рис. 3h), что согласуется с зависимыми от COUP-TFII изменениями экспрессии генов. Взятые вместе, наши данные демонстрируют, что регуляция экспрессии и функции митохондриальных генов с помощью COUP-TFII происходит в то время, когда сердца OE структурно и функционально сходны с сердцами CTRL.Эти данные свидетельствуют о том, что нарушение регуляции функции митохондрий у мышей OE является результатом передачи сигналов COUP-TFII, а не вторичным следствием сердечной недостаточности.

Интересно, что мы обнаружили, что митохондрии сердец 9-го дня OE имеют округлую форму с пониженной электронной плотностью и увеличенным расстоянием между кристами (рис. 4a), что указывает на накопление нездоровых митохондрий. В соответствии с морфологическими данными, мы наблюдали снижение экспрессии ключевых генов митохондриальной динамики в OE-сердцах, в том числе Pink1 для удаления поврежденных митохондрий и Opa1 , Mfn1, и Mfn2 для слияния и регенерации здоровых митохондрий. (Инжир.4b и дополнительный рис. 4a), тогда как не наблюдали изменений в экспрессии генов деления Fis1 , Mff и Dnm1l (дополнительный рис. 4a). Кроме того, уровни белка Pink1, Mfn1 и Mfn2 были снижены в изолированных кардиомиоцитах сердца OE на ранней стадии отказа (день 9, дополнительный рис. 4b), что указывает на то, что COUP-TFII может напрямую контролировать экспрессию этих генов. Сниженная экспрессия Pink1 и Mfn2 , двух из трех основных участников пути контроля качества митохондрий ^23,24 , в OE-сердцах может нарушить митохондриальную динамику и способствовать накоплению поврежденных митохондрий, как видно на электронная микрофотография (рис.4а). В совокупности эти находки предполагают, что увеличение COUP-TFII нарушает митохондриальный гомеостаз за счет подавления экспрессии генов митохондриальной динамики.

( a ) Репрезентативные электронные микрофотографии желудочков 9-го дня от обозначенных генотипов. Шкала 0,5 мкм. ( b ) Относительные уровни мРНК основных генов динамики митохондрий в изолированных кардиомиоцитах на 9 день. N = 3 для каждого генотипа.( c ) Результаты ChIP-qPCR связывания COUP-TFII в геномных локусах митохондриальных динамических генов. N = 3 для каждого генотипа. ( d ) Диаграмма обогащенной COUP-TFII-связывающей области в локусе мыши Pink1 , идентифицированном с помощью ChIP-qPCR, показана в c , на которой гиперчувствительность к DNaseI является результатом 8-недельных сердец (из браузера генома UCSC , mm9) и консервативной последовательности связывания COUP-TFII. ( e ) Анализ репортера люциферазы иллюстрирует относительную активность сайтов связывания COUP-TFII дикого типа (WT) и мутантных (mu) в клетках C2C12.* P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 ( t -Test) между CTRL и OE. Планки погрешностей обозначают s.e.m.

Результаты анализа ChIP-qPCR дополнительно показывают in vivo связывание COUP-TFII на геномных локусах генов митохондриальной динамики Pink1 , Opa1 и Mfn2 взрослых сердец (рис. 4c), что позволяет предположить, что эти гены являются прямыми мишенями COUP-TFII. Затем мы использовали консервативный сайт связывания COUP-TFII гена Pink1 в качестве примера, чтобы продемонстрировать прямую регуляцию Pink1 с помощью COUP-TFII через эти цис -действующих элементов.Этот сайт связывания COUP-TFII расположен между 93 и 105 парами оснований перед сайтом начала транскрипции, в пределах участка высококонсервативных нуклеотидов между человеком и мышью. Этот сайт окружен открытым хроматином, о чем свидетельствует высокая чувствительность ДНКазыI (рис. 4d). Участок консервативных нуклеотидов из этой области, которые содержат сайты связывания COUP-TFII дикого типа (Pink1_WT) или мутантные (Pink1_mu), клонировали перед репортером люциферазы, управляемым TATA-промотором, для анализа люциферазы в клетках C2C12.Сайт связывания COUP-TFII демонстрирует пониженную репортерную активность по сравнению с активностью мутантного сайта (фиг. 4e), предполагая репрессивную роль в регуляции экспрессии гена Pink1 . Взятые вместе, результаты показывают, что связывание COUP-TFII в геномных локусах подавляет экспрессию генов митохондриальной динамики.

Регуляторная сеть COUP-TFII у человека

Ключевая роль COUP-TFII в регуляции митохондриальных и метаболических генов, наблюдаемых у мышей, здесь также встречается у человека, что подтверждается общедоступными данными из образцов пациентов (рис.5). Активность COUP-TFII оценивали и ранжировали в профилях РНК 102 желудочков человека (GSE5406) ​​на основе сигнатуры гена COUP-TFII мыши (фиг. 5, верхняя панель). Более высокая сигнатура COUP-TFII указывает на более сильную активность COUP-TFII в образце. Сначала мы наблюдали положительную и значимую корреляцию между уровнями COUP-TFII и активностями в этих образцах от человека (рис. 5). Этот результат подтверждает мнение о том, что регуляторная сеть COUP-TFII, идентифицированная у мышей, также действует в сердце человека.Кроме того, существует положительная корреляция между активностью COUP-TFII и уровнями маркера сердечного стресса Nppb (рис. 5), что позволяет предположить, что усиление передачи сигналов COUP-TFII может быть связано с сердечным стрессом в сердцах человека, что согласуется с тем, что мы наблюдается на нескольких моделях мышей.

(Верхняя панель) Данные массива экспрессии 86 отказов и 16 исправных миокарда левого желудочка человека из GSE5406 для генов в сигнатуре транскрипции COUP-TFII, с образцами, упорядоченными на основе проявления сигнатуры.(Нижняя панель) Тепловая карта показывает уровни интересующих генов в отдельных образцах в соответствии с порядком на верхней панели. Направление и статистическая значимость корреляции между экспрессией интересующих генов и сигнатурой COUP-TFII указаны сбоку. Красный цвет означает положительную корреляцию ( P, <0,05, показатель Пирсона), а синий цвет означает отрицательную корреляцию.

Сравнивая активности COUP-TFII и уровни экспрессии интересующих генов, мы обнаружили значительную и обратную корреляцию между активностями COUP-TFII и уровнями многих митохондриальных генов, которые кодируют ферменты ETC, включая 23 комплекса I, 4 комплекса II и 6 комплексных. III гены (рис.5). Более того, уровни митохондриальных динамических генов MFN2, OPA1 и PINK1 также отрицательно коррелируют с активностями COUP-TFII (Рис. 5). Эти данные согласуются с важной ролью COUP-TFII в подавлении митохондриальных функций и гомеостаза у пациентов.

Аналогичным образом были обнаружены обратные корреляции между активностями COUP-TFII и уровнями генов энергетического метаболизма, включая гены катаболизма жирных кислот FABP3, MLYCD, ACADVL, ACADM, ACADS и ACAA2 , гены метаболизма глюкозы SLC2A4, PF , LDHB и PDK2 , а также основные метаболические регуляторы ERRα, ERRγ и PPARα (рис.5). Компенсаторный эффект увеличения экспрессии гликолитического гена ENO1 также наблюдается в сердце человека (рис. 5), что дополнительно подтверждает наличие консервативного механизма регуляции сердечного метаболизма. Таким образом, экспрессия генов энергетического метаболизма подавляется, когда уровни COUP-TFII повышаются в человеческих сердцах.

Снижение COUP-TFII ослабляет прогрессирование заболевания

Трансгенные мыши calcineurin вырабатывают DCM ²⁵ , и экспрессия COUP-TFII повышается у этих мышей (дополнительный рис.1б, в). Поэтому мы использовали эту модель, чтобы проверить, улучшает ли снижение дозы COUP-TFII прогрессирование заболевания. Аллели COUP-TFII floxed и Myh6-MerCreMer были скрещены с фоном CnTg , чтобы позволить генетическое удаление одной копии гена COUP-TFII в кардиомиоцитах у 7-недельных животных посредством индуцированного тамоксифеном , cre вырезание гена, опосредованное рекомбиназой (рис. 6а). Большинство мышей, несущих трансген кальциневрина на фоне COUP-TFII ^{flox / +} ( CnTg; COUP-TFII ^{flox / +} , CnTg / F ⁺ ) демонстрируют повышенный уровень внезапной смерти после 12-недельного возраста по сравнению с мышами из групп CTRL COUP-TFII ^{flox / +} ( F ⁺ ) и Myh6-MerCreMer; COUP-TFII ^{flox / +} ( Cre / F ⁺ ), показанный на рис.6б. Удаление одной копии гена COUP-TFII в кардиомиоцитах на трансгенном фоне calcineurin ( CnTg; Myh6-MerCreMer; COUP-TFII ^{flox / +} , CnTg / Cre / F ⁺ ). снижает уровни белка COUP-TFII (дополнительный рис. 5a) и приводит к увеличению общей выживаемости по сравнению с группой CnTg / F ⁺ в течение 20-недельного периода (рис. 6b). Это демонстрирует, что снижение дозы COUP-TFII продлевает выживаемость при интенсивном сердечном стрессе.

( a ) Опытный образец. Эхо, эхокардиография. ( b ) Кривая Каплана-Мейера для мышей с обозначенными генотипами в течение 20-недельного периода наблюдения. ( c ) Внутренний размер левого желудочка в диастолу в указанные моменты времени. ( d ) Относительная толщина стенки левого желудочка. Генотипы указаны внизу. N = 10 (F ⁺ ), 10 ( Cre / F ⁺ ), 5 ( CnTg / F ⁺ ) и 11 ( CnTg / Cre / F ⁺ ).* P <0,05; NS, P > 0,05 ( t -тест) между обозначенными группами. Планки погрешностей обозначают s.e.m.

Детский оздоровительный лагерь «Связист» расположен в уникальной природной зоне Ленинградской области на берегу озера в окружении соснового леса недалеко от поселка Петровский (Карельский перешеек).Удивительная природа и целебный лесной воздух создают идеальные условия для отдыха. К услугам детей новые современные коттеджи класса люкс, 3-х местные номера со всем необходимым для комфортного проживания. Коттеджи расположены в 2 минутах от Главного корпуса, где есть спортивно-оздоровительная секция с бассейном, настольным теннисом, многофункциональным спортивным залом и кинотеатром. 5-разовое питание со сбалансированным рационом.

концертный зал, детская площадка, спортивный зал, стадион, футбольное поле, баскетбольное поле, волейбольное поле, бассейн

Есть медпункт с педиатром, медсестрой.Медицинская помощь ребенку может быть оказана круглосуточно.

Питание детей в школе — ГБОУ Школа 255

РАСПИСАНИЕ СТОЛОВОЙ ШКОЛЫ

Условия льготной поставки

Бесплатное питание или питание по сниженной цене с компенсацией 100% его стоимость присуждается студентам следующих категорий:

• проживающих в малообеспеченных семьях;
• человек, проживающих в многодетных семьях;
• Дети-сироты или дети, оставшиеся без попечения родителей;
• в отключенном состоянии;
• на учете в туберкулезном диспансере;
9 930 хронических болезней, перечень утвержден (перечень хронических болезней ) ;
• учеников 1-4 классов (завтрак).

Основания предоставления мощности:

Основанием для обеспечения вашего ребенка питанием является ваше заявление в образовательное учреждение (анкету можно получить у Калининой С.М., ответственной за питание в школе №255 (библиотека) по фонарному переулку. Д.4) и документы, которые определяется для каждой привилегированной категории (список документов, необходимых для установления привилегированной категории).

Питание по сниженной цене возможно, начиная с месяца, следующего за месяцем подачи заявки, если заявка подана на 20 текущий номер.

Предоставление полномочий для прекращения дел:

• утрата студентами права на обеспечение питанием — с 1 числа месяца, следующего за месяцем, наступившим при соответствующих обстоятельствах;
• об установлении недостоверности уведомления об изменении сведений, представленных заявителем, или несвоевременной указанной информации — с 1 числа месяца, следующего за месяцем, наступившим при соответствующих обстоятельствах;

Для обеспечения компенсационных выплат родителям (в случае домашнего обучения учеников) необходимо заполнить заявление на компенсационную выплату (бланк заявления можно получить у ответственного по питанию Калинина С.М.)

Ответственный за организацию питания в школе

Светлана Калинина
проволока.+ 7-951-656-55-86 (с 10.00 до 16.00) (библиотека школы №255)

Директор школы — Капитанова Екатерина Борисовна
провод. + 7-953-156-16-21 (с 10.00 до 19.00)

Кейтеринг, организованный ООО «Кулинарная компания Капитал»

• Юр. адрес: 121596, г. Москва, ул. Горбунова, д.2, стр.3, этаж 8, пом. II, комн. 38Д, офис 11А
• ИНН 7733797051
• КПП 773101001
• ОКПО 09172984
• ОКОГУ 4210014
• ОГРН 1127746212351

Генеральный директор: Шадрин Данила Витальевич

Информация о действующих нормативных документах, регулирующих организацию питания в ОС, размещена на сайтах:

• Управление социального питания http: // www.gov.spb.ru
• Социальное питание Санкт-Петербург http : // socpspitanie . спб . ру /

• +7 (812) 576-19-01 — Управление социальной защиты населения Адмиралтейского района
• +7 (8120576-97-49 — отдел потребительского рынка администрации Адмиралтейского района
• +7 (8120 571-62-00 — Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Адмиралтейскому району г. Санкт-Петербург).Санкт-Петербург (www.78.rospotrebnadzor.ru)

местные документы

Ядерный рецептор LRH-1 / NR5A2 необходим и нацелен на разрешение стресса эндоплазматического ретикулума печени

1) Основная идея документа о том, что это новая ветвь UPR, является преждевременной, не подтверждается этими данными и не отражает точное описание результатов. Крайне важно либо продемонстрировать, что предлагаемый путь является новым ответвлением UPR, либо просто изменить название и центральную предпосылку статьи на «определение роли LRH-1 в стрессе ER в печени».Между этими концепциями есть важное различие.

Мы полностью согласны с тем, что концепции совершенно разные, и в нашем первоначальном сообщении мы не намеревались утверждать, что этот инициируемый LRH-1 путь для разрешения стресса ER является четвертой ветвью UPR. У нас нет доказательств того, что он напрямую способствует восстановлению функции ER, например, способствуя сворачиванию белка, и мы не наблюдали дифференциальной экспрессии генов-мишеней UPR после агонизма LRH-1 (рис. 7C).Кроме того, LRH-1 не экспрессируется повсеместно. Таким образом, как теперь указывается в обсуждении, этот путь нельзя считать эквивалентным трем каноническим ветвям. Мы также добавили к заголовку « печень, разрешение стресса эндоплазматического ретикулума», как было предложено. Тем не менее, ось PLK3 / ATF2 довольно отделена от известных компонентов UPR, и мы считаем, что результаты убедительно подтверждают наш вывод о том, что этот путь «не зависит от UPR, но в равной степени необходим» для разрешения стресса.

Для более непосредственного решения проблемы функционального взаимодействия с каноническими путями мы использовали siRNA для нокдауна Ire1a , Perk и Atf6 в первичных гепатоцитах и ​​определили, является ли ER-стресс-чувствительная индукция генов-мишеней LRH-1. затронутый. Поскольку метаболические гены-мишени LRH-1 Cyp7A1 или Cyp8B1 не регулируются в культивируемых клетках, мы сосредоточились на Shp, и Plk3. Мы наблюдали, что оба являются индуцируемыми стрессом, но их индукция значительно снижается с потерей Ire1a (рис. 3E ) .Поскольку экспрессия Ire1a также является критической для индукции мРНК Lrh-1 (рис. 3E), однако возможно, что IRE1a в первую очередь влияет на экспрессию LRH-1, а не на его активность.

2) Практически во всех экспериментах, исследующих роль LRH-1 в UPR, авторы исследовали уровни XBP1, ATF6 и ATF4 и использовали эти измерения как прямое отражение стресса ER через канонические ветви. Доказательства, подтверждающие наличие неразрешенного ER-стресса, в первую очередь основаны на том факте, что после лечения туникамицином или гепатэктомии в печени мышей с нокаутом обнаруживается стеатоз.Важно охарактеризовать состояние ER дополнительными мерами, чтобы приблизиться к этой интерпретации. Важным аспектом этого является состояние проксимальных сенсоров, таких как фосфорилирование IRE1 и PERK, и доказательства появления дезадаптивных ответов, таких как апоптотические сигналы, активация JNK и др. В противном случае остается возможность, что этот ER находится в новом равновесии с усиленным UPR и что LRH-1 связан с метаболизмом липидов, а не представляет собой добросовестную новую ветвь UPR .

Мы получили новые данные, подтверждающие наш вывод о том, что стресс ER является устойчивым и токсичным у мышей, лишенных Lrh-1 . Хотя ранее мы показали, что мыши Lrh-1 ^LKO демонстрируют повышенную гибель клеток после туникамицина с помощью окрашивания TUNEL, теперь мы также исследовали активацию каспазы после стресса у наших мышей. Как и ожидалось, мы наблюдали большую вызванную стрессом активацию каспаз у мышей Lrh-1 ^LKO (рис. 1E).

Мы также использовали тиофлавин Т, который флуоресцирует при связывании с белковыми агрегатами (Beriault and Werstuck, 2013) в качестве дополнительного метода визуализации и количественной оценки ER стресса. В первичных гепатоцитах, обработанных туникамицином, от контрольных мышей и мышей Lrh-1 ^LKO мы наблюдали поразительно увеличенную флуоресценцию в более поздние моменты времени после обработки туникамицином у мышей Lrh-1 ^LKO (рис. 1F). Это указывает на то, что потеря Lrh-1 не только влияет на компоненты передачи сигналов UPR, но также вносит вклад в большую неправильную укладку белков.

Мы не считаем, что ER у мышей Lrh-1 ^LKO находится в новом равновесии после стресса по следующим причинам: 1) Окрашивание тиофлавином T указывает на гораздо большее количество белковых агрегатов в Lrh-1. ^LKO мышей после стресса ER (рисунок 1F). 2) Мы не наблюдаем какой-либо активации UPR у мышей Lrh-1 ^LKO до лечения стрессорами ER (рисунок 1G; рисунок 1 – рисунок в приложении 1).3. Мы наблюдаем больший апоптоз в ответ на широкий спектр стрессоров у мышей Lrh-1 ^LKO (рисунок 1C, D; рисунок 2B).

Хотя мы не можем исключить, что наблюдаемый стеатоз у мышей Lrh-1 ^LKO после стресса ER также мог быть причиной стресса ER, мы считаем важным отметить, что это накопление жира наблюдается только в более поздние моменты времени. (48 часов и позже) после лечения туникамицином (рис. 1A, B). UPR быстро (в течение нескольких часов) реагирует на неправильно свернутые белки, и мы показали, что наш путь максимально активируется в течение нескольких часов после лечения туникамицином.Следовательно, основная часть стрессового ответа ER (и, можно утверждать, разрешение) у нормальных мышей происходит задолго до накопления значительного количества жира у мышей, дефицитных по разрешению ER стресса. Хотя возможно, что LRH-1 имеет решающее значение для аспектов липидного метаболизма, также важно отметить, что уровень липидов не увеличивается значительно у мышей Lrh-1 ^LKO до стресса ER (рис. 1A, B). . Таким образом, мы утверждаем, что LRH-1 имеет решающее значение для разрешения стресса ER.

3) Приводит ли стресс ER к состоянию активации или субклеточной локализации LRH-1? Есть ли другие показания для прямой модификации этой молекулы стрессом ЭР? Если да, то передается ли такой эффект через IRE1 или PERK?

В новых результатах мы показываем, что стресс ER не влияет на субклеточную локализацию; LRH-1 является исключительно ядерным со стрессом ER или без него (Рисунок 3F). Таким образом, маловероятно, что LRH-1 непосредственно фосфорилируется или модифицируется связанными с ER факторами UPR.

Мы обнаружили, что индукция генов-мишеней LRH-1 увеличивается после стресса ER, что может быть связано с повышенной экспрессией мРНК Lrh-1 . Мы обнаружили (как подробно описано в пункте 1 выше), что IRE1a и ATF6 могут контролировать эту индукцию Lrh-1 . Однако более интригующий вопрос заключается в том, увеличивается ли транскрипционная активность LRH-1 после стресса ER, возможно, за счет индукции агонистического лиганда или посттрансляционной модификации. К сожалению, оба эти вопроса очень трудно решить, поскольку ничего не известно об эндогенных агонистах LRH-1, и мало что известно о регуляции активности LRH-1 в любом контексте.

4) Авторы утверждают, что дефектное разрешение стресса ER у мышей, специфичных для печени LRH-1, связано с потерей фосфорилирования ATF2 в ответ на стимулы стресса ER. Однако текущие данные не подтверждают, что фосфорилирование ATF2 важно для разрешения стресса ER. Могли ли авторы отключить ATF2 в печени мышей и исследовать, есть ли какие-либо дефекты в разрешении стресса ER после заражения? Альтернативно, пытались ли авторы исследовать, проявляет ли печень с дефицитом ATF2 или PLK3 гепатостеоз и / или изменения в стрессовых ответах ER ?

Мы согласны с тем, что данные о требованиях к ATF2 для устранения стресса ER укрепят нашу позицию.Чтобы решить эту проблему, мы создали аденовирусы, экспрессирующие конститутивно активный ATF2 или доминантно-отрицательный ATF2, который не может быть фосфорилирован по критическим остаткам. Мы наблюдали, что экспрессия конститутивно активного ATF2 в клетках Lrh-1 ^LKO увеличивает их способность преодолевать стресс ER; наоборот, экспрессия доминирующего отрицательного ATF2 в контрольных клетках снижает их способность преодолевать стресс ER (рис. 6E, G). Хотя возможно, что PLK3 не проявляет свой защитный эффект в разрешении стресса ER исключительно через ATF2, ясно, что ATF2 (и потенциально избыточные факторы транскрипции семейства ATF) действительно играют критическую роль в разрешении стресса ER.

В ответ на более поздние вопросы мы обнаружили, что печень с дефицитом Plk3 и демонстрирует устойчивую передачу сигналов UPR после лечения туникамицином (рис. 5J), что позволяет предположить, что они не могут справиться с ER-стрессом так же эффективно. Мы не наблюдали повышенного гепатостеатоза из-за того факта, что фон этой линии мышей более чувствителен к туникамицину, чем контрольные для мышей с дефицитом Lrh-1 , и, следовательно, даже мыши Plk3 дикого типа также проявляют повышенный гепатостеатоз после TM относительно мышей C57 / Bl6.Однако в базовых условиях нокауты PLK3 не проявляют ни активации UPR, ни значительного повышения уровня триглицеридов.

5) Доказательства, связывающие активацию ATF2 исключительно с ответом на стресс ER, неполны, поскольку PLK3 имеет много других взаимодействующих и связывающих партнеров. p53, HIF1A и C-Jun могут участвовать в опосредовании как клеточного стресса, так и стресса ER. Например, воздействие токсинов, таких как туникамицин, на гепатоциты, вызывает ER-стресс, который затем способствует клеточной реакции на окислительный стресс.В этом случае активация ATF2 потенциально является частью реакции на окислительно-восстановительный стресс. Существуют ли другие сигнальные каскады, кроме ATF2, с повышенной регуляцией у мышей, обработанных лигандом LRH-1 или экзогенными токсинами? Комментарии по этому поводу были бы полезны. Эти возможности должны быть рассмотрены либо путем дополнительных экспериментов, направленных на последующие цели PLK3, либо, по крайней мере, в разделе обсуждения статьи .

Это правда, что PLK3 имеет дополнительных партнеров по взаимодействию, включая другие факторы транскрипции.Мы дополнили нашу рукопись дополнительным анализом данных нашего массива, чтобы определить, могут ли гены, дифференциально индуцированные стрессом у мышей Lrh-1 ^LKO , быть мишенями дополнительных факторов транскрипции, которые, как известно, фосфорилируются PLK3. Эта информация обобщена в таблице 2 и подробно обсуждается в разделе «Результаты и обсуждение».

После этого дополнительного анализа наиболее значимое совпадение нашего набора генов (Таблица 1) с известным связыванием промотора фактора транскрипции осталось таковым для ATF2.Однако мы также наблюдали некоторое обогащение для генов-мишеней p53 и c-Jun (а также для LRH-1, но, как полагают, это не регулируется PLK3). Интересно, что гены в нашем наборе генов, которые являются прямыми мишенями для p53 или c-Jun, также являются прямыми мишенями для ATF2. Другими словами, мы не идентифицировали какие-либо гены, связанные с p53 или c-Jun, которые не связаны с ATF2 в той же области (данные не показаны в документе из соображений размера). Следовательно, эти исследования не могут показать доказательств критической роли p53 или c-Jun в индукции этих генов.Тот факт, что экспрессия конститутивно активного ATF2 в клетках Lrh-1 ^LKO способствует разрешению стресса ER (рис. 6E, G), свидетельствует о том, что ATF2 является основным функциональным продуктом PLK3 в разрешении стресса ER. Возможно, что p53 или c-Jun могут образовывать комплексы с ATF2 в контексте стресса ER, чтобы максимизировать индукцию гена. Тем не менее известно, что ATF2 связывает дополнительные гены в нашем списке, которые, по-видимому, не являются мишенями для p53 или c-Jun, что позволяет предположить, что ATF2 может работать самостоятельно (или, по крайней мере, без этих факторов транскрипции).Поскольку HIF1a фосфорилируется PLK3, но это фосфорилирование дестабилизирует (Xu D, Yao Y, Lu L, Costa M, Dai W. 2010. Plk3 функционирует как важный компонент пути регуляции гипоксии путем прямого фосфорилирования HIF-1alpha. Journal of Biological Chemistry 285: 38944–38950. doi: 10.1074 / jbc.M110.160325.), Мы не исследовали HIF1a в дальнейшем.

Мы также исследовали, индуцировалась ли реакция на окислительный стресс в нашем списке целевых генов. Нет известных факторов транскрипции окислительного стресса, которые фосфорилируются PLK3 (если вы не включаете p53), поэтому мы сравнили наш список генов с общегеномным связыванием NRF2.Мы не наблюдали значительного перекрытия. В более поздние моменты времени (например, 48 или 72 часа) после обработки туникамицином, мы могли бы ожидать наблюдения окислительного стресса у мышей Lrh-1 ^LKO в результате их неразрешенного ER-стресса. Однако мы можем сделать вывод, что LRH-1, по-видимому, не контролирует реакцию окислительного стресса на туникамицин в более ранние моменты времени, которые составляют первичную стрессовую реакцию ER.

Контролируются ли дополнительные, более широкие пути LRH-1 и / или PLK3 в ответ на стресс, остается открытым вопросом.Однако ранее мы выполнили ряд непредвзятых биоинформатических анализов (открытие мотивов, генная онтология и т. Д.) И не обнаружили ничего значительного, кроме факторов связывания CRE / ATF2 (значимые данные в бумаге, некоторые данные не показаны), которые предполагали бы дополнительные пути, зависящие от LRH-1, необходимы для разрешения стресса ER.

6) Влияет ли лиганд LRH-1 на фосфорилирование ATF2 в ответ на стрессовые стимулы ER?

К сожалению, мы не смогли решить эту проблему напрямую из-за трудностей с более поздними партиями антитела фосфо-ATF2 (Cell Signaling 9225S).Все показанные эксперименты были выполнены с использованием партии 3 этого антитела, которое обнаруживает одну чистую полосу. Однако теперь мы можем получить только пакет 4, который обнаруживает несколько полос без четкой полосы pATF2. Нам не удалось надежно обнаружить pATF2 с помощью других антител.