Исследование крови на малярию: Анализ крови на малярию: цена в Москве

ВВЕДЕНИЕ

Малярия представляет собой диагностическую проблему для лабораторий большинства стран. В этой статье сделана попытка пересмотреть существующую методологию и подход к диагностике малярии в практической и полезной форме для лаборатории и лечащего врача врача.Срочность и важность быстрого получения результатов исследования образцов крови пациентов с подозрением на острую малярию делают некоторые из наиболее чувствительных методов диагностики малярии непрактичными для рутинного лабораторного использования. Для целей настоящего обзора лабораторные методы, требующие более 1 часа для точного диагноза малярии, не считаются экспресс-тестами, хотя их можно рассматривать как эталонные процедуры.

Эндемическая малярия, перемещение населения и зарубежные поездки — все это вносит свой вклад в диагностические проблемы малярии, с которыми сталкивается лаборатория, которая может не располагать соответствующими знаниями в области микроскопии.Изменение моделей общепринятых морфологических проявлений видов малярии, возможно, из-за давления лекарств, вариации штаммов или подходов к сбору крови, создало диагностические проблемы, которые нельзя легко решить, просто обратившись к атласу паразитологии. К счастью, новая технология предоставляет дополнительные возможности диагностики, которые можно просмотреть и сравнить с более традиционными методами. Одновременно Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) начала диалог с учеными, клиницистами и производителями устройств для диагностики малярии относительно реальных возможностей разработки точных, чувствительных и экономичных экспресс-тестов для диагностики малярии.Условия для этих экспресс-тестов включают способность обнаруживать 100 паразитов / мкл всех видов Plasmodium spp. и возможность выполнять полуколичественные измерения для мониторинга результатов лечения наркозависимости. Кроме того, эти новые технологии необходимо сравнивать с общепринятыми методами «золотого стандарта».

Большинство случаев малярии регистрируется в странах, где рентабельность является важным фактором, а простота проведения диагностических тестов и обучение персонала также являются важными факторами.Большинство новых технологий диагностики малярии включают процедуры иммунохроматографического улавливания, когда конъюгированные моноклональные антитела служат индикатором инфекции. Предпочтительными целевыми антигенами являются те, которые присутствуют в большом количестве на всех бесполых и половых стадиях паразита; В настоящее время интерес сосредоточен на обнаружении богатого гистидином белка 2 (HRP-2) из ​​ Plasmodium falciparum и паразит-специфической лактатдегидрогеназы (pLDH) или альдолазы Plasmodium из паразитарного гликолитического пути, обнаруженного у всех видов.Клинические исследования обеспечивают эффективное сравнение между различными форматами тестов, а также разъясняют возможность и клиническую значимость использования немикроскопических методов.

ОБЫЧНАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Окрашенные пленки крови

Общепринятой лабораторной практикой для диагностики малярии является подготовка и микроскопическое исследование мазков крови, окрашенных пятнами Гимзы, Райта или Филда (69). Кровь, полученная путем прокалывания пальца или мочки уха, является идеальным образцом, поскольку плотность развитых трофозоитов или шизонтов выше в крови из этой богатой капиллярами области (17).Кровь, полученная при венепункции, собранная в пробирки, покрытые антикоагулянтом с гепарином или секвестрином (ЭДТА), приемлема, если ее использовать вскоре после взятия крови, чтобы предотвратить изменение морфологии лейкоцитов (WBC) и паразитов малярии. Должны быть приготовлены как толстые, так и тонкие мазки крови.

Плотный мазок крови.

Толстая пленка крови концентрирует слои красных кровяных телец (эритроцитов) на небольшой поверхности в 20–30 раз и окрашивается как незафиксированный препарат с использованием красителя Филда или разбавленного красителя Райта или Гимзы.Толстый мазок крови обеспечивает повышенную чувствительность метода мазка крови и намного лучше тонкой пленки для обнаружения низких уровней паразитемии и повторного появления циркулирующих паразитов во время рецидива или рецидива инфекции. Лизис эритроцитов в процессе окрашивания может затруднить сканирование на паразитов до тех пор, пока не будет накоплен опыт обнаружения паразитов среди лейкоцитов и тромбоцитов.

Тонкий мазок крови.

Тонкая пленка крови фиксируется метанолом и окрашивается разбавленным красителем Гимзы или Райта с использованием забуференной воды при pH 7.2, чтобы подчеркнуть включения паразитов в эритроцитах. Благодаря фиксированному монослою эритроцитов, доступному в этой процедуре, морфологическая идентификация паразита на уровне вида намного проще и обеспечивает большую специфичность, чем исследование толстой пленки. Тонкий мазок крови часто предпочтительнее для рутинной оценки паразитемии, потому что микроорганизмы легче увидеть и подсчитать. Возможность подсчета паразитов в последовательных мазках крови позволяет отслеживать реакцию на терапию, особенно для P.falciparum инфекции.

Чувствительность толстого мазка крови.

Ожидаемая чувствительность, которую может достичь опытный микроскопист для исследования процедуры толстого мазка крови, составляет около 50 паразитов / мкл крови (при условии, что общее количество эритроцитов составляет 5 × 10 ⁶ / мкл крови), что эквивалентно 0,001% инфицированных эритроцитов. Milne et al. (48) обнаружили, что большинство стандартных диагностических лабораторий обычно достигают более низкой чувствительности обнаружения (в среднем 0,01% инфицированных эритроцитов, 500 паразитов / мкл) при изучении результатов британских лабораторий, представленных в Референс-лабораторию по малярии.

Техника мазка крови претерпела очень небольшие улучшения с момента ее разработки в начале 1900-х годов. Хотя сейчас доступны более стойкие пятна, процесс окрашивания может занять до 60 минут времени подготовки для получения окрашенной тонкой или толстой пленки и является трудоемким. Интерпретация требует значительного опыта, особенно при низких уровнях паразитемии (69). Кроме того, у пациентов с малярией, вызванной P. falciparum , паразиты могут быть секвестрированы в глубоких капиллярах (селезенка, печень, костный мозг), и микроорганизмы могут не обнаруживаться в эквивалентном количестве в циркулирующей периферической крови, взятой при венепункции или уколе пальца.Таким образом, инфекцию, вызванную P. falciparum , можно легко пропустить, поскольку количество паразитов недостаточное для обнаружения в мазках крови. Исследование мазков крови после лечения может привести к обнаружению ряда циркулирующих паразитов; однако организмы могут быть мертвыми и еще не уничтожены хозяином, что продлевает предполагаемую позитивность пациента и лечение (65).

Оценка паразитемии с помощью пленок крови

Одним из наиболее важных аспектов сообщения о малярийных инфекциях с помощью лабораторных диагностических методов является информация, полученная при оценке уровня паразитемии, присутствующей в мазке крови.Морфологическая оценка паразитов также имеет решающее значение для точной интерпретации, особенно с учетом стадий развития и присутствия бесполых паразитов, содержащих гемозоиновый пигмент, при сообщении об инфекциях P. falciparum . Эта информация может указывать на возможность более тяжелой клинической ситуации, в частности поражения головного мозга, из-за выброса в периферическое кровообращение паразитов на развивающихся стадиях шизонта, секвестрированных в капиллярах.В этих обстоятельствах может потребоваться изменение способа введения лекарственного средства с перорального на внутривенный.

Было описано несколько методов оценки паразитемии ( Учебное пособие ВОЗ по основной микроскопии малярии, , ВОЗ, Женева, Швейцария) с использованием тонкого или толстого мазка крови. Важно оценивать каждый положительный мазок крови и сообщать о паразитемии в образцах после лечения точно так же, как и в исходном образце пациента.

Исследование толстых мазков крови.

Общепризнанным способом оценки количества паразитов, присутствующих в 1 мкл крови, является использование стандартного значения количества лейкоцитов (8000 лейкоцитов / мкл). Подсчет количества присутствующих паразитов до тех пор, пока не будет обнаружено 200 лейкоцитов, а затем умножение количества паразитов на 40 даст количество паразитов на микролитр крови. Если известно точное количество лейкоцитов, его можно использовать для получения более точного числа с соответствующей корректировкой коэффициента умножения.

Наиболее точный подсчет достигается путем подсчета общего количества паразитов, обнаруженных в измеренном объеме крови. Объем крови должен быть не менее 2 мкл и распределен на площади 1 см ² . Однако этот метод требует много времени, и подсчет паразитов против 200 лейкоцитов в толстой пленке, если известен точный общий подсчет белого, дает удовлетворительную точность для большинства клинических целей.

Основным недостатком толстой пленки крови является лизис эритроцитов в процессе окрашивания, что затрудняет чтение слайда из-за отсутствия признаков эритроцитов и неровностей по толщине пленки.Используя толстую пленку для оценки интенсивности паразитарной инфекции, исследователь должен, теоретически, подсчитывать паразитов только в толстопленочных полях, содержащих не более 20 лейкоцитов / 100 × поле иммерсии в масле. На самом деле поля, содержащие 20 лейкоцитов, часто слишком толстые для подсчета, тогда как легче всего читать те поля, которые содержат только 5 или 6 лейкоцитов. Было высказано предположение, что перед окрашиванием микроскопист должен быть в состоянии прочитать отпечаток через хорошо подготовленную толстую пленку крови. Перенос паразитов с положительных слайдов на отрицательные — явная возможность, и следует соблюдать осторожность при массовом окрашивании толстых слайдов крови.Использование масляных иммерсионных объективов 50х или 60х может оказаться недостаточным для идентификации некоторых более мелких кольцевых форм, видимых на толстой пленке, и в этих обстоятельствах необходимы 10-кратные окуляры для микроскопа.

Warhurst и Williams (69) сообщили, что исследование тонких пленок крови только 1/10 чувствительности для количественного определения малярийных паразитов, чем исследование толстых пленок крови, хотя морфологическая идентификация присутствующих видов Plasmodium намного проще с использованием тонких фильмы.Поэтому большинство лабораторий, занимающихся количественной оценкой и идентификацией малярийных паразитов с помощью микроскопии, производят как толстые, так и тонкие мазки крови. Настоятельно рекомендуется готовить и исследовать как толстые, так и тонкие пленки каждый раз, когда требуется исследование мазка крови на паразитов.

Исследование тонких мазков крови.

Паразитемия может быть определена путем исследования хорошо окрашенного тонкого мазка крови. Обычно это достигается путем учета количества паразитированных эритроцитов (не отдельных паразитов), наблюдаемых в 10000 эритроцитов (что равно примерно 40 полям монослойных клеток стандартного микроскопа с использованием 100-кратного масляного иммерсионного объектива; тем не менее, микроскопистам рекомендуется рассчитать среднее количество клеток на поле зрения микроскопа для их собственных микроскопов) и выражают количество паразитированных клеток в процентах.Приблизительное количество паразитов, присутствующих в 1 мкл крови, можно рассчитать, если предположить, что 1 мкл крови содержит 5 × 10 ⁶ эритроцитов; следовательно, 1% паразитемии будет содержать 1 паразита на 100 эритроцитов или 50 000 паразитов на мкл крови. Точно так же паразитемия 0,1% будет содержать 5000 паразитов / мкл крови. Это можно скорректировать для точного подсчета, если известно общее количество эритроцитов на микролитр.

Этот метод выражения паразитемии в процентах от инфицирования эритроцитов является методом выбора для рутинной практики в областях, где инфекция не является эндемической и где паразитемия обычно низка.Подсчет паразитов в ограниченной области толстой пленки (10 полей) приемлем, когда большее количество паразитов встречается в районах эндемической инфекции.

Микроскопическое исследование мазков крови признано универсальным «золотым стандартом» диагностики малярии; однако не существует единого общепринятого стандартного метода, используемого в настоящее время всеми исследователями для количественного определения паразитов. Hanscheid (19) обсудил проблемы, которые могут возникнуть при сравнении различных методов диагностики малярии и при отсутствии согласованного формата для оценки паразитемии, с которым можно было бы сравнить чувствительность для обнаружения паразитов.Тем не менее, мазок крови по-прежнему является единственным широко доступным результатом, с которым можно сравнивать новые методы диагностики малярии, хотя для сравнения следует также использовать последовательный метод подсчета паразитов по толстым или тонким мазкам крови.

ДИАГНОСТИКА С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

В попытке улучшить обнаружение малярийных паразитов в мазках крови были внедрены альтернативные методы. Некоторые флуоресцентные красители имеют сродство к нуклеиновой кислоте в ядре паразита и прикрепляются к ядрам.При возбуждении УФ-светом соответствующей длины волны ядро ​​будет сильно флуоресцировать. Для этой цели часто используются два флуорохромы: акридиновый оранжевый (АО) и бензотиокарбоксипурин (BCP), оба возбуждаются при 490 нм и демонстрируют флуоресценцию яблочно-зеленого или желтого цветов. Родамин-123 также полезен для оценки жизнеспособного состояния паразитов, поскольку его поглощение зависит от неповрежденной, работающей паразитарной мембраны.

Было опубликовано несколько методов, в которых АО используется либо как метод прямого окрашивания, либо в сочетании с методом концентрации, таким как толстый мазок крови (10, 15).Центрифужная количественная лейкоцитная пленка или QBC II (QBC) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.) объединяет капиллярную трубку с АО-покрытием и внутренний поплавок для разделения слоев лейкоцитов и тромбоцитов с помощью центрифугирования. Паразиты концентрируются под этим слоем клеток, появляясь в верхнем слое эритроцитов, но иногда также появляясь в слоях тромбоцитов и лейкоцитов. Паразитов можно увидеть через капиллярную трубку с помощью специального длиннофокусного объектива (параленсов) с флуоресцентным микроскопом (рис.) (1, 6, 9, 16). В более простом методе Кавамото используется фильтр возбуждения, установленный на пути проходящего светового луча, который позволяет длине волны возбуждения АО (от 470 до 490 нм) проходить к окрашенной пленке. Второй фильтр (510 нм) помещают в окуляр для просмотра флуоресцирующих паразитов, окрашенных АО. Этот метод может использовать сильный солнечный свет (если используется экран, окружающий глаза наблюдателя) или кварцевый галогенный источник в качестве источника возбуждающей длины волны (20, 21, 32, 33).

Трофозоиты P.falciparum , окрашенный АО методом УФ-флуоресценции QBC.

Клинические испытания с использованием методов АО (1, 4, 5, 6, 9, 15, 37, 39, 74) были проведены в лабораторных и полевых условиях. Метод флуоресценции QBC является более сложным с технической точки зрения и требует специального оборудования для разделения слоев клеток центрифугированием и хорошего флуоресцентного микроскопа с высокоинтенсивной ртутной или кварцевой галогенной лампой для обеспечения длины волны возбуждения.

Хотя АО является очень интенсивным флуоресцентным красителем, он неспецифичен и окрашивает нуклеиновые кислоты всех типов клеток.Следовательно, микроскопист, использующий АО, должен научиться отличать окрашенных флуоресценцией паразитов от других клеток и клеточного мусора, содержащего нуклеиновые кислоты (10). Особая осторожность требуется, если в крови пациентов с гемолитической анемией обнаруживаются тельца Хауэл-Джолли в полевых условиях. Сообщалось, что чувствительность окрашивания АО для выявления малярийных паразитов при инфекциях с уровнем паразитов <100 паразитов / мкл (0,002% паразитемии) составляет от 41 до 93% (73). Специфичность для инфекций P.falciparum — отличный (> 93%) (16), при этом большинство наблюдателей распознают маленькие кольцевые формы. Кольцевые формы или ранние трофозоиты других видов могут привести к ошибочному диагнозу, особенно на ранней фазе бесполого цикла, когда могут присутствовать только кольцевые формы. Для P. vivax и других инфекций P. falciparum , отличных от , особенно на более поздних стадиях развития, было обнаружено, что специфичность при использовании окрашивания АО ниже (52%), особенно для центробежного метода QBC, где более плотные паразиты поздней стадии могут скрываться в отделенном слое мононуклеарных клеток.

В альтернативной методике флуорохромов используется раствор BCP (7, 8, 40). BCP можно наносить непосредственно на суспензию лизированной крови или на незакрепленную, но сухую толстую пленку крови и интенсивно окрашивает нуклеиновую кислоту жизнеспособных паразитов P. falciparum . Напротив, включения эритроцитов и ядра лейкоцитов плохо окрашиваются (рис.). Этот метод устраняет некоторые проблемы, присущие некоторым флуоресцентным системам, такие как необходимость быстрого исследования для предотвращения выцветания или осаждения красителя.Несколько отчетов об использовании этого соединения показали, что это чувствительный и быстрый диагностический метод, сравнимый с окрашиванием по Гимзе, с зарегистрированной чувствительностью и специфичностью> 95% для P. falciparum . Паразитов P. falciparum , отличных от , легче отличить в толстопленочном препарате, чем в лейкоцитной пленке QBC.

Трофозоиты P. falciparum , окрашенные БЦП флуоресцентным методом.

Обладая опытом, работники, использующие методы с использованием соединений флюорохромов, могут быстро и точно обнаруживать паразитов.Однако важным ограничением методов, включающих как АО, так и BCP, является их неспособность легко дифференцировать Plasmodium spp. Имея опыт, различные стадии малярии, наблюдаемые в периферической крови, могут быть локализованы в определенных областях центрифугированной лейкоцитарной пленки (QBC), но конкретная идентификация видов остается сложной без изучения морфологии эритроцитов и включений паразитов. Несмотря на некоторые оговорки относительно использования флуоресцентных методов для обнаружения малярии (10), включая требования к специальной подготовке и дорогостоящему оборудованию и расходным материалам, флуоресцентная микроскопия остается жизнеспособной и быстрой альтернативой окрашиванию по Романовскому.В некоторых регионах мира, где флуоресцентные микроскопы или адекватное обучение их использованию, все еще будет существовать проблема. В этих областях потенциальную пользу могут принести альтернативные немикроскопические тесты для диагностики малярии (41).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНКРЕТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ЯДЕРНОЙ КИСЛОТЫ

ПЦР нельзя строго рассматривать как быстрый метод для первоначальной диагностики малярии. Его ценность заключается в его чувствительности, с возможностью обнаруживать пять или менее паразитов / мкл крови (64).Методы вложенной и мультиплексной ПЦР могут дать ценную информацию, когда возникают сложные морфологические проблемы при попытках идентифицировать паразитов на уровне вида. Для выявления ДНК малярии в цельной крови был разработан ряд ПЦР-анализов как одиночных, так и множественных методов (2, 27, 34, 61, 62, 64, 70, 71). Эти анализы использовались для первоначального диагноза после реакции на лечение и в качестве чувствительных стандартов, по которым оценивались другие немолекулярные методы.

Гены малых субъединиц 18S рРНК и циркумспорозоитов (CS) были использованы в качестве мишеней для дифференцировки Plasmodium spp. Методы с использованием вложенной ПЦР и обратной транскрипции-ПЦР позволяют идентифицировать все четыре вида (2, 34, 54, 63, 64, 69, 70, 71). Ген большой субъединицы РНК широко консервативен среди Plasmodium spp. и также подходит в качестве области-мишени ДНК, специфичной для определенного рода (29), при этом амплифицированная целевая последовательность обнаруживается внутренними зондами или анализируется с помощью гель-электрофореза.

Другие ДНК-мишени, такие как ген CS, использовались для видоспецифичных областей и были связаны со специфическим флуоресцеином или радиоактивно меченными зондами для обнаружения P. vivax . Sethabutr et al. (62), используя две системы амплификации, K1-14 (ДНК) и CS, использовали ПЦР для мониторинга ответа на терапию у 33 пациентов с инфекциями P. falciparum . В 103 исследованных образцах системы K1-14 и CS выявили 95 и 93% микроскопически положительных случаев соответственно.На 1-й день после лечения обнаружение ПЦР упало до 50% (K1-14) и 20% (CS) случаев, а на 4-й день после лечения только 3 и 0% были обнаружены с помощью ПЦР. Использование двух независимых систем ПЦР продемонстрировало, что ДНК P. falciparum временно присутствует в крови инфицированных пациентов в то время, когда паразитов уже нельзя было обнаружить под микроскопом.

Основными преимуществами использования метода на основе ПЦР являются способность обнаруживать малярийных паразитов у пациентов с низким уровнем паразитемии и идентифицировать их на уровне видов.Заражение пятью паразитами или менее на мкл может быть обнаружено со 100% чувствительностью и одинаковой специфичностью (34, 64). Дополнительная чувствительность, полученная с помощью ПЦР, может обеспечить положительные результаты при субпатентных инфекциях. Хотя многие организмы могут оставаться изолированными в капиллярном русле, эти паразиты могут попадать в кровоток, но в недостаточном количестве, чтобы их можно было обнаружить только с помощью микроскопии периферической крови.

Несколько рабочих исследовали сохранение ДНК в крови после лечения.Kain et al. (30) исследовали исчезновение паразитов P. falciparum во время лечения и обнаружили, что результаты ПЦР оставались положительными в среднем 144 часа по сравнению с 66 часами при микроскопии. Авторы также сообщили, что если ПЦР дала положительные результаты в течение 5-8 дней после лечения, можно было предсказать терапевтический отказ, возможно, из-за лекарственной устойчивости. Однако Srinavasan et al. (65) отметили, что ПЦР выявляла ДНК циркулирующих нежизнеспособных паразитов после успешной терапии, что могло привести к клинической путанице.

Различия в результатах ПЦР, полученных в ряде различных исследований, могут отражать различия в методах сбора и хранения образцов, методах выделения ДНК и выбора праймеров, условиях амплификации и анализе амплифицированного продукта. Дальнейшие достижения в технологии ПЦР могут позволить отличить ДНК от жизнеспособных или нежизнеспособных паразитов и, таким образом, облегчить использование процедур на основе ПЦР в полевых условиях (69). Методы на основе ПЦР особенно полезны для исследований вариабельности штаммов, мутаций и изучения генов паразитов, участвующих в устойчивости к лекарствам.Способность обнаруживать все виды Plasmodium во вложенных или мультиплексных анализах и повышенная чувствительность делают их идеальными процедурами для диагностики малярии. Прогресс в методах быстрой экстракции ДНК и разработке термоциклеров, возможно, с использованием недавно разработанных световых циклов, может позволить выполнить амплификацию ДНК малярийного паразита в сроки, которые клинически актуальны для острой диагностики как в полевых, так и в лабораторных условиях. Это не текущая ситуация, и микроскопия остается основой диагностики для большинства клинико-диагностических центров.

НЕМИКРОСКОПИЧЕСКИЕ БЫСТРЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

Недавний конгресс ВОЗ выпустил документ под названием Новые перспективы в диагностике малярии (WHO / MAL / 2000.1091) (74). Были представлены определенные рекомендации относительно того, что должны обеспечивать немикроскопические быстрые диагностические тесты (БДТ). В документе делается вывод, что результаты этих тестовых устройств должны быть по крайней мере такими же точными, как результаты микроскопии, выполненной средним техническим специалистом в обычных полевых условиях. Другие критерии включали чувствительность, которая должна быть выше 95% по сравнению с микроскопией, и обнаружение паразитемии, такое, что уровни 100 паразитов / мкл (0.002% паразитемии) следует надежно выявлять с чувствительностью 100%. Количественная или полуколичественная информация о плотности паразитов в циркулирующей крови считалась важной. Другими предложенными важными критериями были способность отличать жизнеспособных паразитов от продуктов паразитов, таких как антигены или нуклеиновые кислоты, не связанные с жизнеспособными организмами, а также указывать на прогноз результатов лечения или устойчивости к обычным противомалярийным препаратам.

Эти цели предъявляют одинаковые требования как к ученым, так и к производителям, и степень, в которой они были или могут быть достигнуты, наряду с экономическими соображениями, поставит перед учеными, участвующими в разработке этих ТЭР для лечения малярии, ряд интересных задач.

Хотя альтернативные методы окрашивания мазков крови для диагностики малярии существуют уже довольно давно (65), ранние методы, основанные на обнаружении флуоресцирующих малярийных паразитов или использовании меченных флуоресцеином антител к P. falciparum , были ограничены необходимость в сложном аппарате, отсутствие чувствительности и неспособность отличить активную инфекцию от предшествующей. Новые иммунохроматографические тесты захвата антигена способны обнаруживать> 100 паразитов / мкл (0.002% паразитемии) и дает быстрые результаты (от 15 до 20 мин). Они коммерчески доступны в наборе со всеми необходимыми реагентами, и простота выполнения процедур не требует обширного обучения или оборудования для выполнения или интерпретации результатов (53, 63).

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

Принцип

Иммунохроматография основана на миграции жидкости по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. Иммунохроматографические тесты основаны на захвате паразитарного антигена из периферической крови с использованием моноклональных антител, полученных против мишени малярийного антигена и конъюгированных либо с липосомой, содержащей селеновый краситель, либо с частицами золота в подвижной фазе.Второе или третье захватывающее моноклональное антитело, нанесенное на полоску нитроцеллюлозы, действует как неподвижная фаза. Миграция комплекса антиген-антитело в подвижной фазе вдоль полоски позволяет меченному антигену захватываться моноклональным антителом неподвижной фазы, таким образом образуя видимую окрашенную линию. Включение меченых козьих антимышиных антител обеспечивает контроль миграции системы (56). Миграция зависит от нескольких физических характеристик составляющих реагентов, в первую очередь от пористости мембраны, контролирующей скорость потока, и компонентов буферного раствора, используемого для транспортировки меченого комплекса антиген-антитело в лизированном образце крови (рис.).

Принцип иммунохроматографического БДТ при малярии.

Антигены малярии, подходящие в качестве мишеней для быстрых диагностических тестов

Антигены малярии, на которые в настоящее время воздействует RDT, — это HRP-2, pLDH и альдолаза Plasmodium .

HRP.

Rock et al. (59) описали, как эритроциты, инфицированные P. falciparum (IRBC), синтезируют три богатых гистидином белка, HRP-1 (HRP-ассоциированный HRP), HRP-2 и HRP-3. HRP-1 ( M, _r от 80000 до 115000) был идентифицирован у всех положительных на узелок P.falciparum , но лишь в небольших количествах присутствовали в гамбийских изолятах и ​​в нескольких адаптированных к культуре штаммах. HRP-2 ( M _r от 60 000 до 105 000) была идентифицирована у всех паразитов P. falciparum независимо от фенотипа выступов и была выделена из культуральных супернатантов как секретируемый водорастворимый белок. Было показано, что HRP-2 представляет собой открытый на поверхности белковый комплекс из нескольких близких полос. HRP-3 ( M _r от 40 000 до 55 000) присутствовал с наименьшей численностью по сравнению с HRP-1 и HRP-2.Ни HRP-1, ни HRP-2 не были обнаружены в ряде других положительных и отрицательных штаммов малярии P. falciparum , отличной от .

HRP-2 — водорастворимый белок, продуцируемый бесполыми стадиями и молодыми гаметоцитами P. falciparum (59). Он экспрессируется на поверхности мембраны эритроцитов, и из-за его обилия в P. falciparum , это был первый антиген, который был использован для разработки RDT для его обнаружения.

pLDH и альдолаза.

pLDH, фермент, обнаруженный в гликолитическом пути малярийного паразита, продуцируется половым и бесполым этапами паразита (44).Различные изомеры pLDH для каждого из четырех Plasmodium spp. заражение людей существует, и их обнаружение составляет второй подход к разработке RDT. Несколько других ферментов гликолитического пути малярийных паразитов, в частности альдолаза (45), были предложены в качестве антигенов-мишеней для RDT для других видов, кроме P. falciparum .

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

Наборы тест-полосок RDT для обнаружения малярийных антигенов теперь коммерчески доступны.Было проведено множество полевых и лабораторных исследований, в которых иммунохроматографические методы сравниваются с результатами, полученными с помощью традиционной микроскопии, флуоресцентной микроскопии и ПЦР (5a, 9, 14a, 16, 21, 22, 23, 23a, 54, 65, 71a, 72).

Анализы для обнаружения HRP-2

Обширные испытания трех коммерческих форматов щупов для определения HRP-2 (ParaSight F [Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ], ICT Pf или Pf / Pv [Amrad ICT, Сидней, Австралия] и тест PATH Falciparum Malaria IC [PATH, Сиэтл, Вашингтон.]) были выполнены, хотя в настоящее время существует несколько других производителей тестов для HRP-2, по которым опубликованные данные отсутствуют.

ParaSight F.

Лабораторные испытания иммунохроматографического теста ParaSight F для HRP-2 для обнаружения P. falciparum в образцах крови показали общую среднюю чувствительность от 77 до 98% при наличии> 100 паразитов / мкл (0,002% паразитемии) со специфичностью от 83 до 98% для P. falciparum по сравнению с микроскопией толстого мазка крови (3, 5a, 11, 35, 36, 57, 64).Более низкий диапазон чувствительности, полученный в различных исследованиях, вероятно, отражает неспособность наблюдателя обнаруживать паразитов при плотности всего 200 паразитов / мкл с помощью микроскопии (многие лаборатории обычно исследуют только 10 полей толстой пленки) или неспособность читать слабые положительные линии от тест-полоски. Низкий уровень или отсутствие секреции HRP-2 половыми формами может в некоторых случаях объяснять отрицательные результаты (5а).

Исследования Humar et al. (22) и Pieroni et al. (54) исследовали чувствительность и специфичность теста захвата антигена ParaSight F для P.falciparum по сравнению с ПЦР. Они продемонстрировали чувствительность и специфичность теста ParaSight F 88 и 97% соответственно. Пониженная чувствительность свидетельствовала о большей способности ПЦР обнаруживать низкие уровни паразитемии.

ICT

Опыт использования тест-полосок AMRAD ICT Pf и PATH Falciparum Malaria аналогичен опыту с тестом ParaSight F (16). Mills et al. (47) сравнили результаты анализов крови 148 зарубежных путешественников с использованием полосы PATH Falciparum Malaria IC, пропитанной моноклональным анти-HRP-2 иммуноглобулина M (IgM), с результатами, полученными с помощью микроскопии и ПЦР.Они получили чувствительность и специфичность 96 и 99% с обнаружением HRP-2 для P. falciparum , с противоречивыми результатами, имеющими <100 паразитов / мкл (0,002% паразитемии).

Wongsrichanalai et al. (73) оценили тест ICT Pf для выявления бесполой паразитемии P. falciparum у 551 субъекта в трех группах в Таиланде: (i) пациенты с симптомами, самостоятельно обращающиеся за диагностикой, (ii) сельские жители в рамках скринингового обследования и (iii) пациенты, недавно пролеченные от P.falciparum малярия. Экспертная световая микроскопия была эталоном. Они обнаружили, что характеристики теста ИКТ были одинаковыми для режимов диагностики и скрининга. Было выявлено четыре вывода: (i) чувствительность теста напрямую коррелировала с плотностью паразитов, (ii) интенсивность тестовой полосы напрямую коррелировала с плотностью паразита, (iii) стойкая положительность теста после очищения от паразитов препятствовала его использованию для мониторинга ранних терапевтических реакций и (iv) ложноотрицательный тест при 18 000 паразитов / мкл не объяснил.Они пришли к выводу, что сильный положительный результат теста ICT является высокопрогнозирующим фактором асексуальной паразитемии P. falciparum для диагностики новых случаев малярии P. falciparum в Таиланде, но что отрицательный результат теста неадекватен для исключения паразитемии <300 паразитов / мкл (0,006% паразитемии) и, в некоторых случаях, даже более сильная паразитемия.

Самодиагностика.

Наборы для самодиагностики путешественниками в отдаленные районы были рекомендованы. Пациенты с симптомами в возрасте от 16 до 60 лет, которые обратились в Больницу тропических болезней в Лондоне, Соединенное Королевство, в период с сентября 1997 года по июль 1999 года с просьбой пройти тестирование на малярию, были приглашены принять участие в исследовании самодиагностики малярии; Всего в исследовании приняли участие 153 пациента.Использовались карты малярии ICT Pf . Whitty et al. сообщили, что результаты тестов пациентов сравнивались с результатами микроскопии (толстые и тонкие мазки крови) (71a). 115 (75%) пациентов указали, что инструкциям легко следовать, а 128 (84%) заявили, что тесты легко читаются. Из 16 неудачных попыток, приведших к недействительным тестам, 4 пациента не смогли использовать ланцет, у 3 было недостаточно крови, 4 не смогли прочитать карту, 1 забыли добавить реагент, а остальные указали различные причины неудач.По сравнению с микроскопией специфичность и чувствительность для самотестирования составляли 97 и 95% соответственно. Хотя эти результаты обнадеживают, технические проблемы и чувствительность теста необходимо решать путем дополнительных полевых испытаний. В настоящее время эта технология не может заменить максимально быстрое обращение за надлежащей медицинской помощью при подозрении на малярию (71a).

Применение формата карты ICT Pf и Pf / Pv (рис.) В целом оказалось более удобным для пользователя, чем тесты, требующие нескольких этапов или использующие лунку, содержащую конъюгированные антитела, в которую помещается полоска. .Совсем недавно использование кассетного формата предоставило более удовлетворительное устройство для безопасности и манипулирования.

Amrad ICT Pf иммунохроматографическое тестовое устройство для обнаружения P. falciparum HRP-2.

Ограничения.

Хотя иммунохроматографические тесты на основе HRP-2 позволяют быстро диагностировать малярию P. falciparum , их клиническая полезность для диагностики других видов Plasmodium spp. и мониторинг терапевтического ответа ограничен.Поскольку HPR-2 экспрессируется только P. falciparum , эти тесты дадут отрицательные результаты с образцами, содержащими только P. vivax, P. ovale или P. malariae ; поэтому многие случаи малярии, отличной от falciparum , могут быть ошибочно признаны малярийно-отрицательными. Увеличение числа географических районов, где P. falciparum является доминирующим или единственным существующим видом, особенно с его опасным для жизни потенциалом, имеет большое значение и делает разработку тестов на этого паразита наиболее важной.Однако осознание экономической важности других видов для стран, где они эндемичны, и других последствий, таких как завоз малярии в районы, где инфекция не является эндемической, являются важными вопросами, которые требуют включения этих паразитов в диагностические исследования.

Персистенция HRP-2

Было показано, что HRP-2 сохраняется и обнаруживается после исчезновения клинических симптомов малярии и исчезновения паразитов от хозяина (38, 46).Humar et al. (22) обнаружили циркулирующий антиген HRP-2 у 68% пролеченных пациентов на 7-й день, и у 27% он все еще присутствовал на 28-й день. Причина персистенции антигена HRP-2 не совсем понятна и может отражать наличие скрытых жизнеспособных паразитов (возможно, в результате неэффективности лечения или циркулирующих комплексов антиген-антитело) (68). Действие противомалярийной терапии на паразита может влиять на устойчивость HRP-2. Schiff et al. (60) отметили, что 10% пациентов, получавших Фансидар, имели обнаруживаемый антиген HRP-2 на 14 день.Karbwang et al. (31) также обнаружили стойкий антиген HRP-2 во время и после терапии артеметером, признав, что сигнал HRP-2 не имел значения в течение первой недели лечения, но оказался точным индикатором неэффективности лечения в полевых условиях, когда он был обнаружен на 14 день после лечения.

Паразитемии низкого уровня, наблюдаемые в районах эндемической инфекции из-за постоянного контакта с малярийными паразитами, могут привести к положительным результатам с сомнительной клинической значимостью (67).Кроме того, есть свидетельства того, что у некоторых людей действительно может быть делеция гена, вырабатывающая HRP-2, и поэтому эти тесты никогда не дадут положительный результат.

Другие ограничения тестов на этот антиген относятся конкретно к техническим аспектам тест-системы HRP-2. Было сделано несколько сообщений о том, что моноклональные антитела IgG, используемые в ParaSight F, перекрестно реагируют с сывороточным ревматоидным фактором, вызывая ложноположительные результаты (25, 38). В тестах Amrad ICT Pf и PATH Falciparum Malaria используются моноклональные антитела IgM, и сообщения о ложноположительных реакциях, возникающих при ревматоидном факторе, встречаются реже (26).

Анализы для обнаружения pLDH

pLDH — растворимый гликолитический фермент, экспрессирующийся в высоких уровнях на бесполых стадиях малярийных паразитов. Он был обнаружен у всех четырех видов малярии человека (55, 56). Активность pLDH коррелирует с уровнем паразитемии, обнаруживаемой в культурах малярии in vitro и в плазме инфицированных пациентов, как определено с помощью микроскопии (42, 43, 49, 56).

Специфическое измерение pLDH из Plasmodium spp. в присутствии человеческого хозяина ЛДГ можно измерить с помощью субстрата 3-ацетилпиридинадениндинуклеотида (APAD), аналога NAD, в анализе иммунного захвата (анализ IC) (55).Хотя константы Михаэлиса-Ментен схожи, число оборотов pLDH в присутствии APAD намного больше, чем у человеческого фермента с тем же кофактором (19). Эта характеристика частично связана с конформационными изменениями, происходящими в ферменте, который участвует в лимитирующей стадии процесса окисления-восстановления (13, 18). Пайпер и др. (55) первоначально сравнили использование двух диагностических тестов, основанных на специфическом обнаружении активности pLDH. Анализ ICpLDH обнаружил фермент в крови влажным анализом с использованием APAD в качестве субстрата.Авторы подчеркнули важность результатов, показывающих, что активность pLDH была обнаружена у жизнеспособных половых и бесполых паразитов инфекций, вызванных P. falciparum и P. vivax .

OptiMAL.

Панель моноклональных антител, которые могут связываться с активной pLDH, была разработана из эритроцитов, инфицированных P. falciparum . Три из этих моноклональных антител используются в иммунохроматографическом тесте на индикаторных полосках RDT (OptiMAL; Flow Inc., Портленд, Орегон). Два моноклональных антитела являются панспецифичными и распознают все четыре вида малярии; третье моноклональное антитело специфично только для P.falciparum ЛДГ. Одно панспецифическое антитело (6C9), конъюгированное с частицами золота в качестве индикатора, используется для захвата всего антигена pLDH малярии, присутствующего в образце крови. Два других моноклональных антитела действуют как отдельные иммобилизованные участки захвата на иммунохроматографической индикаторной полоске. Одно из моноклональных антител (17E4) специфично для захвата pLDH P. falciparum , а другое (19G7) представляет собой панспецифическое антитело к pLDH. Комплекс малярийный антиген / меченое антитело будет захвачен одним или обоими иммобилизованными линии захвата ( стр.falciparum spp.) или только панспецифической линией (не P. falciparum spp.). Комплекс антиген-антитело, конъюгированный с золотом, выстраивается в виде пурпурной линии на полосе захвата. Наличие контрольной линии захвата козьих антимышиных моноклональных антител указывает на успешный тест. При наличии смешанных инфекций, вызванных P. falciparum и nonfalciparum, результаты будут указывать на P. falciparum (рис.). Моноклональные антитела, используемые в тесте OptiMAL, были тщательно протестированы на перекрестную реактивность с ЛДГ из других простейших в крови, таких как Leishmania, Babesia и патогенных бактерий или грибов; доказательств такой перекрестной реактивности обнаружено не было (42)

Иммунохроматографическое тест-устройство OptiMAL для обнаружения pLDH.

Клинические испытания OptiMAL были проведены во многих центрах (14a, 23, 23a, 24, 27, 41, 49, 50, 51, 52, 56, 58). Следует отметить, что в нескольких исследованиях было показано, что снижение активности pLDH параллельно сокращению количества жизнеспособных паразитов во время терапии (42, 49, 50, 56). Следовательно, этот анализ может использоваться для мониторинга прогресса пациента во время терапии и служит индикатором рецидива и возможных лекарственно-устойчивых инфекций, предполагая, что уровни pLDH сохраняются в этих условиях.

Palmer et al. (51) исследовали способность OptiMAL обнаруживать P. vivax и P. falciparum во время вспышки малярии в Гондурасе. Результаты, полученные с помощью тестов OptiMAL, сравнивали с результатами, полученными с окрашенными по Гимзе густыми мазками крови из того же образца. Образцы цельной крови были взяты у 202 пациентов с подозрением на малярию; 96 (48%) образцов были положительными при микроскопическом исследовании, а 91 (45%) образцов были положительными при тесте OptiMAL.Из пленок, положительных при микроскопии, 82% содержали паразитов P. vivax и 18% содержали паразитов P. falciparum . OptiMAL обнаружил P. vivax и P. falciparum в 81 и 19% положительных случаев соответственно. Общая чувствительность, полученная с помощью теста OptiMAL для P. falciparum и P. vivax в этой серии, составила 94 и 88% соответственно со специфичностью 100 и 99% соответственно. Образцы, обнаруженные при микроскопии положительными, но отрицательными при использовании OptiMAL (3%), содержали <100 паразитов / мкл крови (0.002% паразитемия).

В другом полевом исследовании пациентов больниц с симптомами и бессимптомных добровольцев, проведенном Quitana et al. (58) для госпитализированных пациентов с помощью толстопленочной микроскопии и ПЦР были обнаружены паразитов P. falciparum и P. vivax со средней плотностью паразитов 590 / мм ³ . Когда результаты теста OptiMAL для тех же образцов сравнивались с результатами, полученными с помощью микроскопии и ПЦР, OptiMAL имел чувствительность 100% и специфичность 95% для образцов, содержащих P.falciparum . Хотя чувствительность и специфичность индикаторной полоски в этом исследовании были аналогичны чувствительности и специфичности толстопленочной микроскопии для P. vivax , по сравнению с ПЦР тест-полоска не смогла правильно идентифицировать смешанные инфекции из-за общего улавливания, полученного с помощью панспецифического теста. полоса антител.

Дальнейшие исследования в Индии John et al. (28) и в Гамбии Hunt-Cooke et al. (23) с P. falciparum и P. vivax -положительными образцами из когорты полуиммунных людей, подвергшихся воздействию малярии, подтвердили чувствительность и специфичность OptiMAL, обнаруженные другими специалистами.Iqbal et al. (24) сравнили обнаружение pLDH с микроскопией и ПЦР у 550 иммигрантов из эндемичных по малярии районов, которые въезжали в Кувейт, где малярия не является эндемичной. Они пришли к выводу, что для уровней паразитов> 100 паразитов / мкл (0,002% паразитемия) чувствительность, полученная для OptiMAL, составила 97%. Однако, поскольку половина образцов с содержанием <50 паразитов / мкл (0,001% паразитемии), обнаруженных с помощью микроскопии, не была обнаружена, авторы рекомендовали использовать этот тест с большой осторожностью и не заменять обычную микроскопию при диагностике малярии.В другом исследовании, проведенном Iqbal et al., Эффективность анализа pLDH была сопоставима с производительностью микроскопии для выявления инфекции P. falciparum при паразитемии> 100 / мкл. Анализ pLDH предлагает преимущество перед анализом ICT Pf для HRP-2, поскольку образцы, инфицированные P. vivax , легко отличить от образцов, инфицированных P. falciparum ; также могут быть обнаружены смешанные инфекции, вызванные как P. falciparum , так и P. vivax (23a).Тем не менее, исследование мазка крови остается стандартным методом диагностики малярии, поскольку оно обнаруживает все виды Plasmodium spp. и позволяет визуализировать стадии роста паразитов, что важно для принятия терапевтических решений.

Jelinek et al. (27) в многоцентровом исследовании 231 пациента, обследованного на малярию с использованием тест-полосок для определения HRP-2 и pLDH, обнаружили, что 53 пациента дали положительные результаты на инфекции P. falciparum . Основываясь на полученной специфичности и чувствительности, они пришли к выводу, что индикаторные полоски могут повысить точность диагностики P.falciparum , малярия, если задействованы неспециализированные лаборатории. Moody et al. (49), исследуя возможность замены микроскопического исследования обычных мазков крови на малярийных паразитов на OptiMAL в исследовании с группой пациентов с историей путешествий по всему миру, получили гораздо более низкую чувствительность к малярии, отличной от P. falciparum , кроме . P. vivax (таблица). Таблица 1.образцов и видов, представленных под микроскопом No. OptiMAL положительный Чувствительность (%) Plasmodium falciparum 54 с паразитемией> 1% (50 000) 54 100 103 с паразитемией 0,1–1% (5000 паразитов / мкл) 103 100 72 с паразитемией 0.01–0,09% (500 паразитов / мкл) 72 100 32 с паразитемией 0,001–0,009% (50 паразитов / мкл) 23 72 11 с паразитемией 0,0001–0,009% (50 паразитов / мкл) 0,0009% (5 паразитов / мкл) 8 73 5 только с гаметоцитами 4 80 Plasmodium vivax 110613 906105 96 Plasmodium malariae 17 (поздние трофозоиты) 8 47 9014 9014 906 906 906 9014 9014 906 906 906 паразитов) 0 100

В исследовании теста OptiMAL для обнаружения и идентификации малярии инфекций у бессимптомных жителей Индонезии, Fryauff et al (14a) обнаружили чувствительность от 88 до 92% для выявления инфекций от 500 до 1000 паразитов / мкл, диапазон, охватывающий среднюю паразитемию первичной симптоматической P.falciparum , у индонезийских трансмигрантов, ранее не инфицированных малярией. Однако эта система была заметно менее чувствительной, чем экспертная микроскопия для различения видов малярии.

Некоторые исследователи отметили, что во время терапии очищение мазков крови от паразитов и снижение уровней pLDH идут параллельно друг другу (49, 50, 65). Moody et al. (49) наблюдали за этим явлением у 60 пациентов, проходящих лечение от P. falciparum в Больнице тропических болезней, Лондон, Соединенное Королевство, и отметили, что положительные образцы OptiMAL соответствовали ежедневному снижению паразитемии, как видно под микроскопом (таблица).

ТАБЛИЦА 2.

Результаты, полученные с помощью микроскопии и OptiMAL на последовательных пробах крови от 60 пациентов, получающих терапию от P. falciparum малярии ^a

Srinivasan et al. (65) наблюдали за течением 17 пациентов с P. falciparum , которые проходили лечение хинином, противомалярийным препаратом, который атакует мембрану паразита, с использованием родамин-123 (R123), красителя, ранее использовавшегося для демонстрации жизнеспособности паразита в vitro (26, 66). R123 представляет собой катионный проникающий краситель, который избирательно накапливается внутри малярийного паразита из-за его высокого мембранного потенциала (внутренний отрицательный), который поддерживается электрогенным насосом H ⁺ -АТФазы, расположенным в мембране.Таким образом, R123 является жизненно важным красителем, окрашивающим только жизнеспособных паразитов. Они смогли продемонстрировать постоянное присутствие циркулирующих, но нежизнеспособных паразитов и пришли к выводу, что эти паразиты могут вносить вклад в длительные микроскопические паразитемии, не поддающиеся очевидному клиническому излечению. Это поддерживает возможное использование тестов для измерения уровня pLDH в качестве ценных инструментов для мониторинга противомалярийной терапии (14a, 49, 50, 56), особенно в тех областях, где микроскопическое исследование может быть недоступно.

ДРУГИЕ ФЕРМЕНТЫ-КАНДИДАТЫ, ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРОВ ИНФЕКЦИИ

Альдолаза

Другие ферменты гликолитического пути малярийного паразита были признаны и считаются мишенями для экспресс-диагностики малярии.В энергетическом метаболизме крови на стадиях малярии человека отсутствует функциональный цикл лимонной кислоты, а выработка АТФ полностью зависит от гликолитического цикла. Альдолаза — ключевой фермент в этом пути. В эксперименте по изучению стадийно-специфической экспрессии изоферментов альдолазы у малярийного паразита грызунов Plasmodium berghei Meier et al. (45) клонировали два гена, кодирующих гликолитический фермент альдолазу (альдо-1 и альдо-2). Было обнаружено, что альдо-1 практически идентичен альдолазе P. falciparum , тогда как альдо-2 имел 13% разнообразия последовательностей.Зонды со специфическими антителами были способны обнаруживать альдо-1 на стадии спорозоитов и альдо-2 на бесполой стадии малярийных паразитов, обнаруженных в крови.

Моноклональные антитела, продуцируемые против альдолазы Plasmodium , являются панспецифичными в своей реакции и были использованы в комбинированном тесте с HRP-2 для обнаружения P. vivax , а также P. falciparum в крови. Tjitra et al. (67) оценили комбинированный иммунохроматографический тест Pf / Pv (ICT Pf / Pv ), отформатированный с полосами захвата как для HRP-2, так и для альдолазы.Они сообщили, что специфичность и отрицательная прогностическая ценность для диагностики P. vivax составили 94,8 и 98,2% соответственно. Общая чувствительность 75% и положительная прогностическая ценность 50% для малярии P. vivax были менее желательными в их ситуации. Чувствительность, полученная для> 500 паразитов / мкл (0,01% паразитемии), составила 96%, но для значений ниже этого уровня — только 29%.

В исследовании 13 пациентов с малярией в Брисбене, Австралия, с использованием теста ICT Pf / Pv , Эйзен и Саул (14) также отметили низкую чувствительность для обнаружения P.vivax , когда количество паразитов было ниже 500 паразитов / мкл (0,01% паразитемии). Они продемонстрировали снижение интенсивности панспецифической линии с инфекцией P. falciparum или P. vivax во время лечения, в отличие от линии HRP-2, которая оставалась положительной в течение значительных периодов времени после того, как микроскопия стала отрицательной. Авторы предполагают возможность использования панспецифической линии для контроля ответа на терапию. Однако было представлено мало доказательств чувствительности панспецифических антител ICT Pf / Pv к P.falciparum , поскольку эта серия показала обнаружение> 100 паразитов (0,002% паразитемии) в трех образцах, но не в пяти других с более высоким числом паразитов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Рекомендуемый метод и текущий золотой стандарт, используемый для рутинной лабораторной диагностики малярии, — это микроскопическое исследование окрашенных тонких и толстых мазков крови, особенно с дополнительной чувствительностью, обеспечиваемой исследованием толстых мазков крови. В самых умелых руках этот метод может обнаружить 50 паразитов / мкл (0.001% паразитемии) и идентифицировать до видового уровня 98% всех наблюдаемых паразитов. Эта процедура признана сложной и трудоемкой, требующей значительного обучения для получения необходимых навыков. В последние несколько лет попытки заменить традиционное, но утомительное чтение мазков крови привели к появлению методов обнаружения малярийных паразитов, чувствительность которых эквивалентна или лучше, чем у микроскопии. Методы с использованием флуоресцентной микроскопии помогли улучшить чувствительность, но не специфичность.ПЦР оказалась чувствительным методом диагностики всех четырех видов малярийных паразитов человека, и можно ожидать, что она превосходит чувствительность микроскопического исследования. Обнаружение <5 паразитов / мкл и идентификация на уровне вида делают этот метод отличным для сравнения чувствительности и специфичности других немикроскопических методов. Однако ПЦР является непрактичным стандартом для измерения рутинной диагностики острой малярии из-за затрат времени и необходимого технического опыта.Обнаружение ДНК в образцах, взятых в то время, когда они хорошо удалены от инфекции (28), может дать сбивающие с толку свидетельства рецидива или лекарственной устойчивости.

Иммунохроматографические тест-полоски позволяют использовать более быстрые немикроскопические методы диагностики малярии, что позволяет сэкономить на обучении и времени. Эти тесты просты в выполнении и требуют небольшого обучения для интерпретации результатов. Однако есть ряд вопросов, на которые в документе ВОЗ «Новые перспективы диагностики малярии » обращает внимание при рассмотрении текущего состояния разработки БДТ для лечения малярии.Это обсуждается ниже.

Чувствительность к БДТ остается проблемой, особенно для неиммунных групп населения. Плотность паразитов выше 100 паразитов / мкл (0,002% паразитемии) должна быть определена с уверенностью (средняя паразитемия, наблюдаемая у пациентов, посещающих Больницу тропических болезней, составляет от 5000 паразитов / мкл [0,1% паразитемии] до 50 паразитов / мкл [0,001% паразитемии]. ]). Хотя эта чувствительность является разумным целевым показателем, которого можно ожидать от измерительных щупов для диагностики P. falciparum , она находится на нижнем пределе возможностей большинства устройств, использующих методы захвата для HRP-2 или pLDH.Доступные тестовые устройства для диагностики малярии, отличной от P. falciparum (ICT Pf / Pv и OptiMAL), имеют чувствительность для диагностики P. vivax от 90 до 96% (OptiMAL) и от 75 до 95% (ICT). Pf / Pv ). Уровень паразитемии, встречающийся для этого паразита, редко превышает 1%, и обычно встречается гораздо более низкий показатель.

Сообщения об обнаружении антигена P. ovale и P. malariae (49) указывают на то, что панспецифические моноклональные антитела возникли из P.falciparum в OptiMAL имеют более низкое сродство к этим антигенам, с дополнительной проблемой, заключающейся в том, что встречается меньше паразитов, чем для P. vivax . Возможно, существует несколько изомеров этих паразитов, из-за чего обнаружение некоторых из них невозможно. Можно предвидеть, что более чувствительное моноклональное антитело захвата для P. ovale может быть доступно для улучшения обнаружения (M. T. Makler, Flow Inc., личное сообщение). Дайер и др. (12) сообщают о неспособности иммунохроматографического теста ICT Pf / Pv к панмалярийным антителам выявить симптоматические P.malariae в Восточном Тиморе и Папуа-Новой Гвинее, даже при паразитемии 4080 паразитов / мкл. Нет сообщений об опыте использования этого формата испытаний для P. ovale .

Клиническое и эпидемиологическое значение тест-полосок, распознающих гаметоциты Plasmodium , имеет большое значение. В районах, где нет передачи малярии, тот факт, что тест не обнаружит все гаметоциты, имеет меньшее значение, чем в районах с высоким уровнем передачи. HRP-2 от половых стадий P.falciparum обнаруживается легче, чем pLDH, которая, по-видимому, активна в молодых формах, но не так легко в более поздних.

Отрицательный результат RDT в настоящее время не может быть принят за чистую монету и должен быть подтвержден микроскопическим исследованием. Была постулирована возможность изолятов с делецией генов, которые не экспрессируют HRP-2, хотя такие же доказательства для pLDH еще не обнаружены. Следует рассмотреть возможность дальнейшего исследования этих и других неэкспрессированных антигенов.

Некоторые исследователи сообщают о полезности ДДТ как средства наблюдения за течением паразитемии во время терапии (49, 50).Srinivasan et al. (65) исследовали значение паразитов, которые остаются в периферической крови после нескольких дней терапии, как это было обнаружено с помощью микроскопии. Когда используется R123, катионный краситель, требующий неповрежденной мембраны, обнаруживаемый у жизнеспособных паразитов, краситель проникает через мембрану и окрашивает паразита. Это исследование пришло к выводу, что наблюдаемые под микроскопом паразиты, оставшиеся в конце курса терапии, являются нежизнеспособными паразитами, лишенными активности фермента pLDH, но еще не выведенными из крови.Это может повлиять на интерпретацию различных характеристик различных методов ДЭТ в сравнении с микроскопией как золотым стандартом при последовательном отборе образцов во время лечения. Сохранение антигенемии HRP-2 после устранения периферической паразитемии в некоторых случаях снижает полезность этих анализов для мониторинга ответа на терапию.

Хотя некоторые исследователи сообщают количественные или полуколичественные данные от форматированных в настоящее время БДТ, в настоящее время невозможно получить на глаз показания, линейные для паразитемии, без какой-либо формы считывающего устройства для захваченных конъюгированных с золотом антител.Количественное измерение позволит сделать прогнозную оценку и предоставит информацию, указывающую на лекарственную устойчивость. RDT, представленные в настоящее время на рынке, просты в использовании; большинство из них в кассетном формате с областями для однократного нанесения образца крови и очищающим буфером. Большинство оценочных испытаний включали температурную и временную стабильность в течение как минимум 1 года при 40 ° C. В настоящее время ни один из коммерческих форматов не имеет одобрения Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в США, поскольку наиболее острой потребностью при их разработке было использование в странах с ограниченными ресурсами.Однако, особенно с версиями, выявляющими малярию, отличную от P. falciparum (ICT Pf / Pv и OptiMAL), военные США провели испытания на одобрение FDA из-за возможного использования этих устройств в полевых условиях. Окончательная организация производства в Соединенных Штатах может быть возможна в будущем. Коммерческий интерес к производству индикаторных щупов по цене, которую могут себе позволить многие из более бедных стран, является предметом постоянных дебатов, и даже при дифференцированном ценообразовании для разных стран добиться более низких затрат будет трудно.Производство RDT в настоящее время рассматривается более крупными компаниями (AMRAD ICT и Becton Dickinson), и в ближайшем будущем можно ожидать возможных коммерческих изменений.

Новое поколение RDT предлагает реальную практическую возможность перенести диагностику малярии из лаборатории и ближе к пациенту. Чувствительность> 100 паразитов / мкл (0,002% паразитемии), достижимая для диагностики P. falciparum как для HRP-2, так и для ферментативных анализов, настолько хороша, насколько большинство клинических лабораторных сотрудников в неспециализированных лабораториях могут рассчитывать на микроскопические результаты при ограниченном воздействии. к случаям малярии (47).Дополнительная уверенность в том, что опасная для жизни паразитемия, вызванная P. falciparum , не будет пропущена, приветствуется, особенно для неопытного лабораторного персонала во время ночных звонков. Способность обнаруживать большинство случаев малярии, отличной от falciparum , также делает эти тесты идеально подходящими в качестве основных вспомогательных процедур для диагностики малярии.

При рассмотрении методов лабораторной диагностики малярии необходимо учитывать множество факторов (таблица), не в последнюю очередь из которых важны их доступность и стоимость.Приветствуется нынешняя дискуссия о введении тестов, основанных на новой технологии. Тем не менее, это не исключает необходимости проверки правильно окрашенных толстых и тонких мазков крови в качестве стандартной рабочей процедуры при подозрении на малярию или замены существующей программы обучения для идентификации видов Plasmodium и для обнаружения паразитемии ниже существующей. порог обнаружения РДТ.

ТАБЛИЦА 3.

Сравнение методов диагностики Инфекция Plasmodium в крови

ССЫЛКИ