Роспотребнадзор структура: 3. Федеральная служба по надзору в сферезащиты прав потребителей и благополучия человека(Роспотребнадзор) 

3. Федеральная служба по надзору в сферезащиты прав потребителей и благополучия человека(Роспотребнадзор) 

Федеральная служба	Хронология изменений
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)	с 01.05.2021 по 31.08.2022 Роспотребнадзор является федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации биологически активных добавок к пище
	с 01.04.2021 по 31.08.2022 Роспотребнадзор является федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке пива, напитков, изготавливаемых на основе пива, и отдельных видов слабоалкогольных напитков средствами идентификации
	с 30.03.2021 Роспотребнадзор определен уполномоченным федеральным органом исполнительной власти по обмену информацией о результатах исследований на наличие возбудителя новой коронавирусной инфекции (COVID-19) в целях осуществления своевременного информирования физических лиц с использованием ФГИС «Единый портал государственных и муниципальных услуг (функций)»
	с 11. 01.2021 по 28.02.2022 Роспотребнадзор является федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации и мониторингу оборота отдельных видов никотинсодержащей продукции
	с 14.12.2020 по 30.06.2021 Роспотребнадзор является участником эксперимента по досудебному обжалованию решений контрольного (надзорного) органа, действий (бездействия) его должностных лиц, уполномоченным на рассмотрение поступающих в рамках эксперимента жалоб
	с 03.11.2020 Роспотребнадзор осуществляет федеральный государственный контроль (надзор) за соблюдением требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности химической продукции» в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и в рамках федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей
	с 24.09.2020 Роспотребнадзор определен уполномоченным федеральным органом исполнительной власти, осуществляющим проведение нотификации новых химических веществ, а также проведение процедуры разрешительной государственной регистрации химической продукции (химических веществ и смесей) при наличии в ее составе новых химических веществ в части оценки их опасности для здоровья человека и окружающей среды с учетом физико-химических, токсикологических и экотоксикологических свойств
	с 15. 04.2020 Роспотребнадзор является уполномоченным федеральным органом исполнительной власти по учету и распределению произведенных (изготовленных) на территории РФ организациями, подведомственными федеральным органам исполнительной власти (за исключением организаций, подведомственных Минобороны России), тест-систем для диагностики новой коронавирусной инфекции, а также по учету информации о проведенных в РФ исследованиях на диагностику новой коронавирусной инфекции и об их результатах.
	с 01.04.2020 Роспотребнадзор является федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации упакованной воды
	с 01.02.2020 Роспотребнадзор осуществляет государственный контроль (надзор) за соблюдением требований технического регламента Евразийского экономического союза «Об ограничении применения опасных веществ в изделиях электротехники и радиоэлектроники» в отношении изделий электротехники и радиоэлектроники, реализуемых исключительно для личных, семейных, домашних и иных не связанных с осуществлением предпринимательской деятельности нужд потребителей
	с 03. 10.2019 Роспотребнадзор обеспечивает участие работников федеральных органов исполнительной власти и подведомственных им федеральных государственных учреждений или федеральных унитарных предприятий в процедурах признания и оценки соответствия испытательных лабораторий (центров) принципам надлежащей лабораторной практики, соответствующим принципам надлежащей лабораторной практики Организации экономического сотрудничества и развития
	с 01.10.2019 по 30.06.2020 Роспотребнадзор являлся уполномоченным органом на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации и мониторингу оборота отдельных видов табачной продукции, подлежащих обязательной маркировке с 1 июля 2020 г.
	с 16.09.2019 Роспотребнадзор является федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке велосипедов и велосипедных рам средствами идентификации и мониторинга оборота данной продукции
	с 01.09.2019 Роспотребнадзор является уполномоченным органом на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации кресел-колясок, относящихся к медицинским изделиями, и мониторингу за их оборотом
	с. 15.07.2019 Роспотребнадзор является федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации отдельных видов молочной продукции
	с 01.07.2019 по 30.11.2019 Роспотребнадзор являлся федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации духов и туалетной воды на территории РФ
	с 27.06.2019 по 30.11.2019 Роспотребнадзор являлся федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации отдельных позиций продукции легкой промышленности
	с 20.06.2019 по 30.11.2019 Роспотребнадзор являлся федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации шин и покрышек пневматических резиновых новых
	с 15.05.2019 по 30.11.2019 Роспотребнадзор являлся федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации фотокамер (кроме кинокамер), фотовспышек и ламп-вспышек
	с 13. 03.2019 Роспотребнадзор осуществляет государственный контроль (надзор) за соблюдением требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности упакованной питьевой воды, включая природную минеральную воду»
	с 30.05.2018 Роспотребнадзор является уполномоченным (компетентным) органом РФ для осуществления сотрудничества по реализации «Соглашения о сотрудничестве в сфере противодействия производству и распространению контрафактной продукции» (Заключено в г. Казани 26.05.2017)
	с 01.06.2018 по 30.06.2019 Роспотребнадзор являлся федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке средствами идентификации обувных товаров на территории РФ
	с 16.05.2018 Роспотребнадзор уполномочен принимать, приостанавливать действие и отменять решение о нежелательности пребывания (проживания) иностранного гражданина или лица без гражданства в РФ, принятое в связи с наличием обстоятельств, создающих реальную угрозу здоровью населения
	с 14. 12.2017 по 28.02.2019 Роспотребнадзор являлся федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке табачной продукции средствами идентификации и мониторингу оборота табачной продукции
	с 01.09.2017 Роспотребнадзор в пределах своей компетенции в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей осуществляет государственный контроль (надзор) за соблюдением требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности рыбы и рыбной продукции»
	с 15.05.2016 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является уполномоченным органом РФ, осуществляющим государственный контроль (надзор) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на табачную продукцию»
	с 01. 04.2016 Роспотребнадзор является федеральным органом исполнительной власти, уполномоченным на обеспечение проведения эксперимента по маркировке товаров контрольными (идентификационными) знаками по товарной позиции «Предметы одежды, принадлежности к одежде и прочие изделия, из натурального меха»
	с 28.10.2015 Роспотребнадзор определен ответственным за выполнение обязательств РФ, вытекающих из «Базельской конвенции о контроле за трансграничной перевозкой опасных отходов и их удалением» (Заключена в г. Базеле 22.03.1989) в части осуществления федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора при трансграничных перевозках опасных отходов и обращении с ними
	с 12.08.2014 Роспотребнадзор осуществляет в пределах своих полномочий выполнение РФ обязательств, предусмотренных «Стокгольмской конвенцией о стойких органических загрязнителях» (Заключена в г. Стокгольме 22.05.2001)
	с 24.06.2014 одним из уполномоченных органов РФ по осуществлению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности маломерных судов» является Роспотребнадзор в рамках осуществления государственного надзора в области защиты прав потребителей в пределах установленной компетенции.- Государственная инспекция по маломерным судам МЧС России
	— Роспотребнадзором и иными уполномоченными на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора федеральными органами исполнительной власти в пределах своей компетенции в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора; — Роспотребнадзором в рамках федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей.
	— Роспотребнадзором и иными уполномоченными на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора федеральными органами исполнительной власти в пределах своей компетенции в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора; — Роспотребнадзором в рамках федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей.
	с 16.11.2013 Роспотребнадзор осуществляет обеспечение соблюдения требований «Конвенции 2006 года о труде в морском судоходстве» (Заключена в г. Женеве 23.02.20106), предусмотренных правилами 3.1 «Жилые помещения и условия для отдыха», 3.2 «Питание и столовое обслуживание» и 4.3 «Охрана здоровья, обеспечение безопасности и предупреждение несчастных случаев» (в части обеспечения безопасных санитарно-гигиенических условий)
	с 07.09.2013 государственный контроль (надзор) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» осуществляется: — Роспотребнадзором и иными уполномоченными на осуществление федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора федеральными органами исполнительной власти в пределах своей компетенции в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора; — Роспотребнадзором в рамках федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей.
	с 13.07.2013 Роспотребнадзор является уполномоченным органом РФ по обеспечению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности зерна» в отношении зерна, реализуемого для личных нужд потребителей
	с 08.07.2013 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является: — уполномоченным органом РФ по обеспечению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей»;- уполномоченным органом РФ по обеспечению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на масложировую продукцию»
	с 22.06.2013 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является: — уполномоченным органом РФ по обеспечению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств»;- уполномоченным органом РФ по обеспечению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания»
	с 18. 06.2013 Роспотребнадзор осуществляет федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор в целях охраны здоровья и обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения
	с 15.06.2013 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является уполномоченным органом РФ по обеспечению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «Пищевая продукция в части ее маркировки»
	с 25.05.2013 Роспотребнадзор осуществляет государственный контроль (надзор) за соблюдением требований:а) технического регламента Таможенного союза «О безопасности низковольтного оборудования» в отношении низковольтного оборудования, реализуемого исключительно для личных, семейных, домашних и иных не связанных с осуществлением предпринимательской деятельности нужд потребителей;б) технического регламента Таможенного союза «О безопасности машин и оборудования» в отношении машин и оборудования, реализуемых исключительно для личных, семейных, домашних и иных не связанных с осуществлением предпринимательской деятельности нужд потребителей
	с 19. 03.2013 Роспотребнадзор осуществляет функции по разработке и утверждению государственных санитарно-эпидемиологических правил и гигиенических нормативов (до 19.03.2013 эти функции осуществлялись Минздравом России)
	с 02.03.2013 Роспотребнадзор является органом, уполномоченным на формирование и ведение государственного информационного ресурса в области защиты прав потребителей, а также на координацию деятельности уполномоченных федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих государственный контроль (надзор) за соответствием товаров требованиям безопасности, установленным техническими регламентами, и общественных объединений потребителей (их ассоциаций, союзов), связанной с участием в формировании указанного ресурса
	с 11.12.2012 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является уполномоченным органом РФ по обеспечению государственного контроля (надзора) за соблюдением требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности средств индивидуальной защиты»
	с 29. 11.2012 Роспотребнадзор осуществляет в целях государственной поддержки инновационной деятельности в установленных сферах деятельности следующие полномочия: а) предоставление информационной поддержки; б) предоставление консультационной поддержки, содействие в формировании проектной документации; в) формирование спроса на инновационную продукцию; г) финансовое обеспечение; д) реализация целевых программ, подпрограмм и проведение мероприятий в рамках государственных программ РФ; е) поддержка экспорта; ж) обеспечение инфраструктуры
	с 01.11.2012 Роспотребнадзор является уполномоченным Правительством РФ федеральным органом исполнительной власти, принимающим решения, являющиеся основаниями для включения доменных имен и (или) указателей страниц сайтов в информационно-телекоммуникационной сети «Интернет», а также сетевых адресов в единую автоматизированную информационную систему «Единый реестр доменных имен, указателей страниц сайтов в информационно-телекоммуникационной сети «Интернет» и сетевых адресов, позволяющих идентифицировать сайты в информационно-телекоммуникационной сети «Интернет», содержащие информацию, распространение которой в Российской Федерации запрещено»
	с 23. 10.2012 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является:
	с 09.10.2012 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является:
	с 25.09.2012 Роспотребнадзор в рамках федерального государственного санитарно-эпидемиологического надзора и федерального государственного надзора в области защиты прав потребителей является:
	с 22.05.2012 руководство деятельностью Роспотребнадзора осуществляет Правительство РФ
	с 01.11.2011 правопреемником Роспотребнадзора в отношении обязательств в области аккредитации в установленной сфере деятельности, в т.ч. обязательств, возникших в результате исполнения судебных решений, является Росаккредитация
	с 26. 12.2009 по 15.05.2018 Роспотребнадзор был уполномочен принимать решение о нежелательности пребывания (проживания) иностранного гражданина или лица без гражданства в РФ. Роспотребнадзором в соответствии с полномочиями по вопросам соблюдения санитарно-эпидемиологических требований к пищевым продуктам, продовольственному сырью, а также к контактирующим с ними материалам и изделиям (требований к безопасности) в целях защиты жизни и здоровья человека осуществляется нормативно-правовое регулирование в сфере контроля за качеством и безопасностью пищевых продуктов и организацию такого контроля
	1) осуществляет федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор на территориях зон защитных мероприятий; 2) участвует в подготовке санитарно-эпидемиологических требований в отношении зон защитных мероприятий; 3) утверждает гигиенические нормативы по предельно допустимым концентрациям и уровням воздействия вредных химических и биологических факторов на среду обитания; 4) организует ведение социально-гигиенического мониторинга на объектах по хранению и уничтожению химического оружия; 5) обеспечивает в пределах своей компетенции проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы проектной документации на соответствие санитарным правилам, нормам и гигиеническим нормативам
	с 18. 07.2006 Роспотребнадзор осуществляет государственное регулирование безопасности при использовании атомной энергии
	осуществляет контроль за реализацией государственной политики в области обеспечения биологической и химической безопасности РФ с целью охраны здоровья и обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения; в установленном законодательством РФ порядке размещает заказы и заключает государственные контракты, а также иные гражданско-правовые договоры на поставки товаров и проведение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ для государственных нужд в области обеспечения биологической и химической безопасности РФ; участвует в организации разработки национальных стандартов и технических регламентов, устанавливающих требования к биологической и химической безопасности объектов технического регулирования, и их внедрения; организует профилактику инфекционных заболеваний, вызываемых патогенами и паразитами, профессиональных заболеваний и неинфекционных заболеваний (отравлений) людей, вызываемых ксенобиотиками и суперэкотоксикантами; организует и проводит мониторинг опасных для человека природных биологических агентов и химических веществ, а также вызываемых ими заболеваний с целью прогнозирования биологических и химических опасностей на территории страны и принятия плановых и экстренных санитарно-противоэпидемических мер по обеспечению биологической и химической безопасности населения и окружающей среды; организует и координирует работы по санитарно-эпидемиологическому мониторингу зооантропонозов; организует работы по созданию и функционированию системы контроля за санитарно-эпидемиологическим состоянием объектов массового сосредоточения людей; организует оперативное реагирование на внезапный рост биологических и химических опасностей на отдельных территориях РФ, в том числе на вспышки инфекционных заболеваний и токсинных поражений, вызванных патогенами и токсинами природного и техногенного происхождения, с особым акцентом на выявление экзотических и неэндемичных для территории РФ патогенов; проводит работу по выявлению и установлению причин и условий возникновения и распространения инфекционных, паразитарных и профессиональных заболеваний, а также массовых неинфекционных заболеваний (отравлений) людей путем проведения специальных санитарно-эпидемиологических расследований, установления по результатам социально-гигиенического мониторинга причинно-следственных связей между состоянием здоровья людей и средой их обитания; взаимодействует с заинтересованными федеральными органами исполнительной власти, органами исполнительной власти субъектов РФ и органами местного самоуправления в области обеспечения биологической и химической безопасности РФ с целью достижения необходимого уровня санитарно-эпидемиологического благополучия населения; в установленном порядке взаимодействует с органами государственной власти иностранных государств и международными организациями в области обеспечения биологической и химической безопасности; организует работу по гигиеническому воспитанию населения и обучению специалистов, чья деятельность связана с производством, хранением, транспортировкой и реализацией продукции (в том числе питьевая вода и пищевые продукты), требования к биологической и химической безопасности которой устанавливаются техническими регламентами и национальными стандартами РФ
	с 12. 03.2004 образована Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия (Роспотребнадзор). В ведение Роспотребнадзору переданы функции по контролю и надзору: — в сфере санитарно-эпидемиологического надзора упраздненного Минздрава России;

правильное питание во время пандемии

Фрукты

Фрукты могут быть свежими, замороженными или консервированными. Свежие хранятся меньше всего, поэтому на длительные сроки стоит делать выбор в пользу замороженных или консервированных. Выбирая консервированные фрукты, старайтесь стремиться к вариантам в собственном фруктовом соку (не в сиропе). Замороженные фрукты (как и ягоды) отлично подходят для изготовления напитков (например, киселей и компотов) и употребления в качестве десертов. Консервированные фрукты хранятся на полке до двух лет, а замороженные — не портятся до девяти месяцев.

Овощи

Как и фрукты, овощи могут быть замороженные, свежие или консервированные. Замороженные овощи являются отличной альтернативой свежим, так как они сохраняют много пищевых веществ. Однако консервирование тоже может быть отличным выбором. При поиске овощных консервов ищите варианты с меньшим количеством соли и натрия. 

Белковые продукты

Следующий пункт – белок и белковые продукты. Когда мы думаем о протеине, то представляем свежую куриную грудку или кусок мяса. Но есть много других способов включить белок в нашу диету. Консервированное и замороженное мясо – это вариант. 

Если вы ищете растительный белок, то выбирайте орехи, семена и бобы. Одна чашка черной фасоли содержит около 15 граммов белка. Арахисовое масло, например, хранится до трех месяцев и содержит около шести граммов белка на порцию.

Зерновые

Зерновые могут довольно долго храниться у вас на полках.

 Срок хранения пшеницы или бурого риса немного меньше, чем у муки, но они имеют более высокую пищевую ценность. «Обработанные» зерновые (такие как белый хлеб и макароны) имеют меньше пищевых веществ и клетчатки в своем составе. Однако «необработанные» зерновые (такие как овес или гречка) хранятся дольше, чем обработанные.

Молочная продукция

Когда мы думаем о молочных продуктах, то представляем молоко, сыр или йогурт. Но это все скоропортящиеся продукты. На самом деле есть способы продлить срок службы некоторых из них. Например, можно заморозить йогурты и съесть их как прохладное освежающее лакомство. 

В рационе стоит уменьшить количество молочных продуктов, которые содержат большое количество жиров (например, плавленых сыров). Эти продукты не обеспечат вас кальцием и витамином D, но добавят вам килограммов.

Важно вести здоровый образ жизни в это непростое время. Сделайте это весело – приготовьте еду по интересным рецептам, попробуйте что-то новое и будьте здоровы! 

www. здоровое-питание.рф

для кого вакцина от гриппа в Кузбассе будет обязательной // Администрация Междуреченского городского округа

В Кемеровской области стартовала прививочная кампания по гриппу. В этом году планируется вакцинировать 1 млн.  6 тыс. жителей. На каждой территории должны привить не менее 60% всего населения. Об этом сообщили специалисты управления Роспотребнадзора Кузбасса.

Кроме того, на сайте ведомства отметили, что против гриппа должны быть обязательно вакцинированы следующие категории:

• дети с 6 месяцев до 6 лет;
• школьники;
• учащиеся средних профессиональных образовательных учреждений;
• студенты вузов;
• медицинские работники;
• работники учреждений образования;
• лица старше 60 лет;
• работники общественного транспорта;
• работники коммунальной сферы;
• лица, страдающие хроническими заболеваниями, в том числе сердечно-сосудистой, дыхательной, мочевыводящей систем, метаболическими нарушениями и ожирением;
• беременные женщины;
• лица, подлежащие призыву на военную службу.

Всем перечисленным прививку поставят бесплатно в медорганизациях по месту жительства или работы. Детей будут вакцинировать в детсадах, учебных заведениях, а также в поликлинике по прикреплению.

«Вакцинопрофилактика является самым эффективным средством индивидуальной и массовой профилактики гриппа. Эффективность противогриппозных вакцин клинически доказана. Вирусы гриппа постоянно меняются, обычно в каждый следующий сезон гриппа появляются новые виды вируса, поэтому прививаться необходимо ежегодно», — говорится на официальном сайте ведомства.

Также отмечается, что противогриппозные вакцины не вызывают заболевания гриппом. Кроме того, они безопасны и хорошо переносятся человеком.

Управлением Роспотребнадзора по Кемеровской области в рамках Всероссийской горячей линии с 7 сентября по 12 октября проводится консультирование населения по вопросам профилактики гриппа и ОРВИ.+

Внимание! Телефоны горячей линии: (83842)366846, (83842)367856, (83842)641150, (83842)646781, (83842)646782, 8-800-555-4943.

Областной НМИЦ по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней ПФО — ННИИЭМ

Главная »Структура» Региональный центр мониторинга возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний версии VFDPrint

Областной научно-методический центр мониторинга возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности ПФО создан на базе Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.И. Блохиной и утвержден приказом. Роспотребнадзора от 01.12.2017. № 1116.

Руководитель центра — д.м.н., профессор, Заслуженный врач РФ Евгений Иванович

Ефимоф , директор НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блоха «Роспотребнадзор.

»

Центр создан для содействия профилактике и снижению заболеваемости инфекционными заболеваниями путем улучшения санитарно-эпидемиологического надзора.

Целью Центра является научное, методическое и практическое обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации по инфекционным заболеваниям.

Задачи и функции центра:

1. Оказание консультативно-методической помощи в плановом порядке и по эпидемиологическим показаниям органам и организациям Роспотребнадзора, организациям здравоохранения в организации и проведении бактериологических, вирусологических, серологических, молекулярно-генетических исследований с целью установления этиологических факторов инфекционных и паразитарных заболеваний. , эпидемиологическое расследование, организация и проведение противоэпидемических мероприятий.
2. Внедрение новых методов и средств лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных заболеваний в практику лабораторных служб субъектов Приволжского федерального округа.
3. Участие в оценке санитарно-эпидемиологической ситуации.
4. Формирование прогнозов инфекционной заболеваемости.
5. Разработка и выполнение научно-исследовательских работ и программ с привлечением специалистов органов и организаций Роспотребнадзора, медицинских организаций закрепленных субъектов Приволжского федерального округа.
6. Повышение квалификации специалистов, проведение семинаров и стажировок на рабочем месте для специалистов органов и организаций Федеральной службы по здравоохранению и защите прав потребителей, медицинских организаций Приволжского федерального округа (по согласованию).
7. Подготовка предложений по совершенствованию лабораторной диагностики, мониторинга и эпидемиологического надзора за инфекционными и паразитарными заболеваниями в субъектах ПФО.
8. Внесение предложений в территориальные органы и организации Федеральной службы по здравоохранению и социальной защите по Приволжскому федеральному округу по совершенствованию профилактики текущих инфекционных и паразитарных заболеваний, в том числе региональных планов и программ, организации лабораторных работ, методов и средств диагностики , мониторинг циркуляции патогенных микроорганизмов, разработка рекомендаций по оптимизации эпидемиологического надзора и проводимых санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий.

Права научно-методического центра:

1. Запрашивать и получать информацию от органов и организаций Роспотребнадзора субъектов Приволжского федерального округа, Федерального центра гигиены и эпидемиологии и справочных центров, органов местного самоуправления в области здравоохранения субъектов Российской Федерации в г. Приволжского федерального округа о заболеваемости инфекционными и паразитарными заболеваниями, структуре возбудителей, состоянии объектов окружающей среды и их микробиологической характеристике и другой информации, касающейся инфекционных заболеваний, а также культуре патогенных овино-патогенных микроорганизмов и образцах биологических материалов. для мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний.
2. Предложение по совершенствованию организации лабораторных служб, методов и средств диагностики, организации мониторинга циркуляции патогенных микроорганизмов, подготовки рекомендаций по оптимизации эпидемиологического надзора и проводимых санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий.

Телефон: +7 (831) 4-69-79-01; +7 (831) 4-69-79-59

Е-mail: [email protected]

В топ

Связь между структурой штаммов вируса клещевого энцефалита и их патогенными свойствами

Цитирование: Беликов С.И., Кондратов И.Г., Потапова Ю.В., Леонова Г.Н. (2014) Связь между структурой вируса клещевого энцефалита Штаммы и их патогенные свойства.PLoS ONE 9 (4): e94946. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946

Редактор: Ульрике Гертруд Мундерлох, Университет Миннесоты, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 2 декабря 2013 г .; Одобрена: 20 марта 2014 г .; Опубликован: 16 апреля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Belikov et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа поддержана проектом МНТЦ № 4006, проектами междисциплинарной интеграции Сибирского отделения РАН № 63 и 141 и государственным контрактом № П389. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) — одна из самых опасных нейровирусных инфекций у людей; передача происходит через укусы клещей.Ареалы его распространения находятся в лесных зонах многих европейских стран, а также на севере Японии, Китая и Монголии. В России природные очаги инфекции распространены от Калининградской области на западе до острова Сахалин на востоке [1]. В период 1973–2003 гг. В Европе произошло 400% -ное увеличение заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ) [2], [3]. В 1990-е годы, когда уровень заболеваемости был высоким, КЭ был причиной как минимум 11 000 случаев заболевания в России и примерно 3 000 случаев в остальной Европе [4], [5], [6], [7]. В 2000-е годы заболеваемость КЭ постепенно снизилась; согласно официальной статистике, в 2009 году в России было зарегистрировано всего 1088 случаев (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (http://rospotrebnadzor.ru/documents/10156/a0a5f062-7498-4af7-b3f6-0a0d7d302c05).

ВКЭ является представителем вируса рода Flavivirus семейства Flaviviridae. Этот род включает около 80 видов, многие из которых являются патогенными для человека, например вирус Западного Нила, денге, желтая лихорадка, японский энцефалит и т. Д.[8]. Международная классификация флавивирусов делит ВКЭ на дальневосточный (FE), сибирский (SIB) и (западно) европейский (WE) подтипы [9]. Они были названы в соответствии с их преобладающим распространением в Евразии [4], [5], [10], [11], [12].

Клиническое течение КЭ на Дальнем Востоке признано более тяжелым, чем в других регионах Евразии [13]. Доминирующая энцефалитная форма заболевания отличается крайней степенью тяжести и летальностью. Основной характеристикой КЭ КЭ является быстрое проявление общих поражений центральной нервной системы, вызывающих очаговый или диффузный менингоэнцефалит с поражением ствола головного и спинного мозга.До 1990-х годов смертность иногда достигала 30% [14]. С тех пор сообщалось, что трансформация клинических проявлений инфекции на Дальнем Востоке снизила смертность до 13% и увеличила долю нефокальных форм КЭ [13]. Вероятно, это связано с появлением и распространением в ареале новых вариантов ВКЭ с мутациями, вызывающими субклинические формы заболевания [15].

Точная генетическая основа этих различий в форме и тяжести заболевания неясна.Ранее степень тяжести переменной была связана с подтипом вируса [16]. Позже выяснилось, что прямой связи между подтипом ВКЭ и тяжестью заболевания нет. Несоответствие подтипа вируса тяжести клинических проявлений заболевания особенно наблюдается на Дальнем Востоке России, где преобладает подтип FE при отсутствии SIB и WE TBEV. Однако здесь регистрируются разные формы заболевания: от энцефалических форм, часто приводящих к летальному исходу, до асимптотических и субклинических форм [13]. Ранее многими исследователями было показано, что патогенные маркеры флавивирусов локализуются в гене белка оболочки E [17], [18], [19], [20]. Кроме того, мутации, расположенные в других частях вирусного генома, могут изменить патогенность вируса [21].

Как правило, с целью определения вирулентности и патогенности вирусных штаммов изучается их нейроинвазивность и нейровирулентность у мышей или изменения ростовых характеристик клеточной культуры. Однако нет четкой корреляции между вирулентностью штаммов у мышей и патогенностью штаммов у людей [22], [23], [24], [25].Следовательно, это требует определения и анализа полных нуклеотидных последовательностей штаммов, выделенных от пациентов с различной степенью тяжести заболевания, для обнаружения мутаций в геноме ВКЭ, которые влияют на патогенность штаммов у людей. Сравнение полных геномов может позволить определить ранее неизвестные участки генома, которые могут быть коррелированы с патогенезом.

В наших предыдущих исследованиях мы сравнили геномы нескольких штаммов, выделенных от пациентов с субклиническими формами заболевания, и указали на специфические мутации в штаммах с разной патогенностью [15]. Тем не менее, необходимо проанализировать больше штаммов, чтобы повысить надежность этих результатов и исключить единичные спонтанные мутации, возникшие в процессе эволюции вируса. В этой работе мы проанализировали 34 полных генома штаммов FE-TBEV, которые вызывали заболевание различной степени тяжести у людей. В анализ включены полные геномы 11 патогенных штаммов человека, выделенных от пациентов с энцефалитической формой заболевания (Efd), 19 штаммов от пациентов с субклинической формой заболевания (Sfd), 4 штаммов Ffd с промежуточными характеристиками, вызывающими лихорадку. по сравнению с ранее опубликованными геномами штаммов Efd Sofjin, Glubinnoe и Senzhang, а также штамма с низкой вирулентностью Oshima 5-10, выделенного в Японии.Мы исследовали мутации в различных группах штаммов Efd и Sfd человека и попытались описать влияние индивидуальных аминокислотных замен в белках вируса на изменчивость патогенности штаммов TBEV.

Результаты

Сравнение нуклеотидных последовательностей

Длина нуклеотидных последовательностей геномов варьировала от 10 405 до 11 103 нуклеотидов (консервативная область содержала 10 376 нуклеотидов, а различия были обусловлены переменной длиной 3 ‘нетранслируемой области (UTR)). Более того, 8131 положение было постоянным во всех проанализированных штаммах ВКЭ. Мутации чаще всего располагались в позиции третьего кодона и обнаруживались в 2245 позициях генома (21,6%). Выровненные последовательности геномов, 3′-UTR и полипротеинов не показаны, но могут быть предоставлены по запросу. На рисунке S1 схематично представлены выровненные последовательности 3 ‘UTR. Сравнение полного генома и аминокислотных последовательностей отдельных вирусных белков из всех секвенированных образцов и ранее зарегистрированных штаммов с определенными типами патогенности для человека дается в форме матрицы (рисунок S2).Понятно, что полные геномы штаммов несколько различались, и не было четкой границы между штаммами Efd и Sfd. Мутации, определяющие патогенность штаммов, было трудно идентифицировать на фоне случайных замен нуклеотидов.

Филогенетический анализ.

Мы использовали оценку максимального правдоподобия для анализа дискретных данных, чтобы выполнить филогенетический анализ полных секвенированных геномов по сравнению с ранее сообщенными геномными последовательностями подтипа FE и прототипа подтипа SIB (Васильченко) и WE (Neudoerfl) TBEV (рисунок 1). Анализ показывает, что все секвенированные штаммы относятся к подтипу вируса FE и явно отличаются от штаммов подтипов SIB и WE.

Рис. 1. Филогенетическое дерево ML штаммов ВКЭ.

Дерево основано на полных геномах штаммов, вызывающих заболевания разной степени тяжести. Патогенные штаммы Efd показаны черным цветом, штаммы Sfd — зеленым, а штаммы с лихорадочной формой TBEV — красным. Штаммы-прототипы показаны синим цветом.Числа над или под ветвями указывают вероятности апостериорных узлов и значения начальной загрузки из анализа NJ.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g001

Патогенные штаммы Efd делятся на две ветви, что может быть связано с географической изоляцией ареалов видообразования предковых форм вируса. Действительно, штаммы кластера II включают штаммы, родственные штамму Sofjin, выделенному в России, Приморье, а штаммы кластера III включают штаммы, родственные штамму Senzhang, изолированному в северном Китае.Штаммы Sfd образуют отдельный кластер (I), но имеют общего предка со штаммами кластера II. Мы не обнаружили, что штаммы Sfd имеют общего предка со штаммами кластера III. Штаммы ВКЭ (Fdf), вызывающие лихорадочное заболевание, не образовывали особого отдельного кластера, за исключением штамма Шкотово-94, который составлял отдельную ветвь. Три других штамма, а именно Кипарис-94, Приморье-89 и Приморье-52, вызывают фебрильную болезнь и находятся в кластерах II и I. Аномальное расположение этих штаммов будет обсуждаться позже в разделе «Исключения».

Предсказание вторичных структур геномных 5 ‘и 3’ нетранслируемых областей и возможных мотивов образования РНК.

Геномная 5′-нетранслируемая область является консервативной и содержит 131 нуклеотид. Ни одна из позиций не коррелировала с изменениями патогенности штамма, и единичные мутации в основном обнаруживались у патогенных штаммов в левой части фрагмента (рис. 2). Другими словами, мы не обнаружили положения, в котором замены достоверно различались между штаммами Efd и Sfd, но были одинаковыми в этих группах.Предсказанная структура 5′-UTR штамма Sofjin состоит из трех петель ствола: большая петля ствола (SLA), вторая петля короткого ствола (SLB) и третья петля ствола (SLC) со стартовым кодоном AUG для трансляции как части стержня (Рисунок S3). Предыдущие исследования показали, что область SLA вируса денге является промотором, который распознается вирусной РНК-полимеразой RdRp [26]. Несмотря на некоторые незначительные различия в конформации 2D структур, мы не смогли выявить какой-либо корреляции между особенностями конформации РНК и патогенностью штамма.

Рисунок 2. Выровненные нуклеотидные последовательности 5′-UTR.

Патогенные штаммы Efd показаны черным, штаммы Sfd зеленым, а штаммы с лихорадочной формой ВКЭ показаны красным. Штаммы-прототипы показаны синим цветом. Нуклеотиды, идентичные последовательности штамма Sofjin, обозначены точками соответствующего цвета.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g002

Геномная 3′-UTR неоднородна по длине: от 31 до 728 нуклеотидов в разных штаммах, в зависимости от длины делеций (рисунок S1).Хотя о такой гетерогенности 3′-UTR сообщалось ранее [27], мы впервые описали варианты TBEV с обширными делециями, покрывающими почти всю 3′-UTR. Только патогенный штамм «Светлогорье» имел полноразмерный 3 ‘НТО. Штаммы Sfd Приморье-69, Приморье-202, Приморье-18 и штамм Осима 5-10 имели делецию трех нуклеотидов в положениях с 185 по 187 и одного нуклеотида в положении 399. Кроме того, патогенный штамм Приморье-87 имел делецию две делеции, при этом три нуклеотида удалены из положений 185–187, и три — из положений 235–237.Другие проанализированные штаммы имели более обширные делеции в 3 ‘UTR; их положение и длина различаются в зависимости от деформации (Рисунок S1). Характерной особенностью 3’-UTR флавивирусов, передаваемых клещами, является делеция ∼220 нуклеотидов от -325 до -545 п.н., обнаруженная во многих штаммах ВКЭ. Например, данная делеция ранее была обнаружена у штаммов подтипа FE, выделенных в Китае (MDJ01 (JQ650522), MDJ-02 (JF316708), MDJ-03 (JF316708)), штаммов подтипа SIB (Заусаев (AF527415) и 178-79 (EF469661)) и подтипа WE HYPR (U39292).В то же время мы показали, что положение и размер этой делеции не сохраняются, но варьируются в разных штаммах (Рисунок S1). Таким образом, делеция расположена ближе к стоп-кодону у штаммов Sofjin, Kavalerovo и Glubinnoe (рисунок S1).

Первые вариантные штаммы, описанные с самой длинной делецией 3′-UTR из 697 нуклеотидов, охватывающей область от 9 до 705 п.н. (Рисунок S1), являются наиболее необычными. Эти штаммы содержат 9 нуклеотидов около стоп-кодона и 21 нуклеотид в концевой части 3′-UTR.Более того, точная последовательность 21-членного концевого фрагмента неизвестна, но ее можно определить по структуре праймера, используемого для амплификации РНК. Эта самая длинная делеция наблюдалась у шести штаммов Sfd: Приморье-208, Приморье-274, Приморье-828, Приморье-823 и Приморье-345, а также у двух штаммов Efd Приморье-52 и Приморье-739, расположенных в кластере патогенных штаммов. в филогенетическом дереве, которое вызвало субклиническое заболевание (рис. 1). Это предполагает, что самая длинная делеция в 3 ‘UTR может резко снизить патогенность.

Большинство штаммов, за исключением штаммов с обширными делециями, и двух штаммов, Спасск-72 и Приморье-437, лишенных концевой части, но с относительно протяженной 3′-UTR, имеют консервативные концевые части длиной 327 нуклеотидов. Эта консервативная область содержит ряд мутаций, которые не коррелируют с патогенностью штаммов, и мутаций -C245T и -A302G, которые различаются между группами штаммов с разной патогенностью.

Предсказанная 2D структура 3 ‘UTR состоит из нескольких петель.Крайняя петля в диапазоне от -1 до -85 нуклеотидов (CR1) консервативна во всех штаммах. На рисунке S4 показан пример предсказанных 2D структур концевой части 3 ‘UTR для штамма Sfd Primorye-320 и патогенного штамма Svetlogorie. Очевидно, топология петель кардинально не отличается. Более того, мы показываем, что мутации -C245T и -A302G, которые различаются по группам штаммов с разной патогенностью, расположены вне стеблей и, вероятно, являются случайными и не влияют на патогенность штаммов.

Циклизация 5 ‘UTR и 3’ UTR раскрывает SLB в 5 ‘NTR (Рисунок S5) и часть петли (CR1) в 3’ UTR, чтобы сформировать новый расширенный двухцепочечный фрагмент (Рисунок S5), известный как область AUG выше по течению (5 ‘UAR) [28]. Этот фрагмент расположен перед стартовым кодоном AUG и необходим для репликации вирусной РНК [28], [29], [30], [31].

В отличие от флавивирусов, переносимых комарами, стартовый кодон расположен в SLC, который не участвует в образовании 5′-UAR и остается неизменным.Положения 109–128 5′-UTR были полностью консервативными во всех проанализированных штаммах, без нуклеотидных замен (рис. 2). Положения 3′-UTR от -64 до -84 также были консервативными во всех штаммах, независимо от их патогенности, за исключением штаммов, содержащих обширные делеции (рисунок S1).

Тем не менее штамм Спасск-72 сохранил патогенные свойства, несмотря на отсутствие мотивов циклизации.

Сравнение белков в группах штаммов ВКЭ

Аминокислотные последовательности полипротеинов более консервативны, чем нуклеотидные последовательности генома.Таким образом, наблюдаемая группа штаммов имела только 198 положений (<6,4%) с заменой по крайней мере одного аминокислотного остатка. Полипротеины патогенных штаммов TBEV (Efd) имели длину 3414 а.о., но штаммы Sfd имели делеции одной аминокислоты в положении 111 капсидного белка.

Поскольку большинство аминокислотных остатков в полипротеинах являются постоянными, для удобства мы удалили консервативные аминокислотные остатки из анализа и сохранили только те положения, в которых мы наблюдали хотя бы одну аминокислотную замену (Рисунок S6).Очевидно, что многие одиночные аминокислотные замены хаотично распределены по полипротеину. Однако существуют также замены аминокислотных остатков, специфичных для групп Efd и Sfd этих штаммов вирусов.

В таблице 1 представлены 17 ключевых аминокислот, замены которых коррелируют с изменениями патогенности штаммов. В этот список включены только те аминокислоты, которые достоверно различаются в группах штаммов с различной патогенностью для человека. Из таблицы видно, что большинство замен аминокислотных остатков однозначно определяют положение штаммов в группах с переменной патогенностью, за исключением нескольких случайных замен в штаммах Sofjin, Primorje-89, Primorye-94 и Kiparis-94.Штаммы Шкотово-94, Осима и Приморье-69, расположенные на границе раздела между штаммами Efd и Sfd, имели неполный набор замен ключевых аминокислот. В 8 из 10 белков ВКЭ мы обнаружили замены ключевых аминокислот; они не были обнаружены в неструктурных белках NS2A и NS4A. Замены в двух последних белках не коррелировали с изменениями патогенности штаммов.

Обсуждение

Мы секвенировали и проанализировали нуклеотидные последовательности полных геномов 34 штаммов FE TBEV, выделенных от пациентов с различной степенью тяжести заболевания.Подтип FE TBEV был выбран потому, что его штаммы обычно вызывают тяжелые заболевания у людей, что позволило нам собрать достаточное количество штаммов с диаметрально противоположной патогенностью у людей [13].

Тяжесть ВКЭ может зависеть как от характеристик человека-хозяина и состояния его иммунной системы, так и от специфики генома ВКЭ. В этом отчете мы не рассматривали состояние иммунной системы пациентов, место укуса клеща, время воздействия и другие факторы, которые могут повлиять на тяжесть заболевания, а вместо этого сосредоточились на особенностях генома Штаммы ВКЭ, выделенные от пациентов с различной степенью тяжести заболевания.Ранее мы предположили, что специфические мутации генома ВКЭ, приводящие к заменам аминокислот, могут определять различия в тяжести заболевания [25]. Это исследование подтверждает эту гипотезу, исследуя большее количество штаммов ВКЭ. Наше исследование было направлено на поиск взаимосвязи между мутациями, обнаруженными в полных геномах штаммов, и различиями в патогенности штаммов у людей.

Есть несколько причин для анализа полных геномов большого числа близкородственных штаммов ВКЭ.Спонтанные случайные одиночные мутации могут включаться в вирусную РНК во время репликации РНК-зависимыми РНК-полимеразами и не могут быть исправлены, поскольку RdRp не обладает 3′-экзонуклеазной активностью. Число таких мутаций должно увеличиваться с увеличением числа пассажей, если исключить возможность элиминации мутантных вариантов вирусной РНК при последующих пассажах в другом организме того же вида. Есть опасения, что продолжительные пассажи ВКЭ у грудных мышей могли привести к вирусной адаптации у мышей и вызвать некоторые мутации, которые не присутствовали в вирусах, выделенных из клеток человека [32].Этот дрейф не имел значительного эффекта в настоящем исследовании, поскольку мы исследовали множество штаммов и не принимали во внимание случайные одиночные мутации; более того, мы рассмотрели только существенные различия между двумя группами штаммов, вызывающих заболевание разной степени тяжести. Если специфическая замена может быть вызвана во время адаптации хозяина, логично предположить, что она не будет отличаться в двух группах штаммов Efd и Sfd, и мы не учитывали их в нашем анализе. Возможен и другой вариант, когда конкретная замена происходит в одной группе штаммов.Мы не можем идентифицировать такое изменение с помощью настоящего анализа, поэтому его можно принять за ключевую мутацию, которая влияет на патогенность штаммов. Дальнейшие исследования могли бы решить этот вопрос, используя обратную генетику, получая инфекционные клоны кДНК, вводя точечные мутации и оценивая нейровирулентность у обезьян для выявления ошибок.

Во-вторых, анализ штаммов только одного, а не нескольких подтипов исключает мутации, приобретенные штаммами разных подтипов в течение длительного периода эволюции, что может значительно усложнить анализ.Например, штамм Sofjin подтипа FE TBEV отличается от штамма Васильченко подтипа SIB 1486 мутациями в кодирующем белок домене, приводящими к 174 аминокислотным заменам. Количество доступных штаммов SIB значительно ниже, чем количество замен; следовательно, невозможно идентифицировать те замены, которые влияют на патогенность вируса.

Нейропатогенный потенциал ВКЭ включает два различных свойства вируса, т.е.е. нейроинвазивность и нейровирулентность [33]. В этом отчете мы будем использовать общее понятие «патогенность человека», основанное на различиях в степени тяжести заболевания. Следует отметить, что все проанализированные штаммы, независимо от патогенности человека, были нейроинвазивными и нейровирулентными у белых мышей [25].

В таблице 2 обобщены данные о времени и месте выделения штаммов, истории пассажа и тяжести клинических проявлений. На Рисунке S7 показана карта Приморья (Дальний Восток России) и места выделения штаммов.Очевидно, что большинство штаммов Sfd были изолированы вокруг Владивостока от людей, которые посещали лес с краткосрочными домашними целями или туризмом, а затем обращались в городские медицинские учреждения для профилактики и лечения клещевого энцефалита. Жители отдаленных районов обычно не обращаются за помощью на такие станции, а это значит, что у нас нет достоверных данных о циркулирующих в этих местах штаммах штаммов Sfd.

Анализ нуклеотидных последовательностей

Длина вирусной РНК анализируемых штаммов варьировала от 10 404 т.п.н. (Primorje-208) до 11 103 т.п.н. (Svetlogorie) в зависимости от размера делеции в 3′-NTR.На рисунке S2 показаны данные о сходстве аминокислотных и нуклеотидных последовательностей консервативных частей геномов. Очевидно, что нет четкой границы между штаммами вирусов, вызывающими разную степень тяжести заболевания. Значения синонимичных ( d _S ) и несинонимичных ( d _N ) скоростей замен, рассчитанные для полной кодирующей области генома с помощью codeml в пакете PAML [34], [35], были низкими. . Значения d _N / d _S (max) = 0.0615 и d _N / d _S (среднее) = 0,0416 указывает на отсутствие адаптивного отбора в анализируемой группе штаммов, что соответствует ранее опубликованным данным по другим флавивирусам [36], [37].

На филогенетическом дереве есть три четко видимых кластера (рис. 1). Кластер I в основном содержал штаммы Sfd и штамм Oshima, который был изолирован в Японии (его патогенность для человека не описана), тогда как кластеры II и III содержали патогенные штаммы Efd человека, включая прототип Sofjin [38], [39] и Senzhang [40], ранее выделенные на Дальнем Востоке России и Северо-Восточном Китае соответственно.Штаммы в кластерах II и I ВКЭ имеют общего предка, в то время как кластеры I штаммов Sfd являются более молодыми. Не было идентифицировано отдельной группы штаммов Ffd, способных вызывать фебрильную форму заболевания, за исключением штамма Шкотово-94, распределенного между II и I кластерами (рис. 1). Три других штамма, которые привели к лихорадке ВКЭ, относились либо к патогенным штаммам кластера II (Приморье-94), либо к штаммам Sfd кластера I (Кипарис-94 и Приморье-82). Особенности этих и некоторых других штаммов, положение которых в филогенетическом дереве не совпадало с тяжестью заболевания (Приморье-86, Приморье-90, Приморье-52 и Приморье-739), описаны в специальном разделе «Исключения».

Особенности последовательностей 5 ‘и 3’ UTR могут изменять патогенность ВКЭ [41], [42]. Участки генома, способные образовывать комплементарные комплексы между фрагментами 5 ‘UTR и 3’ UTR (так называемые домены циклизации), которые необходимы для репликации вирусной РНК, играют важную роль в репликации TBEV [26], [29] , [43], [44]. Фигуры S5 показывают, что вторичные структуры UTR штамма Efd Svetlogorie и штамма Sfd Primorye-18 оба имеют 3 ‘UTR полной длины. Понятно, что существенных отличий в конструкциях нет.Последовательности, образующие комплементарные комплексы между фрагментами 5′-UTR и 3’-UTR, сохраняются во всех штаммах, независимо от их патогенности. В последовательностях 3 ‘корового элемента проанализированных штаммов мы обнаружили несколько однонуклеотидных замен, три из которых (A426G, C483T и G532A / C) были разными у штаммов Efd и Sfd, но не влияют на двумерную упаковка 3 ‘UTR (Рисунок S4).

Таким образом, мутации, обнаруженные в последовательностях 5 ‘UTR и 3’ UTR штаммов Efd и Sfd, не коррелируют с патогенностью и, вероятно, являются случайными.Более того, мутации в 3 ‘UTR, включая те, которые различаются между штаммами Efd и Sfd, не влияют на патогенность и являются случайными. Однако возможно, что неидентифицированные специфические нуклеотидные последовательности в 3 ‘UTR могут влиять на положение и размер делеций, возникающих при передаче вируса от клещевых клеток к клеткам млекопитающих.

Одной из особенностей 3 ‘UTR в проанализированных штаммах является наличие протяженных делеций, которые различаются по положению и размеру у разных штаммов.Механизм возникновения этих делеций, их роль и значение для эволюции вирусной популяции неясны; следовательно, эта проблема требует детального обсуждения. Предыдущие исследования показали различную степень влияния искусственного введения протяженных делеций разной длины, начиная от стоп-кодона до корового элемента, на выживаемость и патогенность вирусных штаммов [45], [46].

Анализ наших данных также показывает, что расширенные делеции не оказывают значительного влияния на патогенность штамма и эффективность репликации вируса в клетках млекопитающих, если они не влияют на консервативную концевую часть 3 ‘UTR, составляющую приблизительно 325 нуклеотидов.Эта область 3 ‘UTR включает регуляторные элементы и последовательности, участвующие в циклизации вирусной РНК (рисунок S1). Если это предположение верно и наличие протяженных делеций в 3′-UTR не влияет на основной элемент и репликацию вируса, существование вариантов вируса с полноразмерной 3’-UTR в природе неясно, поскольку такие варианты должны быть удалены из вирусной популяции в течение нескольких циклов смены хозяина. Однако возможно, что это удаление не происходит, потому что удаляемый фрагмент генома в клетках млекопитающих важен для выживания TBEV в клетках клещей [10], [27], [47].

Известно, что

ВКЭ циркулирует в природе путем циклической передачи от клещей мелким млекопитающим с последующим возвращением к переносчику иксодовых клещей, где вирус распространяется и сохраняется в течение длительного периода. Этап выживания вируса в клетках млекопитающих необходим, но незначителен по времени [48], [49]. Фрагмент вирусного генома, удаленный в клетках млекопитающих, не может снова появиться в клетках клещей во время чередующихся циклов передачи вируса от клещей к млекопитающим и снова к клещам.Этот факт может указывать на то, что удаление фрагмента 3 ‘UTR не является количественным; следовательно, некоторая часть вирусной популяции в клетках млекопитающих имеет полноразмерную 3 ‘UTR. Возможно, только эта вирусная частица, содержащая полноразмерную РНК, может эффективно передаваться клещам, питающимся инфицированным животным. Варианты вируса, которые потеряли фрагмент 3 ‘UTR во время размножения в клетках млекопитающих, вероятно, не могут эффективно воспроизводиться в клетках клещей и, вероятно, не могут участвовать в циркуляции вируса в природе.

Исследования Labuda et al. подтвердите это предложение. Они показали, что ВКЭ наиболее эффективно передается от инфицированных клещей наивным клещам во время совместного кормления животным [50], [51]. Лабуда с соавторами показали, что виремия или систематическая инфекция не являются необходимыми для успешного переноса. Более того, они могут препятствовать передаче вируса. Наши предположения о структурно-опосредованном удалении 3′-UTR-фрагмента, затронутого неизвестными ферментами клеток млекопитающих, и невозможности передачи вирусных частиц с удаленным 3′-UTR-фрагментом в популяции клещей, хорошо согласуются с этими данными.Механизм удаления фрагмента и связь между размером и расположением делеций с нуклеотидными последовательностями фрагментов неизвестны. Возможно, что скорость удаления фрагмента 3 ‘UTR из вирусного генома зависит от типа клетки и минимальна в дендритных клетках, которые являются основными мишенями вируса [52]. Labuda et al. не изучали структуру 3 ‘UTR в своей работе по передаче вируса между клещами, питающимися совместно; поэтому было бы интересно повторить эти исследования с идентификацией делеций в 3 ‘UTR и возможного влияния делеций на передачу вируса в популяции клещей.

Конечный коровой элемент с высококонсервативными нуклеотидными последовательностями ранее был обнаружен во всех проанализированных штаммах TBEV. Этот консервативный сайт был указан во многих публикациях [27]. Весь основной элемент был предопределен для формирования четко определенной вторичной структуры в зависимости от последовательностей соседних вариабельных элементов генома [53]. Большинство проанализированных штаммов имеют концевой консервативный коровый элемент длиной около 325 нуклеотидов, за исключением трех штаммов Efd и шести Sfd, у которых отсутствует коровой элемент.Ранее Mandl et al. показали, что мутантные варианты вируса с делецией, покрывающей коровый элемент, нежизнеспособны [45]. В нашем исследовании выживаемость штаммов с удаленными коровыми элементами, по-видимому, определялась неполным (неколичественным) удалением фрагмента 3 ‘UTR. Такая смесь вариантов с полноразмерными и удаленными 3′-UTR способна выжить у позвоночных, но наш метод анализа последовательности 3’-UTR может не точно определять количество различных вариантов вируса.

Мы идентифицировали аналогичные штаммы с расширенной делецией в группе штаммов Sfd (Приморье-208, Приморье-274, Приморье-345, Приморье-437, Приморье-823 и Приморье-828) и в группе штаммов Efd (Приморье- 52 и Приморье-739). Последние два штамма вызывали субклиническую форму заболевания; следовательно, обширная делеция в 3 ‘UTR резко снижает патогенность штаммов у людей. Мы предполагаем, что обширная делеция в 3 ‘UTR в штаммах Primorye-739 и Primorye-52, вероятно, произошла на начальных стадиях инфекции у пациентов, что привело к снижению патогенности вируса и субклиническому течению заболевания. .

Штамм Спасск-72, который находится в кластере патогенных штаммов и имеет необычную протяженную делецию в 3′-UTR, включая основной элемент, был изолирован от пациента со смертельным энцефалитом. Это может быть связано с содержанием в организме человека значительного количества вариантов вируса с полноразмерной 3 ‘UTR, чего мы не наблюдали.

К сожалению, наш метод секвенирования генома не подходит для количественного определения соотношения полноразмерных и удаленных вариантов вируса; следовательно, необходимо разработать новый подход к анализу вариабельности 3 ‘UTR во время передачи TBEV от клещей к различным клеткам млекопитающих.Возможно, что недавно описанный подход, основанный на использовании реакции клонирования с удлинением кольцевой полимеразы (CPEC), может быть адаптирован [54].

Анализ аминокислотных последовательностей

Цикл репликации вируса включает несколько стадий, то есть прикрепление вируса к поверхности клетки-мишени, репликацию РНК, а также синтез и процессинг вирусного белка и сборку вирусных частиц [55].

Аминокислотные замены в различных частях полипротеина могут влиять на разные стадии репликации вируса и патогенность штамма, но точные механизмы этого влияния неизвестны.Роль каждой аминокислоты также неясна. Большинство аминокислотных замен, обнаруженных в вирусной популяции, могут быть случайными и (или) определяться адаптацией вируса к различным средам, что означает, что они не могут повлиять на патогенность штаммов. Мы обнаружили 198 позиций с заменами аминокислот в полипротеине длиной 3414 а.о. (Рисунок S6). Замены в большинстве положений были специфичными для небольших групп штаммов, которые характеризуют эволюцию вирусной популяции, а не коррелируют с изменениями вирулентности штаммов.Однако 17 аминокислотных замен различались между группами штаммов Efd и Sfd (таблица 1). Таблица 1 показывает, что как структурные, так и неструктурные белки имели специфические аминокислотные замены, а Фиг.3 показывает положение конкретных ключевых аминокислотных замен в полипротеине.

Рисунок 3. Третичная структура протеазы NS3.

Кристаллическая структура протеазы Западного Нила (код PDB 3e90) была взята в качестве шаблона для моделирования гомологии. (A) Третичная структура NS3 / NS2B для патогенного штамма Дальнегорск.(B) Третичная структура NS3 / NS2B для штамма Sfd Приморье-270. Стрелки указывают замену ключевых аминокислот. Активный центр обозначен прямоугольником, а его аминокислотные остатки показаны красными атомами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g003

Ниже более подробно описаны функция каждого белка и возможная роль ключевых аминокислотных замен.

Вирусные частицы всех флавивирусов имеют нуклеокапсид, окруженный двухслойной липидной мембраной, внутри которой находятся два фиксированных структурных белка, поверхностный белок E (приблизительно 54 кДа) и мембранный белок-предшественник prM (приблизительно 27 кДа) [8 ].

Отщепление капсидного белка от полипротеина происходит в два этапа:

— На первой стадии расщепление C-prM сигналами хозяина образует мембраносвязанный протеин C с сигнальным пептидом (C _int ).

— Вторая стадия — это расщепление мембраносвязанной формы протеина C _int вирусной протеазой, комплексом NS2A / NS3, с образованием зрелого капсидного протеина [56]. Однако предыдущее исследование показало, что расщепление связи C-prM происходит неэффективно в отсутствие вирусной протеазы и первоначально отщепляет сигнальный пептид от C _int [57].

Несмотря на эти разные гипотезы, эффективная сборка вирусных частиц требует строгого баланса каталитической активности двух протеаз, то есть сигналазы и вирусной протеазы [58]. Нуклеокапсид способен интегрироваться в почку, образованную поверхностными белками prM и E в мембране эндоплазматического ретикулума. При накоплении 180 prM и белков E эта почка отделяется от родительской мембраны, и незрелая вирусная частица транспортируется из клетки через сеть транс-Гольджи.В отсутствие нуклеокапсида белки prM и E с частью мембраны могут эффективно формировать небольшие бескапсидные субвирусные частицы (SVP) [59]. Недавние исследования ВКЭ показали, что введение определенных делеций и аминокислотных замен в протеин C нарушает сборку инфекционных частиц, что приводит к образованию многих неинфекционных субвирусных частиц [53], [60], [61].

Структурный белок C изучаемых штаммов является наиболее нестабильным, т.е. он имеет три ключевые аминокислотные замены и делецию одной аминокислоты в позиции 111 у штаммов Sfd с длиной белка 116 а.о., в отличие от штаммов Efd, которые несут в этом положении аминокислотные остатки Leu, Val, Met или Ile (Таблица 1).Эта делеция расположена в сигнальном пептиде, рядом с сайтом расщепления сигналазой. Кроме того, сигнальный пептид содержит замену D100N в трансмембранном домене. Обе эти замены могут определять положение и эффективность процессинга (т.е. они содержатся в сайте расщепления сигнального пептида). Расчет наиболее вероятных сайтов расщепления показал, что делеция аминокислоты не изменяет положение сайта расщепления сигнальной C-prM, но может влиять на скорость процессинга, поскольку рассчитанное вероятное расщепление в штаммах Sfd значительно ниже, чем в патогенных. штаммы (Рисунок S8).Наиболее значительное снижение значений оценки сайта расщепления наблюдалось для гипотетического варианта, имеющего делецию в положении 111, но не содержащего компенсаторной замены D100N (Таблица S1).

Кроме того, мы наблюдали две специфические замены (Q32R и K69R) в капсидном белке штаммов Sfd, которые могут влиять на плотность упаковки капсидного белка (рис. S9), но вряд ли они окажут значительное влияние на патогенность штаммов. Другая замена, K64N, которая была обнаружена не только во всех штаммах Sfd, но и в шести штаммах кластера III на филогенетическом дереве, также может считаться не влияющей на патогенность штамма.

Другие структурные белки prM и E оба содержат специфические замены (A151V и V463A, соответственно), которые расположены в трансмембранных доменах и различаются между штаммами Efd и Sfd (Таблица 1). Эти аминокислотные замены консервативны и не оказывают значительного влияния на конформацию белков (рис. S10) или патогенность штаммов. Единичные случайные замены в белке prM находятся вне участков процессинга белка фурином; следовательно, они не важны для функции белка.В протеине E мы также обнаружили единичные консервативные аминокислотные замены и замены в четырех небольших группах штаммов Efd и Sfd (Рисунок S6). Эти замены могут влиять на иммуногенные свойства вируса, но они не коррелируют с патогенностью штаммов.

Таким образом, только один белок из группы структурных белков имел аминокислотные замены, которые коррелировали с группами Efd и Sfd и могли влиять на патогенность штаммов. Замены в трансмембранном домене капсидного белка могут влиять на патогенность штамма на стадии почкования за счет образования бескапсидных субвирусных частиц.Структурные белки prM и E не имели замен, которые могли повлиять на патогенность анализируемых штаммов; следовательно, прикрепление вирусных частиц к клеткам или проникновение вируса в клетки, вероятно, не будет существенно влиять на патогенность вирусных штаммов.

Неструктурный белок NS1 представляет собой высококонсервативный гликопротеин с 12 инвариантными остатками цистеина. В отличие от других неструктурных белков, NS1 секретируется и накапливается в сыворотке инфицированных субъектов [62].В инфицированной клетке NS1 служит кофактором для репликации вирусной РНК ([63] и ссылки там) и существует в виде димера [64], [65]. Секретируемый NS1 формирует олигомерные состояния, вплоть до уровня гексамера [66], и участвует в активации комплемента [67], генерации аутоиммунных антител и разрушении эндотелиальных клеток [68]; однако точная функция секретируемого NS1 неясна [69]. В белке NS1 проанализированных штаммов мы обнаружили несколько одиночных аминокислотных замен и замен в двух небольших группах штаммов Efd и Sfd, которые не коррелировали с изменениями патогенности.Мы также обнаружили ключевую замену, S141G, которая, очевидно, различалась между группами штаммов с различной патогенностью (рис. S6). Нет данных о влиянии этой аминокислоты на свойства белка NS1; следовательно, мы не можем оценить роль этой замены в патогенезе ВКЭ.

Неструктурный белок NS2A представляет собой небольшой мембраносвязанный белок, который участвует в репликации РНК, связываясь с 3 ‘UTR с белками репликативного комплекса [70].Кроме того, NS2A ингибирует индукцию клеточного альфа / бета-интерферона [71], [72], [73] и участвует в сборке вирусных частиц [74,74]. Исследуемые штаммы содержали несколько аминокислотных замен в этом белке, которые не коррелировали с изменением патогенности штаммов.

Неструктурный белок NS2B представляет собой небольшой мембраносвязанный белок, который образует комплекс с вирусным белком NS3, который обладает каталитической активностью протеазы. Замены в гидрофильной части белка влияют на каталитическую активность комплекса [75].Анализируемые штаммы Sfd имели замену (F108V), расположенную в трансмембранном домене (фиг. S10), которая не оказывала значительного влияния на конформацию белка и патогенность штаммов.

Неструктурный белок NS3 представляет собой растворимый белок массой 70 кДа с активностью протеазы, геликазы, NTPазы и 5′-концевой РНК-трифосфатазы [76], [77], [78]. N-концевые остатки были идентифицированы как домен сериновой протеиназы семейства трипсинов, содержащий остатки His-54, Asp-78 и Ser-138 в активном центре [79], [80].Штаммы Sfd обладали двумя ключевыми заменами, R16K и S45F в белке NS3, расположенном в протеазном домене, но вне активного центра. Молекулярно-динамическое моделирование показало, что изменения в конформации комплекса NS3 / NS2B в штаммах Sfd могут препятствовать образованию комплекса полипротеин / протеаза и снижать скорость гидролиза полипротеина [81] (Рисунок 4). Биологические свойства штамма Скотово-94 подтверждают эти расчеты. Патогенные свойства этого штамма снижены по сравнению с патогенными штаммами, так как штамм Скотово-94 вызывает лихорадочную форму заболевания.Этот штамм содержит 15 ключевых аминокислот, специфичных для патогенных штаммов, но не содержит замен R16K и S45F в белке NS3, специфичном для штаммов Sfd (Таблица 1). Возможно, что штамм Скотово-94 вызвал лихорадочное заболевание из-за наличия этих замен в протеазе. Скотово-94 проявляет пониженную патогенность; однако это снижение менее значимо, чем у типичных штаммов Sfd.

Рисунок 4. Третичные структуры РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp).

(A) Третичная структура RdRp для патогенного штамма Дальнегорск. (B) Третичная структура RdRp для штамма Sfd Приморье-270. В обеих моделях различные субдомены окрашены следующим образом: синий — пальцы, зеленый — ладонь и розовый — большой палец. Замены аминокислотных остатков в обеих моделях обозначены красными атомами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g004

Неструктурный белок NS4A представляет собой мембранный белок с четырьмя трансмембранными доменами.Более того, C-концевой сайт, обозначенный как 2K-фрагмент, служит сигнальной последовательностью для транслокации белка NS4B в просвет эндоплазматического ретикулума ([82], [83] и ссылки в них). Исследуемые штаммы имели несколько незначительных мутаций, которые не коррелировали с патогенностью.

NS4B является крупнейшим из малых гидрофобных белков вируса и имеет 252 аминокислоты и 5 гидрофобных областей с четырьмя трансмембранными доменами (рисунок S10). NS4B, как известно, взаимодействует с геликазным доменом NS3 [84] и может служить антагонистом интерферона ([85]; см. Обзор [86]).Штаммы Sfd обладали тремя ключевыми заменами в NS4B, две из которых, M95V и V179A, расположены в трансмембранных доменах 2 и 3, а замена A213V расположена в гидрофильной области между трансмембранными доменами 3 и 4 (Рисунок S10). Функции этих замен неизвестны, поэтому неясно, влияют ли они на патогенность этих штаммов.

Белок NS5 является самым крупным (900 аминокислотных остатков) и наиболее консервативным среди флавивирусов. Он обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной и метилтрансферазной активностями [86], [87], [88].Недавно сообщалось, что NS5 ингибирует выработку интерферона [89], [90], [91], [92].

Белок NS5 штаммов Sfd содержал ключевые замены S634T, R677K, I692V и A724S, которые могут влиять на патогенность ВКЭ. Эти замены расположены в домене РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) NS5 (Рисунок 5, Рисунок S11). Замена A724S расположена в мотиве E РНК-зависимой полимеразы, рядом с важным функциональным доменом, который отвечает за связывание ионов цинка (Zn ² ) [36], в то время как другие три замены, S634T, R677K и I693V , сохраняются.Замена I692V расположена в консервативном домене флавивируса LNDMAKTRKDI, как и в вирусе Повассан, который не является патогенным для человека. Другие аминокислотные замены были расположены вне консервативных доменов на ладони NS5 и были геометрически аппроксимированы (рис. 5). Комбинация нескольких замен может влиять на активность полимеразы и может влиять на патогенность штаммов. Ключевые замены, обнаруженные в настоящем исследовании, вероятно, влияют на ингибирование стимулированной интерфероном передачи сигналов JAK-STAT, поскольку домен ингибирования JAK-STAT расположен между остатками 355 и 735 в домене RdRP [93].

Аминокислотные замены в белке NS5 могут влиять на нейровирулентность штаммов не только за счет изменения эффективности репликации вирусной РНК или ингибирования продукции интерферона, но также через взаимодействие с некоторыми клеточными белками, которые могут влиять на патогенные свойства ВКЭ. Так, в недавно опубликованной статье [94] на основе замены участков генома штамма OHFV на гомологичные участки ВКЭ указано, что наибольшее влияние (89,9%) на проявление неврологического заболевания у мышей оказывают гибридные штаммы, содержащие участок генома, кодирующий белок NS5 ВКЭ.Область, кодирующая белок NS3, влияет в меньшей степени (45,5%) [94]. Более того, было показано, что C-концевой участок белка, включающий замену 4 аминокислот 879RYS881 и 891E, характерен для OHFV; 879KFK881 и 891D, характерные для ВКЭ, имеют наибольшее влияние на нейровирулентность у мышей. Авторы предположили, что KFK-D мотив TBEV влияет на рост аксонов [94]. Примечательно, что замена сайта (нуклеотиды 9488–10295 или аминокислотные остатки 608–877) значительно снизила вирулентность, поскольку у большинства инфицированных мышей не было никаких признаков заболевания.

Все проанализированные штаммы ВКЭ содержали мотивы KFK-D в белке NS5 (за исключением нескольких штаммов, имеющих замены K / R) и вызывали неврологические заболевания у белых мышей, но имели различную нейровирулентность для людей. Эти факты подтверждают наши предыдущие данные об отсутствии однозначной корреляции между нейровирулентностью штаммов у мышей и человека [25]. Замены ключевых аминокислот, которые различаются у штаммов Efd и Sfd (а.о. 634–724), расположены в средней части белка NS5.Они могут снизить вирулентность за счет влияния на эффективность репликации [94]. Эти данные позволяют сделать вывод о возможном влиянии ключевых замен в белке NS5 на тяжесть заболевания, несмотря на отсутствие однозначной корреляции между нейровирулентностью штаммов TBEV у мышей и людей, а также то, что спектр аминокислотных замен может варьироваться. Также необходимо указать, каким образом белок NS3 может влиять на развитие неврологических симптомов.

Исключения

Мы показали, что положение штамма на филогенетическом дереве и наличие определенных ключевых аминокислотных замен хорошо коррелирует с патогенностью штаммов ВКЭ.Как правило, штаммы кластера I выделяли от лиц с субклиническим течением заболевания, а штаммы кластера II и III вызывали тяжелую летальную форму энцефалита. Однако из этого правила было несколько исключений, некоторые из которых можно объяснить более детальным изучением.

Самыми строгими исключениями из этого правила являются штаммы Primorje-86 и Primorje-90, которые являются штаммами Sfd на основании их молекулярных характеристик, но были изолированы от людей, которым в 1986 и 1990 годах был поставлен посмертный диагноз «энцефалит».У нас нет возможности объяснить это несоответствие, кроме предположений о неточности диагноза или наличии тяжелого иммунодефицита или других сопутствующих заболеваний, которые могут вызвать неблагоприятный исход на фоне заражения штаммами Sfd TBEV.

Штаммы «Приморье-52» и «Приморье-739» вызвали субклиническую форму заболевания, несмотря на то, что они расположены во II и III кластерах филогенетического дерева и содержат ключевые аминокислоты, специфичные для патогенных штаммов Efd.Причиной этого несоответствия может быть наличие самой длинной делеции в 3′-UTR, включая весь основной элемент, что препятствует эффективному размножению вируса в клетках человека. Таким образом, это исключение подтверждает наше предположение о том, что удаление самого длинного фрагмента в 3 ‘UTR может значительно снизить патогенность штаммов ВКЭ.

Другим исключением являются штаммы, вызывающие лихорадочную форму заболевания, которая приводит к выздоровлению пациентов и может рассматриваться как ослабленная форма энцефалита.Штамм Шкотово образует отдельную ветвь филогенетического древа между штаммами Efd и Sfd и отличается от штаммов Efd наличием в вирусной протеазе NS3 ключевых аминокислот 16K и 45F, характерных для штаммов Sfd. Это указывает на то, что замены 16K и 45F в вирусной протеазе NS3 могут снизить патогенность этих штаммов.

Штамм Ffd Primorye-94 имел замену V179A в NS4B, которая специфична для штаммов Sfd, но ее роль в снижении патогенности штаммов неизвестна.Кроме того, этот штамм имеет множество других уникальных аминокислотных замен: V141I в протеине E, K47R в протеине NS1, L69F, M161I и R228K в NS2B, A68V и L143I в NS3 и A92V в NS4A. Вероятно, что комбинация этого набора замен снижает патогенность штамма, но прямых доказательств влияния этих изменений на патогенность нет.

Штаммы Приморье-82 и Кипарис-94 представляют собой штаммы Sfd, но с повышенной вирулентностью, так как они вызывают лихорадочную форму заболевания.Каждый штамм имеет несколько одиночных аминокислотных замен в разных сайтах полипротеина (Рисунок S6). В то же время оба штамма показали уникальную замену D809N, локализованную в домене большого пальца NS5. Для оценки роли замены D809N в изменении патогенности штаммов необходимы дополнительные исследования с использованием методов обратной генетики; это следует оценивать с помощью теста безопасности обезьян на нейровирулентность [95].

Материалы и методы

Заявление об этике

Эксперименты на мышах проводились в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных согласно Постановлению Минздрава СССР No.1189 от 10.10.1983. Эксперименты проводились согласно Правилам Минздрава СССР № 755 от 12.09.1977 и № 701 от 27.07.1978 по гуманному обращению с животными. Все экспериментальные методики одобрены и выполнены в соответствии с требованиями НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (г. Владивосток) по содержанию и использованию животных (протокол №1 от 30.01.2008).

Изоляция вируса

Выделение штаммов ВКЭ проводили, как описано ранее [25].Вкратце, для выделения штаммов Efd использовали материалы аутопсии (мозг) мертвых пациентов, а для штаммов Sfd и Ffd для выделения вируса использовали свежую кровь из вены. Все штаммы были выделены внутримозговыми инъекциями двухдневным инбредным мышам, каждая из которых содержала 10 мкл 10% суспензии для биопробы. Мониторинг клинических проявлений инфекции осуществлялся путем ежедневного наблюдения за болезнью животных в течение 2–3 недель. В проход были включены мозги умерших мышей.

Экстракция РНК и получение кДНК

Суммарную РНК

экстрагировали из 100 мкл 10% суспензии мозга или плазмы в PBS с использованием Trizol LS (Life Science, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем РНК осаждали, дважды промывали 1 мл 80% этанола и сушили на воздухе в течение 5 мин. Осадок РНК ресуспендировали в 50 мкл свежей воды Milli-Q и как можно скорее использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскриптазы. Для получения кДНК с помощью обратной транскрипции смесь из 5 мкл РНК, 50 пМ гексануклеотидных праймеров, 200 мМ каждого NTP, 5 мМ MgCl ₂ , 200 ед. MMLV RT (Promega, Madison, WI) и Milli-Q воду (до общего объема 50 мкл) инкубировали при 42 ° C в течение 30 мин.Образцы кДНК для транспортировки смешивали с равными объемами изопропанола и хранили в виде суспензии.

Усиление

Пары олигонуклеотидных праймеров для амплификации были разработаны на основе ранее опубликованных последовательностей для штаммов Sofjin, Senzhang, 205, Glubinnoe и Aina и оптимизированы для создания 38 перекрывающихся фрагментов для смысловых и антисмысловых штаммов со средней длиной около 1000 пар оснований (Таблица S2 ). Для усиления каждого фрагмента смесь 0.5 мкл кДНК, 50 пМ соответствующих смысловых и антисмысловых праймеров для ПЦР, 25 мкл 2 × PCR Mix (Fermentas, Литва) и свежая вода Milli-Q (до общего объема 50 мкл) инкубировали при 95 ° C. в течение 1 мин, а затем использовали в реакции секвенирования цикла (25 циклов 96 ° C в течение 5 секунд, 57 ° C в течение 5 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд). Ампликоны анализировали электрофорезом в 1 × ТАЕ-буфере на 0,75% -ном агарозном геле (Promega, США). Полосы вырезали из геля под УФ-трансиллюминатором, и ДНК элюировали из геля методом замораживания-оттаивания [96].Количество элюированной ДНК анализировали с помощью Nano View (GE Healthcare, США).

Секвенирование фрагментов ПЦР

Для каждой реакции секвенирования приблизительно от 50 до 100 нг очищенной дцДНК смешивали с 3,2 пмоль одного из праймеров и с реакционной смесью, содержащей четыре меченных красителем дидезоксинуклеотидных терминатора (BigDye V 3.1, Life Science, США). Используемые параметры секвенирования цикла были такими, как описано в протоколе производителя (25 циклов при 96 ° C в течение 30 с, 50 ​​° C в течение 60 с и 60 ° C в течение 4 минут).Продукты реакции осаждали этанол-ацетатом, как описано в рекомендациях производителя. Осадок ресуспендировали в 16 мкл реагента подавления темплата, нагревали в течение 2 минут при 95 ° C и держали на льду до загрузки в секвенатор Applied Biosystems Prism 3100.

Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности

Перекрывающиеся последовательности нуклеиновых кислот были объединены для анализа и отредактированы с помощью пакета программ ( BioEdit v.7.2.0 редактор выравнивания последовательностей) (http: // www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html). Нуклеотидная последовательность была переведена в аминокислотную последовательность онлайн на портале ресурсов по биоинформатике (http://web.expasy.org/translate/). Нуклеотидные и транслируемые аминокислотные последовательности штаммов были депонированы в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) под номерами доступа, указанными в таблице 2.

полных геномов TBEV и предсказанные аминокислотные последовательности сравнивали онлайн на mafft.cbrc.jp/alignment server / программой MAFFT версии 7 со штаммом Sofjin-HO в качестве прототипа вируса TBE.

Филогенетические анализы

Филогенетический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полных геномов анализируемых штаммов вирусов и ранее описанных последовательностей генома штаммов ВКЭ дальневосточных подтипов (Sofjin — AB062064, Oshima 5-10 — AB062063, Глубинное — DQ862460 и Senzhang — AY182009), штамм Васильченко в качестве штамма-прототипа сибирского подтипа и Neudoerfl в качестве штамма-прототипа западного подтипа проводили с использованием метода максимального правдоподобия (ML).Филогенетическое дерево оценивали с помощью метода ML TreeFinder [97]. Наиболее подходящая эволюционная модель была определена с использованием jModelTest версии 0.1 [98], и была General Time Reversible (GTR) с моделью гамма-распределения гетерогенности скорости между сайтами и долей инвариантных сайтов (GTR + C + I). Полученные деревья были визуализированы с помощью онлайн-версии FigTree 1.12 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)

.

Скорости синонимичных (dS) и несинонимичных (dN) замен были рассчитаны с помощью CodeML в пакете PAML [99], [100]

Анализ вторичной структуры UTR

Прогнозирование вторичной структуры РНК

для UTR вирусной РНК было выполнено с использованием программы mfold, доступной по адресу http: // mfold.rna.albany.edu [101]. РНК-гибриды из первых 240 нуклеотидов, включая 5′-UTR, часть гена капсидного белка и полноразмерную 3′-UTR, использовали для предсказания мотивов вторичной структуры и идентификации возможных мотивов циклизации в РНК. Анализ вторичной структуры возможных мотивов циклизации был выполнен для всех 34 последовательностей TBEV.

Гомологическое моделирование

Третичные структуры протеазы TBEV NS2B-NS3, капсидного протеина C и RdRP для штаммов Дальнегорск и Приморье-270 моделировались программой Nest пакета Jackal [105], [106].

Протеаза NS2B / NS3

Кристаллическая структура протеазы Западного Нила (код PDB 3e90) была взята в качестве шаблона для моделирования гомологии, поскольку эта модель имеет высокое разрешение (2,45 Å), а идентичность последовательностей между мишенью и шаблоном превышает 25% [107 ].

Капсидный белок C

Кристаллическая структура капсидного протеина C вируса Западного Нила подтипа Kunjin (код PDB 1sfk) была взята в качестве шаблона для моделирования гомологии [108].

RdRP

Кристаллическая структура каталитического домена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса денге (RdRP) с разрешением 1.85 Å (код PDB 2j7u) был выбран в качестве шаблона [109].

Моделирование молекулярной динамики

Моделирование молекулярной динамики (МД) проводилось с использованием программного обеспечения Amber версии 11. Силовое поле Amber 99 применялось к комплексам [110]. Каждый белковый комплекс гидратировался на 9 Å по модели воды с простой зарядкой [111], применяя триклинный периодический ящик с пороговой точкой 8 Å для суммирования несвязанных взаимодействий в реальном пространстве. Противоионы, Na + или Cl-, были добавлены путем замены молекул воды в каждой системе, чтобы нейтрализовать систему.Впоследствии было применено 1000 итераций, чтобы минимизировать энергию системы. Положение атомов основной цепи было ограничено в течение первых 100 пс с силовой постоянной 2,0 ккал / Å ² , чтобы позволить регулировать молекулы растворителя. После этого было выполнено моделирование свободной молекулярной динамики с использованием ансамбля NPT (изотермино-изобарический) с шагом по времени 2 фс. Температура поддерживалась постоянной на уровне 300 К. Схема управления давлением Берендсена использовалась для поддержания давления около 1 бара во время моделирования с временем релаксации 2 пс и параметром сжимаемости по умолчанию для воды, равным 44.6 × 10 ⁻⁶ бар ⁻¹ . Система считалась уравновешенной через 1 нс. МД-моделирование без ограничений проводили в течение 20 нс для обоих комплексов NS2b / NS3, в течение 5 нс для обоих комплексов капсидного протеина С и в течение 5 нс для обоих комплексов RdRP.

EMA обзор регданвимаба для COVID-19 в поддержку национальных решений о раннем использовании

EMA проводит обзор моноклонального антитела Регданвимаб (CT-P59) компании Celltrion для поддержки национальных властей, которые могут принять решение об использовании этого лекарства от COVID-19 до получения разрешения.

Этот обзор дополняет текущий непрерывный обзор регданвимаба для лечения подтвержденного COVID-19 у пациентов, которым не требуется дополнительная кислородная терапия и которые имеют высокий риск прогрессирования COVID-19 в тяжелую форму и / или госпитализации.

Комитет по лекарствам для человека (CHMP) EMA рассмотрит данные о том, насколько хорошо это лекарство предотвращает развитие COVID-19 в тяжелой форме или сокращает количество госпитализаций и госпитализаций в отделения интенсивной терапии.

Несмотря на то, что перед возможной подачей заявки на получение регистрационного удостоверения продолжается более полный непрерывный обзор, эта процедура предоставит национальным властям общее мнение экспертов ЕС, которые могут принять основанные на доказательствах решения о раннем применении лекарства, например.грамм. в программах сострадательного использования.

EMA сообщит о результатах проверки после ее завершения.

Подробнее о лекарстве

Регданвимаб — моноклональное антитело с активностью против COVID-19. Моноклональные антитела — это тип белка, который был разработан для прикрепления к определенной структуре (называемой антигеном). Регданвимаб был разработан для присоединения к шиповому белку SARS-CoV-2, вируса, вызывающего COVID-19. Когда он прикрепляется к белку-шипу, способность вируса проникать в клетки организма снижается.Ожидается, что это снизит потребность в госпитализации пациентов с COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести.

Подробнее о процедуре

Исполнительный директор EMA запросил пересмотр в соответствии со статьей 5 (3) Регламента 726/2004 после предварительных обсуждений с целевой группой EMA по пандемии COVID-19 (COVID-ETF), которая объединяет экспертов со всей Европы. сеть регулирования лекарственных средств.

Обзор проводится Комитетом EMA по лекарственным средствам для человека (CHMP), который отвечает за вопросы, касающиеся лекарств для человека.Комитет предоставит научное заключение в кратчайшие сроки.

Обзор проводится параллельно с непрерывным обзором перед возможной подачей заявки на разрешение, если данных об эффективности, безопасности и качестве достаточно.

.

No related posts.