Курение электронных сигарет подростками-вэйперами как социальная проблема ⋆
В статье рассказывается о проблеме курильщиков электронных сигарет. Особое внимание уделяется тому, какой вред наносит организму подростков любая курительная жидкость, так как в ней содержатся вещества, вредные для растущего организма, в том числе канцерогены, токсичные вещества. Делается акцент на том, что электронные сигареты вызывают и психологическую зависимость. Помимо вреда, причиняемого курильщику, испарения от электронных сигарет остаются вредными для находящихся рядом с ним людей. Заявление о «безвредности» электронных сигарет, их альтернативности курению является не более чем маркетинговым ходом.
Кривых С.В.,
д. пед. н., профессор кафедры социализации и воспитания
РГПУ им. А.И. Герцена, Санкт-Петербург
Сегодня процессу социализации подрастающего поколения уделяется все большее внимание. По сути, информационное общество ценит умение быстро и качественно увеличивать объем известной человеку информации. Молодежный социум уже не интересует крепкие долговременные связи, напротив, они случайны, хаотичны, четкая социальная иерархия в молодежной среде уходит в прошлое. В ответ на незнание социальных норм, неумение ориентироваться в социальных отношениях возникает безразличие, молодежная инфантилизация, при этом возникают модные молодежные субкультуры, куда все активнее вовлекаются подростки. Рассмотрим субкультуру вэйперов – курильщиков электронных сигарет.
Электронными сигаретами называют электронные системы доставки никотина (ЭСДН). ЭСДН – это «устройство одноразового и/или многоразового использования с аэрозольным генератором сверхмалой мощности, продуцирующее аэрозоль путем нагревания раствора, компонентами которого, помимо никотина, когда он присутствует, являются пропиленгликоль с глицерином или без него и ароматизаторы». То есть электронная сигарета – это устройство, позволяющее получать никотин без использования огня.
Рассмотрим, как именно работает электронная сигарета (см. рисунок). В корпусе ЭСДН вставлена батарейка, крошечный парогенератор и картридж с жидкостью. Как только человек делает «затяжку» – механизм активизируется. Парогенератор производит пар, содержащий в себе дозу никотина из курительной жидкости, этот пар попадает в легкие вместе с затяжкой. Как правило, для визуальной имитации курения, электронная сигарета снабжается светодиодом.
Вкус и состав ЭСДН зависят от состава выбранной курительной жидкости, смеси. Эта смесь легко заменяется, одна капсула содержит в себе столько же веществ, сколько содержали бы в себе от 15 до 50 сигарет.
Когда мы говорим о курительной жидкости, мы подразумеваем два её вида. Существует четкое деление видов смесей, но подробно мы рассмотрим только два из них:
– Никотиносодержащие;
– Не содержащие никотин.
Устройство электронной сигареты
При использовании первого вида курительной жидкости можно говорить о снижении вреда для окружающих: выдыхаемый пар не содержит вредных веществ и возможность пассивного курения практически исключается. Однако, к самому вейперу в данном случае применимы все возможные трудности курильщика «натуральных» сигарет.
Рассмотрим вред курительной жидкости с содержанием никотина на подростков:
- Тяжесть функционирования легких. С первых проб подросток испытывает затрудненное дыхание даже при минимальных нагрузках, затем организм реагирует на курение затяжным кашлем и отдышкой. Именно курильщики занимают первое место по распространенности рака легких. Более того, из-за вынужденного снижения физической активности происходит уменьшение мышечного тонуса.
- Ухудшение слуха. Никотин разрушает клетки, в том числе клетки слуховой коры. Это приводит к рассеянности слухового восприятия, а значит – к отсутствию адекватной реакции на внешние раздражители.
- Ухудшение зрения. С самой первой сигареты зрение начинает терять свою остроту и способность воспринимать цвета, повышается чувствительность к свету. Кроме того, никотин повышает внутриглазное давление, поэтому курильщик, а в нашем случае «парильщик», рискует получить такое заболевание, как глаукома. Зрение будет слабеть, и это имеет необратимый характер (может быть исправлено только дорогостоящей операцией). Помимо прочего, могут наблюдаться хронические воспаления зрительного нерва, отслоение сетчатки.
- Ухудшение функционирования щитовидной железы, что, как правило, приводит к гормональному сбою. Таким образом, никотин негативно влияет на развитие половых органов, молочных желез и менструальных циклов у девушек. Продолжающие курить подростки рискуют в дальнейшем получить диагноз «бесплодие».
- Учащается сердцебиение – из-за употребления никотина развивается дисфункция сердечной мышцы, учащаются спазмы сосудов, сосуды теряют эластичность и прочность, внутри формируются атеросклеротические бляшки, повышается объем мышечных волокон сердца. В дальнейшем это приводит к гипертонии. Повышенная жажда, потоотделение, раздражительность
- Болезни кожного покрова. И так не идеальная кожа подростка в сочетании с никотином дает усиливающуюся угревую сыпь, акне, себорею, чрезмерную сухость, пигментацию. Нарушается работа сальных и потовых желез.
- Мощное угнетение центральной нервной системы и головного мозга. Никотин непредсказуемо воздействует на нервную систему. Подросток может становиться более активным и эмоциональным до истерии, либо, напротив, хандрить и впадать в депрессии, но это не все. Под воздействием никотина снижается активность головного мозга, нарушаются нейронные связи. Ухудшается память, происходит регресс в координации движений и развитии мелкой моторики, останавливается развитие практически всех психических познавательных процессов: памяти, внимания, мышления, воображения, а также потеря творческих способностей и навыков.
Все эти проблемы возникают в связи с влиянием на организм подростка никотина. Однако главным аргументов вейперов становится использование курительной жидкости, не содержащей никотина в своем составе. Этот аргумент об отсутствии никотина во вдыхаемых веществах очень популярен, на нем построено множество рекламных кампаний электронных сигарет. К сожалению, при этом совершенно не учитываются другие компоненты смеси, в которую могут входить как стандартные вещества, использующиеся во всех электронных сигаретах, так и синтетические ароматизаторы, в процессе нагревания выделяющие токсичные вещества. Насколько вредны такие смеси?
Рассмотрим их состав подробнее.
- Жидкость в большом объеме содержит пропиленгликоль и глицерин. Позиционируя их как безвредные и даже полезные для организма вещества, производители лукавят. Да, глицерин используют для приготовления многих косметических и лекарственных средств, однако большинство их них не предназначены для приема внутрь. Как правило, это мази и крема, сужающие поры. Пропиленгликоль изготавливается либо из продуктов растительного происхождения (что значительно дороже и, как правило, не по карману подросткам), либо из нефтепродуктов, и является чем-то вроде искусственного консерванта. На клетки органов дыхания человека он воздействует, «консервируя» их в том состоянии, в котором они находятся, и «сужая» их. Возможно, это не критично для взрослого человека, однако у ребенка, у которого все системы организма находятся в состоянии активного развития, дыхательная система буквально перестает развиваться. Пары этого вещества могут вызвать удушье, сформировать предрасположенность к таким болезням, как астма и туберкулез. Глицерин в сочетании с силиконом образует яд. Конечно, влияние этих веществ на организм человека исследовано не до конца, однако незнание их свойств еще более опасно.
- Ментол. В безникотиновых электронных сигаретах обязательно содержится это вещество. Принято считать, что он безвреден, однако ментол оказывает раздражающее действие на нервные окончания. Ментол при попадании на слизистую полости рта вызывает усиленный выброс веществ, влияющих на сердце и сосуды, а точнее – расширяющий их. Именно на этом свойстве ментола основано действие некоторых лекарств, однако при регулярном применении такое воздействие может быть опасно для сердечной мышцы. Частое и резкое нарушение регуляции крови в организме повышает внутрисосудистое давление, увеличивает риск ишемии, стенокардии и инфаркта миокарда даже в юном возрасте. Кроме того, ментол снижает чувствительность нервных окончаний, «замораживает» их, что влияет в том числе на половые органы, снижает возбуждение и, в перспективе, влияет на потенцию.
- Капсаицин – алкалоид, содержащийся в перце чили. В медицине его используют для уменьшения болей в опорно-двигательном аппарате, также капсаицин подавляет раковые клетки при раке простаты. Однако тот же препарат при частом употреблении, а тем более – при употреблении внутрь, способствует развитию рака или язвы желудка, аллергии, многочисленных язв в полости рта. Более того: данный препарат категорически запрещается применять при нарушениях функционирования сердечно-сосудистой системы, а предыдущий компонент курительной смеси, который мы рассматривали – ментол – как раз и провоцирует это нарушение.
- Ароматические добавки. Во-первых, никто из парильщиков не способен контролировать их качество и количество во вдыхаемой смеси. Во-вторых, в большинстве своем эти добавки содержат диацетил. Как правило, этот усилитель вкуса используется при изготовлении сливочных продуктов и при употреблении в пищу его вреда не выявлено. Однако при нагревании и вдыхании паров диацетила повышается риск возникновения фиксированной обструкции дыхательных путей. Более того, доктор Константинос Фарсалинос в 2014 году выяснил, что в жидкостях курительных смесей содержание диацетила во много раз превышает нормы, установленные Национальным Институтом охраны труда и здоровья (NIOSH). 5% курительных смесей содержат диацетил в количестве, превышающем норму в 400 раз. Такая доза вполне может стать для подростка смертельной.
К сожалению, возможности самостоятельно оценить концентрацию того или иного вещества в составе курительной смеси не представляется возможным. Для этого требуется проведение химической экспертизы жидкости, а стоимость её очень высока. Более того, указанная на упаковке экспертиза курительных жидкостей не гарантирует того, что в дальнейшем эти жидкости будут соответствовать составу, указанному в проведенной химической экспертизе.
Помимо общего вреда каждого из компонентов, электронные сигареты вызывают психологическую зависимость. Изначально придуманные как средство для избавления от никотиновой зависимости, у подростков они её вызывают.
Подростки-вейперы зачастую переходят на обычные сигареты: нехватка денег на смесь, недостаточно сильные ощущения от электронной сигареты.
Важным фактором становится постепенное ухудшение качества компонентов электронных сигарет, большое количество подделок. Ароматизаторы, изготовленные из натуральных компонентов, не так вредят организму, как полностью химические соединения, изготовленные с применением добавок, вызывающих привыкание. Дети, не имеющие своего источника дохода и, как правило, скрывающие от родителей свою привычку, не могут позволить себе покупку дорогого оригинала и используют дешевые аналоги. Данные устройства в нашей стране продаются без особого контроля за качеством, не имеют лицензий и сертификатов. В связи с этим возможность приобретения подделки становится крайне высокой даже для взрослого человека.
Данных о долговременном воздействии электронных сигарет пока не существует, так как они всего несколько лет назад вошли в обиход. Однако вопрос о том, безопасны ли они для детского организма, можно считать однозначно решенным: нет, они небезопасны. Четких указаний в антитабачном законе по этому поводу нет.
Помимо вреда, причиняемого курильщику, испарения от электронных сигарет остаются вредными для находящихся рядом с ним людей. Пассивное воздействие на детей и подростков электронных сигарет остается таким же вредным, как и обычных. Энтуазисты Школы общественного здоровья Блумберга при Университете Джона Хопкинса провели эксперимент, в ходе которого было установлено, что «мыши, на протяжении двух недель имевшие возможность активно и пассивно «втягивать» в себя испарения электронных устройств, стали на редкость неустойчивы к инфекциям и погибли от инфицирования самой простой формой гриппа». Врачи предполагают, что, то же самое происходит с детским организмом. Кроме того, составляющие курительной смеси вызывают сильную аллергию. Психологи рекомендуют родителям не оставлять электронные сигареты на видных местах, не использовать их при детях и подростках.
Подведем итоги:
- В курительной смеси для электронной сигареты содержатся вещества, вредные для растущего организма, в том числе канцерогены, токсичные вещества.
- Заявление о «безвредности» электронных сигарет, их альтернативности курению является не более чем маркетинговым ходом.
- В настоящий момент не существует закрепленных стандартов, которые регламентировали бы осуществление контроля за составом и качеством никотиновых и без никотиновых смесей, в связи с чем заявленное на упаковке количество того или иного компонента далеко не всегда соответствует реальности.
- Увеличение количества вейперов выгодно производителям как электронных, так и обычных сигарет, так как многие люди, начинающие курение с электронных сигарет, впоследствии переходят на обычные.
- Происходит рост числа подростков-вейперов, которые не пробовали курить обычные сигареты, пока не узнали о «безвредной» альтернативе.
- Информация о вреде электронных сигарет нова, и потому не всем известна. В связи с этим не все родители запрещают подросткам использовать электронные сигареты, а некоторые даже поощряют это увлечение, уверенные в его безопасности.
Эксперты: электронные сигареты содержат канцерогены и ведут к эпидемии никотиновой зависимости
Основные производители электронных сигарет и прочих подобных устройств — крупные табачные корпорацииФото: Виктор ГУСЕЙНОВВ конце февраля председатель правительства Дмитрий Медведев дал поручение вице-премьеру Татьяне Голиковой. Если упростить юридические формулировки, суть звучала так: приравнять электронные сигареты и другие средства для употребления никотина к традиционным сигаретам. На практике это значит: запретить рекламу, торговлю в киосках вблизи школ, ввести маркировку об опасности для здоровья, а также ограничить курение электронных сигарет в общественных местах (подробнее см. ниже).
Поскольку сейчас Минздрав разрабатывает антитабачную концепцию на 2019 — 2035 годы, то поручение премьер-министра оперативно включили в этот документ. «Поправки уже внесены на рассмотрение правительства», — сообщил, выступая в Совете Федерации, замминистра здравоохранения Олег Салагай.
НАША СПРАВКА
«Электронные сигареты и другие средства для употребления никотина» можно разделить на две разновидности: электронные средства доставки никотина (ЭСДН) и системы нагревания табака.
— Системы нагревания табака — это аналог курительной трубки, поясняют специалисты. В такое устройство вставляются минисигареты (стики), которые нагреваются. Это табачные изделия. А систему нагревания табака можно рассматривать как современную курительную принадлежность, считают эксперты.
— Электронные средства доставки никотина (ЭСДН) — это устройства, нагревающие жидкость. В ней нет табачного листа, но есть никотин, вызывающий зависимость, и другие канцерогены. Смесь там совсем небезобидная, говорят специалисты. Содержание некоторых веществ идентично их содержанию в сигаретах. Кроме того, как процесс использования таких устройств, так и они сами имитируют табачные изделия и процесс курения табака. Рамочная конвенция ВОЗ говорит о том, что необходимо принимать меры для предотвращения возникновения никотиновой зависимости. Поэтому ЭСДН вполне обоснованно регулировать с помощью тех мер, которыми регулируются табачные изделия, подчеркивают эксперты по здравоохранению.
РАЗВЕ ОНИ ОПАСНЫ?!
Основные производители электронных сигарет и прочих подобных устройств — крупные табачные корпорации, например, British American Tobacco, Филип Моррис Интернэшнл. Их представители утверждают, что от ЭСДН вреда существенно меньше, это доказано исследованиями. В электронных сигаретах нет табака. Словом, можно добиться серьезных успехов в борьбе с курением, переводя курильщиков на менее вредную форму употребления никотина, убеждают производители ЭСДН. И бросают упрек разработчикам антитабачной концепции: вы сначала докажите, что курить вейпы и другие устройства вообще вредно. Или как минимум вреднее, чем обычные сигареты.
— ЭСДН однозначно вредные, они содержат канцерогены. Это признано высшим международным органом в области охраны здоровья — Всемирной организацией здравоохранения, — пояснил «КП» эксперт по антитабачному законодательству, член Координационного совета по борьбе против табака при Минздраве России Виктор Зыков. – Кроме того, сравнивать их вред и вред сигарет некорректно. Никто не может предугадать, как часто, с какой интенсивностью курильщик будет использовать ЭСДН.
ВОЗ рекомендует всем странам приравнять регулирование оборота и употребления электронных сигарет к табаку, потому что: а) эти устройства содержат никотин, б) они предназначены для курения, то есть такого же употребления, как и обычные сигареты, 3) выпуск таких устройств преследует цели поддержки зависимости людей от никотина либо приобщения к курению новых потребителей, в том числе молодежи. Поэтому электронные сигареты и прочие устройства должны регулироваться с помощью тех же мер, которые уже доказали свою эффективность для ограничения употребления другой табачной продукции, заключает эксперт.
Электронные сигареты содержат канцерогены и ведут к эпидемии никотиновой зависимостиФото: Виктор ГУСЕЙНОВМИНЗДРАВУ ПРИДЕТСЯ СРАЖАТЬСЯ
Специалист по здравоохранению настроен категорично: «Очень важно принимать меры (приравнять ЭСДН к табаку. — Авт.) в том числе потому, что практически все производства средств для доставки никотина уже давно скупила табачная индустрия. Распространение ЭСДН сегодня используется табачными корпорациями, чтобы подорвать успешно реализуемую политику антитабачных мер во всем мире, — считает Виктор Зыков. — Меры против табака приносят успех, люди бросают курить, и табачники используют ЭСДН, чтобы предотвратить потерю своих клиентов и привлечь новых».
— Виктор, скептики говорят: поскольку табачное лобби и так упустило многие позиции (запрет на рекламу табачных изделий, повышение акцизов и др.), то маловероятно, что у нас в стране в ближайшее время удастся пробить такие суровые меры в отношении электронных сигарет. Как вы оцениваете шансы?
— Будем надеяться, что все-таки сыграет свою роль решение председателя правительства. Еще несколько лет назад, когда принимался антитабачный закон, Дмитрий Медведев говорил, что правительство России сильнее табачных компаний. Вот теперь и посмотрим — кто сильнее.
БУДЬ В КУРСЕ
Пять основных ограничений, которые «светят» вейперам и производителям электронных сигарет
Если электронные средства доставки никотина приравняют к табачным изделиям, то будут применяться меры, предусмотренные антитабачным законом. А именно:
1) запрет на курение в общественных местах. При курении вейпов окружающие, может, и не страдают от дыма, как при курении табака, однако так же подвержены воздействию канцерогенов. Кроме того, как показала практика, такой запрет стимулирует людей вообще отказываться от курения в любом виде — чтобы не бегать постоянно на улицу, отрываясь от ужина, важной или приятной беседы и т.д.
2) введение акцизов для всех электронных средств доставки никотина;
3) маркировка, предупреждения о вреде здоровью;
4) запрет на рекламу и спонсорство мероприятий производителями ЭСДН;
5) ограничение доступности путем регулирования торговли.
Вред жидкости без никотина | Статьи REDAVAPE.RU
Электронная сигарета была изобретена в начале нулевых годов в Китае. И с тех пор много что изменилось в мире электронного пара. Сами устройства пережили большое техническое развитие, а вокруг вейпинга развилась огромная международная индустрия со своими особенностями и правилами.
Несмотря на большую популярность и спрос на электронные сигареты и все, что с ними связано, не утихают споры ученых о вреде этого явления на организм человека. Для начала стоит уточнить, что электронная сигарета была создана как современный и самый действенный метод борьбы с курением и рассматривать вред вейпинга стоит именно с позиции сравнения с использованием обычной сигареты. Тут все исследовали и ученые приходят к одному выводу — парить намного безопаснее (на 95%), чем курить. Это касается как самого вейпера, так и окружающих пассивных парильщиков.
Чтобы оценить истинный вред вейпинга прошло еще недостаточно времени, об этом мы узнаем в обозримом будущем. А пока можно располагать только имеющейся информацией, которую уже успели собрать исследователи. Сегодня мы можем оценить вред исходя из известных всем качеств компонентов, которые входят в состав вейп-жидкости.
Состав жидкости для парения
Зайдя в вейп-шоп или любой специализированный интернет-магазин можно столкнуться с большим разнообразием жидкостей для вейпа. Прилавки пестрят всевозможными вкусовыми миксами от производителей из всех уголков мира. Но несмотря на это все жижи имею очень схожий состав, различие в котором заключается только в ароматизаторах.
Любая жидкость замешивается на основе из глицерина (VG) и пропиленгликоля (PG), в которую добавляется никотин и микс из ароматизаторов. Никотин не является необходимым ингредиентом и используется только если сам парильщик чувствует в нем необходимость. Существует огромное количество безникотиновых жидкостей — нулёвок.
Нулёвки — безникотиновые жидкости
Если в случае с жидкостями с никотином всем ясно что именно больше всего вредит организму, то когда речь идет о жидкостях без него, появляется новый вопрос — какой вред оказывает нулёвка здоровью парильщика.
Для начала давайте разберемся для чего вообще существует жидкость без никотина. Во-первых, нулёвки — это та финальная стадия к которой должен прийти каждый, кто решил бросить курить с помощью электронной сигареты. Цель — постоянно понижать количество потребляемого никотина до нуля и потом полный отказ от вдыхания любого дыма или пара.
Во-вторых, с развитием вейп-индустрии появились такие явления как клаудчейзинг (соревнования по выдыханию максимально больших облаков пара) и вейп-триккинг (трюки с кольцами пара). Практически все клаудчейзеры и трикстеры используют именно нулёвки чтобы причинять организму минимальное количество вреда.
Вред от безникотиновых жидкостей
Рассмотрим каждый из входящих в нулёвки ингредиент в отдельности. Начнем с пропиленгликоля. Пропиленгликоль (PG) тягучая жидкость, без запаха и со слегка сладким вкусом. Используется в медицине, косметологии и пищевой промышленности. В жидкости для вейпа пропиленгликоль используется как база, которая растворяет в себе остальные компоненты (никотин, ароматизаторы) и является их проводником в организм, за счет того, что сам по себе очень легко рассасывается. PG в разумных количествах не вреден и не токсичен. Но передозировка им может вызвать аллергию, сухость во рту и кашель.
Глицерин (VG) уже много лет повсеместно используется в пищевой и косметической промышленности. Практически на каждой кухне можно найти хотя бы пару вещей, в состав которых входит глицерин. В жидкости для парения глицерин отвечает за пар: чем его больше, тем больше густого пара образуется в процессе. Сам по себе глицерин нельзя назвать вредным для здоровья. Но, как и в случае с пропиленгликолем, если переборщить в VG можно схватить обезвоживание, мигрени, аллергию и другие не очень приятные побочные эффекты.
Ароматизаторы — это визитная карточка жидкости. Сегодня чаще всего парильщики выбирают ту или иную жижу исходя из ее вкуса. Ароматизаторы бывают как натуральные (из растительных добавок), так и полностью состоящие из химических добавок. Если вы приобретаете жидкость от известной фирмы, а не кустарного производителя, можно быть уверенным в качестве ароматизаторов, использованных в производстве этой жижи.
Итог
Подводя итог скажем что назвать жидкость как с никотином, так и нулевку полностью безвредной не получится. Но определенно это меньшее зло, чем сигареты. А если говорить именно о безникотиновых жижах, то тут вред организму сведен к минимуму. Главное относиться к вейпингу со всей ответственностью и не парить без перерыва. Мера важно во всем и всегда.
Какие бывают жидкости для электронных сигарет, и чем они отличаются?
Жидкость для электронных сигарет представляет собой смесь двух основных компонентов: пропиленгликоля (PG) и глицерина (VG).Дополнительно в смесь может добавляться:
- небольшое количество никотина, для обеспечения “удара по горлу” и “накурки”;
- дистиллированная вода (AD), для повышения текучести, лучшего смешивания и снижения общей температуры нагрева;
- пищевой ароматизатор, для придания желаемого вкуса. Это, хоть и не обязательно, но приятно.
Виды жидкостей для электронных сигарет:
Жидкости бывают готовыми, выпущенными производителями и самостоятельно приготовленными — самозамес. В готовых жидкостях на этикетке положено указывать состав, но зачастую производители просто указывают соотношение основных компонентов, прикрываясь наличием коммерческой тайны.Соотношение компонентов жидкости для электронных сигарет может быть различным: обычно на этикетках указывается процентное соотношение двух компонентов, в сумме дающее 100%. Например, для премиального сегмента готовых жидкостей принято соотношение 30/70. Это значит, что жидкость на 70% состоит из глицерина, к которому добавлено 30% пропиленгликоля.
Принципы подбора жидкости:
Одним из важных принципов подбора жидкости для электронных сигарет является ее густота, чаще употребляемый термин — текучесть. Чем гуще жидкость, тем тяжелее ей пропитывать фитиль спирали, но тем больше пара будет при ее нагреве. Больше пара — больше расход жидкости.Глицерин — самый густой компонент, чем его больше, тем гуще полученная смесь, при этом стоит учесть, что он хуже передает вкус ароматизаторов. Именно поэтому в жидкость добавляются пропиленгликоль или вода, позволяющие снижать густоту глицерина и улучшать смешивание с другими компонентами. Кроме усиления текучести, пропиленгликоль лучше раскрывает вкус ароматизаторов: чем его больше, тем меньшее количество ароматизаторов нужно добавлять в жидкость для парения.
Для атомайзеров, рассчитанных для использования с массивными спиралями, широкими проточками для поступления жидкости на спираль (Loop RDA, Medusa Reborn RDTA), стоит подбирать густые жидкости, с преобладающим содержанием глицерина, иначе — переливов и хлюпанья не избежать.
Для устройств относительно компактных, с небольшими испарительными камерами и капельной системой питания хвостов фитилей (Kayfun 5, Berserker MTL RTA), напротив — с преобладанием пропиленгликоля, для них важна большая текучесть.
Важна и температура окружающего воздуха: чем теплее, тем больше текучесть жидкости, чем холоднее — тем меньше.
Ароматизаторы и их количество:
Для электронного парения применяют пищевые ароматизаторы, растворимые в воде. Бывают натуральными и искусственными. Определить искусственность или натуральность, без наличия специального оборудования, практически невозможно. В этом вопросе чистота, а, главное — поведение при нагреве, имеют большее значение.При покупке готовой жидкости, вид и количество добавляемого ароматизатора зависит от рецепта, разработанного производителем. При самостоятельном смешивании следует ориентироваться на рекомендуемые производителем дозы. Ответственные производители, как правило, указывают на своих официальных сайтах рекомендованные дозы в процентном соотношении и количественном — миллилитрах на определенный объем.
Стоит следовать принципу: чем меньше ароматизатора в жидкости, тем лучше. Начинайте добавление ароматизаторов с меньшей рекомендуемой дозы.
Никотин и дозировка:
Главное требование к никотину — высокая степень очистки. Никотин бывает натуральным и солевым. Натуральный получают из растительного сырья — табачных листьев, солевой — в лабораторных условиях, смешивая натуральный с солями.Никотин в жидкости отвечает за горловой спазм и чувство “накурки”, создает вкусовой фон при использовании табачных ароматизаторов. В готовых жидкостях содержание может варьироваться от 1 до 24 мг/мл, больше — не стоит использовать. Чем больше концентрация, тем сильнее горловой спазм, тот самый ТХ, который так ищут новички в парении. Из-за отсроченного во времени воздействия на организм, следует соблюдать особую осторожность. Высокие дозы могут приводить к резкому ухудшению самочувствия: сухость во рту, ускоренное сердцебиение, повышение давления, головокружение. Если наблюдаются такие состояния, следует прекратить парение и пить больше воды.
При самостоятельном приготовлении жидкости нужно понимать, каким образом рассчитать количество никотина, добавляемого в жидкость. Для этого лучше использовать соответствующий калькулятор. Если проценты в калькуляторе не понятны — приобретать готовую базу с никотином, которая требует только добавления ароматизатора в нужной пропорции.
Солевой никотин:
Новомодный солевой никотин получил широкую известность недавно, хотя в западном сообществе любителей пара был известен еще пару лет назад. Получают его путем смешивания натурального никотина с солями. В результате получается раствор, который лучше взаимодействует с организмом человека, чем просто никотин.В отличие от обычного, солевой никотин очень быстро усваивается организмом, имеет более мягкое воздействие на горло, даже при высоких концентрациях. Все это приводит к ускоренной “накурке”, которой особо не хватает новичкам, да и более опытным любителям электронных сигарет. При этом он медленнее выводится из организма, что позволит снизить частоту перекуров. Важно делать длительные перерывы при вдыхании, чтобы не пропустить момент насыщения, и не находиться долго в стадии пресыщения. Все же он обладает сильным тонизирующим эффектом, учащая сердечный ритм и повышая давление.
Как лучше использовать солевой никотин:
Если ранее наблюдалась гонка мощностей, приводящая к увеличению размеров батарейных блоков и вместимости атомайзеров, то с приходом солевого никотина начался медленный возврат к маломощным форматам устройств для парения: маленьким, узким, с небольшим встроенным аккумулятором, испарителем малой ёмкости — POD устройствам. Они предназначены для использования в течение небольшого промежутка времени для быстрого насыщения организма никотином.При этом владельцам массивных устройств для парения не стоит отчаиваться: солевой никотин может также использоваться и в мощных устройствах, как обслуживаемых, так и нет. Просто стоит его правильно дозировать, в пределах 5-20 мг/мл, и не поднимать мощность слишком высоко. Диапазон в 10-15 Ватт будет вполне достаточным. Скорее всего, придется вводить несколько больший процент ароматизатора в готовую жидкость, ведь соли, добавленные в никотин, приглушают яркость вкуса ароматизатора.
Стоит понимать: чем больше объем вдыхаемого пара, тем большая доза никотина поступает в организм. Будьте благоразумны.
«Безникотиновые электронные сигареты так же опасны для здоровья, как и содержащие никотин» — «Ингушетия» — интернет-газета
Безусловно, технический прогресс — это замечательное явление, которое делает нашу с вами жизнь проще и в некоторых моментах намного удобнее. К сожалению, далеко не все новшества можно назвать полностью безопасными или полезными. Электронные сигареты могут послужить ярким тому примером.
С одной стороны, это изобретение позволяет заядлым курильщикам «дымить» везде, где им вздумается, невзирая на запреты. Но вот с другой стороны, есть достоверные данные о том, что они наносят не меньший, а в некоторых случаях и больший вред здоровью как самого курящего, так и окружающих его людей.
Что это такое — электронные сигареты, и почему они вредны? Что будет, если курить их постоянно, и какой вред устройство наносит здоровью человека? На эти и другие вопросы в интервью газете «Ингушетия» ответила главный врач республиканского управления МЧС Мадина Тариева.
Вапорайзер, или вейп
— Мадина Увайсовна, что такое электронные сигареты?
— Электронная сигарета, парогенератор, вапорайзер, или вейп — это устройство, которое создаёт высокодисперсный аэрозоль, простыми словами пар, предназначенный для вдыхания. Пар генерируется из специальной жидкости, которая испаряется при нагревании. Внешне устройство может быть схоже как с сигаретой, так и с электронной трубкой для курения.
Конструкция электронного парогенератора проста и состоит из двух основных частей: батарейного блока, который обеспечивает работу устройства и атомайзера, или испарителя, состоящего из фитиля и нагревательного элемента. Испаритель предназначен для равномерной подачи жидкости к нагревательному элементу.
— Есть ли никотин в электронной сигарете?
— Да, если вы выбираете никотинсодержащую жидкость для использования. Также есть безникотиновый вариант использования устройства, когда курильщик вдыхает исключительно ароматизированный пар.
Хотя номинально жидкость для заправки вейпа не входит в конструкцию устройства, без нее процесс парогенерации просто невозможен. Как правило, в состав жидкостей входят следующие соединения: глицерин — это обязательный компонент, необходимый для образования пара, пропиленгликоль, вода дистиллированная, никотин (в безникотиновой жидкости отсутствует), красители используются для придания жидкости цвета и ароматизаторы отвечают за аромат и вкус.
В зависимости от соотношения ингредиентов выделяют четыре основных вида жидкостей для заправки. В составе классической в равных долях содержатся глицерин и пропиленгликоль. «Бархатное облако» состоит на 80% из глицерина и на 20% из воды, данный вид заправляют для получения большого количества пара, он подходит тем, кто не может курить жидкости, содержащие пропиленгликоль. «Ледяное лезвие» состоит на 5% из воды и на 95% из пропиленгликоля, такой вид подходит курильщикам, которые предпочитают чувствовать ярко выраженный табачный вкус. И жидкость, состоящая на 70% из глицерина и на 30% из пропиленгликоля, считается самой популярной и широко распространенной.
Жидкость для вапорайзера может содержать до 3,6% никотина. Как правило, на этикетке будет указана ее крепость.
Количество никотина, содержащееся в одной затяжке электронной сигареты, зависит не от концентрации вещества в жидкости, а от мощности испарителя. Чем больше пара генерируется (то есть чем интенсивнее затягивается человек), тем больше никотина поступает в организм за одну затяжку. Как правило, заядлые курильщики используют сначала очень крепкие жидкости для курения, со временем переходя на более легкие.
— Каков принцип работы электронной сигареты?
— Для начала отмечу, что тех, кто курит обычные сигареты, называют курильщиками, а тех, кто предпочитает электронные, — парильщиками. Многие забывают, что перед тем как начать самостоятельное использование устройства, следует ознакомиться с инструкцией. И, поверьте, это не пустые слова.
Ведь вапорайзер — это электроприбор, которым нужно уметь пользоваться и тем более знать, как его обслуживать. По своей сути вейп — это ингалятор. Правда, между этими приборами есть одна существенная разница. Пар в ингаляторе вырабатывается за счет повышенного уровня давления, а в электронной сигарете путем испарения жидкости при работе нагревательного элемента.
Обычно новичков интересует два основных момента в работе устройства — как его заправлять и как правильно курить. Для того чтобы выкурить обычную сигареты, ее нужно просто поджечь, а сгорание табака сделает свое дело и даст курильщику так необходимую ему дозу никотина. При работе вапорайзера происходит нагрев специальной жидкости, от которой и вырабатывается пар.
— Бывают случаи, когда электронные сигареты заправляют алкогольными напитками?
— Да. В некоторых случаях это плачевно заканчивалось, потому что устройство моментально воспламенялась и взрывалось.
Вейп или сигарета
— Какой вред электронные сигареты наносят здоровью человека?
— Прежде чем отвечу, вредна ли электронная сигарета для организма человека, совершим небольшой экскурс в историю. Ведь мало кто знает, что первый патент на изобретение парогенератора был подан еще 1963 году, но официальной датой рождения вейпа считается 2004 год.
Электронные сигареты всегда преподносились и сейчас преподносятся производителями как наиболее безопасная альтернатива обычным табачным изделиям. Рекламщики делали ставки еще и на тех людей, которые хотели бы бросить курить. Предполагалось, что польза электронных сигарет заключается в том, что они помогают избавиться от никотиновой зависимости. Однако еще в 2008 году Всемирная организация здравоохранения заявила, что нет никакой научной обоснованности заявлений производителей насчет того, что их товар эффективен в никотинозамещающей терапии.
Мало того, специалисты в один голос утверждали, что вредность электронной сигареты ничуть не меньше. Доклад ВОЗ на конференции, посвящённой борьбе против табака, в 2014 году прозвучал жестко и бескомпромиссно, он полностью развенчал мифы о пользе электронных сигарет. К тому же был сделан акцент на их опасности для здоровья. В итоге, было принято решение о том, что следует запретить свободную продажу жидкостей с различными вкусовыми добавками, так как они повышают привлекательность вейпов. Это означает, что самая авторитетная организация в мире, занимающаяся здравоохранением, утвердительно ответила на вопрос о том, вредны ли электронные сигареты для здоровья.
К тому же, на той же конференции ВОЗ выразила обеспокоенность тем, насколько популярными стали электронные сигареты в подростковой среде. Ранее никогда не курившие дети решаются попробовать их, как более безопасную альтернативу обычным табачным изделиям. Что еще более печально, многие родители сами приобретают вейпы для своего ребенка, думая, что таким образом они уберегут свое ненаглядное чадо от еще большей опасности.
К сожалению, далеко не все взрослые люди сами задаются вопросом о том, опасны ли для здоровья электронные сигареты, и насколько вредна жидкость для их заправки, что уж говорить о подростках.
— Какой вред от электронных сигарет с жидкостью?
— Главная опасность вапорайзеров кроется в составе жидкости для их заправки, в которой содержатся мощные канцерогены нитрозамин и диэтиленгликоль. Ученые доказали, что их содержание примерно в десять раз больше, чем в обычных сигаретах. Это формальдегид, ядовитое и высокотоксичное соединение, отравление которым может закончиться летальным исходом, ацетальдегид — канцероген, который не только отравляет организм, но и формирует привыкание к курению, а также повышает риск развития болезни Альцгеймера.
Ко всему прочему специалисты выявили в подавляющем большинстве случаев явное несоответствие в фактическом содержании никотина в жидкости для вейпа и заявленном производителем. Важно подчеркнуть, что концентрация всех вышеперечисленных соединений в разы увеличивается при перегреве электронной сигареты.
Также электронные сигареты — это устройства повышенной опасности, которые при неправильном использовании могут взрываться или воспламеняться, так как жидкость для заправки вейпа также крайне опасна, особенно для детей. В составе сменного картриджа для электронной сигареты содержится доза никотина, смертельная для взрослого человека. Поэтому для ее хранения следует использовать особо прочную упаковку.
Также необходимо отметить, что никотин, входящий в состав жидкостей для вейпа, относится к нейротоксинам и алкалоидам, которые формируют стойкую физическую и психическую зависимость, что перечеркивает все доводы о пользе электронных сигарет в борьбе с никотиновой зависимостью.
Вапорайзеры так же, как и обычные табачные изделия, увеличивают риск развития заболеваний, характерных для курильщиков.
Из курильщика в парильщика
— Есть не только никотинсодержащие жидкости, но и безникотиновые сигареты. Вредны ли они для здоровья человека?
— Представим себе такую ситуацию. Человек твердо решил бросить курить, но чтобы этот процесс прошел как можно более легко и безболезненно для его здоровья и психики, он решает прибегнуть к помощи вапорайзера и выбирает жидкость для электронных сигарет без никотина. Как утверждают производители, именно такое устройство будет абсолютно безопасным и подходит для всех и каждого. Однако даже ярые сторонники безникотиновых жидкостей признают, что и в них есть свои отрицательные моменты.
Главный плюс таких вапорайзеров заключается в относительной безопасности в сравнении с классическими табачными изделиями. Давно доказано, что обычные сигареты вредны не только из-за никотина. Продукты горения и смолы наносят непоправимый урон как легким самого курильщика, так и людям, его окружающим.
Что касается электронных сигарет, то их можно курить в общественных местах, именно поэтому они стали резко популярны. Такое устройство удобно использовать. От электронных сигарет нет противного запаха, ведь жидкость для их заправки может источать приятные обволакивающие ароматы. К тому же вапорайзеры доступны по цене и помогают сэкономить. Курильщику приходится каждый день приобретать сигареты. Вейп же покупают один раз и заправляют жидкостями, которых хватает надолго, и стоят они в среднем не дороже обычной пачки сигарет.
Правда, есть одно жирное «но». Человек не перестает быть курильщиком, он становится парильщиком. То есть меняет обычную сигарету на электронную. Зависимость при этом никуда не исчезает.
Жидкости без никотина все равно содержат пропиленгликоль, который при нагревании негативно влияет на органы дыхания, а также способствует развитию или обострению многих тяжелых заболеваний (астма, отек легких, бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких, аллергия, бронхоспазм). Более того, содержащийся в безникотиновых жидкостях глицерин наносит вред кровообращению.
На первый взгляд полностью безопасный состав жидкости для электронных сигарет без никотина трансформируется в сильные ядовитые соединения (канцерогены, альдегиды) при температурном воздействии.
Из всего вышесказанного напрашивается только один вывод — курить безникотиновые электронные сигареты так же опасно для здоровья, как и содержащие никотин. Помимо того, при длительном использовании они наносят вред не меньший, чем обычные сигареты из табака.
— Что вреднее — электронные или обычные сигареты — для здоровья человека? Как говорится, что лучше выбрать из двух зол?
— Новомодные и абсолютно неизученные вейпы, реальное влияние которых на организм может проявиться во всей красе только через несколько поколений парильщиков или хорошо всем известные и действительно крайне вредные табачные изделия.
Сторонники вапорайзеров однозначно отвечают на вопрос о том, что вреднее: обычные сигареты или электронные. И аргументируют это тем, что состав жидкости для электронных сигарет содержит в тысячи раз меньшее количество компонентов в отличие от табака, который при горении еще и вырабатывает дополнительные вредные соединения. Также они считают, что при парении не наносится вред окружающим людям (так называемый эффект «пассивного курильщика»). Другое дело, что люди все равно могут испытывать дискомфорт от дыма или ароматизаторов. Электронные сигареты можно курить везде, так как они не запрещены законом к использованию в общественных местах. Парогенераторы не вызывают у парильщика приступов кашля и не провоцируют возникновение желтого налета на зубах, а также на коже пальцев рук. Широкий выбор жидкостей для заправки вейпов дает парильщику возможность самостоятельно регулировать количество никотина, вкус, а также аромат. Электронные сигареты выгоднее и экономичнее, чем обычные табачные изделия.
Ученые и медики абсолютно не поддерживают доводы парильщиков, хотя и принимают некоторые плюсы электронных сигарет и не берутся однозначно утверждать, что вейпы и никотинсодержащие жидкости вреднее обычных сигарет. К сожалению, на вопрос о том, какие менее вредны сигареты, а какие более, нет однозначного ответа. Все дело в том, что в принципе курение или парение наносит организму человека непоправимый вред. Поэтому лучше сто раз подумать, чем попасть в пожизненную зависимость от обычной или электронной сигареты.
P. S. Депутаты Народного собрания Ингушетии рассмотрели предложение республиканской прокуратуры о запрете продажи для несовершеннолетних электронных сигарет и другой продукции и ввели ограничения на их покупку на территории региона.
Электронные сигареты вредны для здоровья
Курение электронных сигарет далеко не столь безопасно для здоровья, как порой утверждается. Что бы там ни писали производители электронных сигарет, но они как-то обходят стороной вред от никотина. При курении электронных сигарет никотин также попадает в легкие и быстро всасывается в кровь. Уже через 8 с после затяжки электронной сигареты он попадает в мозг. И только через 30 мин после прекращения курения электронной сигареты концентрация никотина в головном мозге начинает снижаться, так как он начинает распределяться по всем тканям и органам в организме. Способность никотина связываться с холинергическими и никотиновыми рецепторами центральной нервной системы и другими структурами, активировать опиоидные рецепторы мозга обусловливает возникновение пристрастия к никотину. Никотин является одной из причин, приводящих к болезни Бюргера.
Производители электронных устройств уверяют, что внутри — безвредное вещество, чуть ли не чистый водяной пар. Всемирная организация здравоохранения на этот счет имеет совершенно противоположное мнение. В докладе «Об электронных системах доставки никотина» ВОЗ сообщается, что «аэрозоль ЭСДН (электронные системы доставки никотина) не является всего лишь «водяным паром», как это часто утверждается».
Эксперты установили, что основными компонентами раствора, помимо никотина, являются пропиленгликоль, глицерин, ароматизирующие вещества, формальдегид и другие, вызывающие рак, вещества.
Вред электронной сигареты для здоровья
Вред от электронных сигарет можно условно представить, как два фактора: составные части жидкостей и неправильное использование устройства. По второму спорных вопросов нет. Вред электронных сигарет, разогретых слишком сильно, доказан. При высокой температуре жидкость превращается в мелкодисперсный пар, оседающий в лёгких. Чтобы этого не произошло, контролируйте температуру устройства. В любой жидкости обязательно присутствуют глицерин и пропилен гликоль, продукты испарения которых оказывают влияние на разные органы человека.
Электронные сигареты — вред для лёгких
Из полностью доказанных проблем со здоровьем, вызываемых парением, самым известным является облитерирующий бронхит или попкорновая болезнь. На первый взгляд название забавное, ассоциирующееся с фильмами и лопающимися на сковородке зёрнами кукурузы, но это серьёзное заболевание. Неофициальным названием оно обязано фабрикам по производству жареной кукурузы. До появления электронных сигарет болезнь встречалась только среди их работников.
Вызывает облитерирующий бронхит диацетил — химическое соединение, которое в синтезированном виде используется в производстве пищи и в ароматизаторах для вейпа. Съеденный диацетил безвреден. Но вдыхать его долгое время не рекомендуется. Попкорновая болезнь в худшем варианте может привести к необходимости пересадки лёгкого.
Симптомы:
- одышка;
- кашель, заметный сначала при движении, затем и в состоянии покоя;
- хрипы;
- кровавая мокрота.
При длительном употреблении диацетила может проявиться синюшность кожи. Также облитерирующий бронхит приводит к патологиям сердца. Вред электронных сигарет для лёгких ниже, чем обычных, но и абсолютно безопасными их нельзя назвать.
Влияние электронной сигареты на желудок
Потребление никотина любым способом, независимо от того, курение это или парение, категорически противопоказано при заболеваниях желудка и сопутствующих. Это вещество усиливает выделение соляной кислоты, разрушающей стенки желудка. И косвенно влияет на состояние пищеварительной системы, снижая аппетит. В результате человек начинает делать длительные перерывы между приёмами пищи, что запрещено людям с больным желудком.
Вред электронных сигарет с жидкостью, в которой нет никотина, не исчезает. Производители добавляют в «нулевые жидкости» спирт, ментол, капсаицин. Это делает вкус безникотиновой жидкости более привычным для потребителей. И оказывает на желудок воздействие, аналогичное действию никотина.
Влияние электронных сигарет на сосуды
Какой вред от электронных сигарет могут получить сосуды:
- потребление никотина вне зависимости от формы его получения ускоряет частоту сердечного ритма;
- согласно исследованию доктора Холли Мидклофф потребители электронных сигарет подвержены тем же заболеваниям сосудов, что и курильщики.
Вредно ли курение электронных сигарет для окружающих?
Принцип работы вапорайзера не предполагает горения и выброса в окружающее пространство его продуктов. Но это полностью не решает проблему «пассивного курения». Вред электронных сигарет окружающим не изучен, но уже сейчас можно утверждать, что как минимум два неприятных момента присутствуют.
- Сам пар. Густой, ароматный, окутывающий парящего белым облаком. Он приятен далеко не всем. А у некоторых людей вполне может быть резкая или аллергическая реакция на химические ароматизаторы.
- При использовании вейпа испаряется жидкость, заправленная в устройство. Из её мельчайших частиц состоит пар, вдыхаемый и выдыхаемый вейпером. Логично предположить, что, если в процессе нагревания компонентов жидкости выделяются какие-то вредные вещества, то они попадают в организм каждого человека, вдохнувшего такой пар.
По материалам интернета
На вейпах могут появиться предупреждения Минздрава
Не использовать в вейпах и электронных сигаретах ароматизаторы, запретить их рекламу и продвижение в качестве средства для тех, кто хочет бросить курить, — такие рекомендации вошли в доклад Всемирной организации здравоохранения «О глобальной табачной эпидемии 2021 года», опубликованном 27 июля.
В Минздраве уже заявили о готовности ввести некоторые из обозначенных в докладе мер. Какая судьба ждёт устройства для курения и «парения» в России и почему они вовсе не безобидны — в материале «Парламентской газеты».
Проблема не в табаке, а в никотинеВ 2003 году ВОЗ приняла Рамочную конвенцию по борьбе с табаком. Она содержит предложения по снижению продаж и спроса на табачную продукцию. К конвенции присоединилось полторы сотни стран, к настоящему моменту хотя бы одной из антитабачных мер охвачено 5,3 миллиарда человек.
«Но мы далеки от победы. Больше чем миллиард человек во всём мире все ещё курят», — констатировал в докладе глобальный представитель ВОЗ по неинфекционным заболеваниям и травмам Майкл Блумберг. По его словам, продажи сигарет серьёзно упали, но табачные компании стали активно продвигать новые продукты — электронные сигареты, вейпы, системы нагревания табака и так далее. «Их цель проста: зацепить другое поколение за никотин. Мы не можем этого допустить», — отметил он.
Поэтому в докладе ВОЗ акцент сделан именно на борьбу с электронными системами доставки никотина (ЭСДН). Во многих странах они не подпадают под действие антитабачных норм: в них нет конкретно табака, а есть выделенный из него или синтезированный никотин в виде жидкости. К слову, бывают жидкости и без никотина, но они содержат ароматизаторы и химические вещества, также вредящие здоровью, отметили в ВОЗ. Например, в аэрозолях может быть формальдегид — канцерогенное вещество, говорится в докладе.
И хотя влияние безникотиновых жидкостей на организм человека пока мало изучено, ВОЗ считает, что их оборот следует регулировать так же, как их никотиновые аналоги. К тому же безникотиновые устройства невозможно визуально отличить от других, что затрудняет, например, борьбу с курением в общественных местах.
Спрос на ЭСДН стремительно растёт: в 2014 году мировые продажи составили 2,76 миллиарда долларов, в 2019 году — уже 15 миллиардов, говорится в докладе.
Инфаркт со вкусом мятыВсемирная организация здравоохранения предложила регулировать производство и продажу ЭСДН теми же нормами, что и обычные сигареты, но не стесняться и выходить за эти рамки. Например, как в Финляндии, запретить использовать в жидкостях для курения ароматизаторы.
Приятный запах ВОЗ считает одной из главных причин популярности электронных сигарет и вейпов среди молодёжи. На некоторых рынках доступно около 16 тысяч уникальных вкусов, многие из которых нравятся детям, например фруктов, мяты, конфет и других сладостей, отмечено в докладе. При этом ароматизаторы могут маскировать резкость никотина, облегчать вдыхание пара и создавать ощущение, что это безопасно и не вызывает привыкания.
Читайте также:
• Курильщикам закрутили гайки • В России хотят повысить акцизы на сигареты и алкоголь • Учёные: курение может увеличивать риск заразиться коронавирусом
В числе других мер, предложенных ВОЗ: запрет рекламы ЭСДН и продажи их через Интернет, жёсткая налоговая политика, размещение на упаковках предупреждений о потенциальных рисках для здоровья. Разумеется, следует запрещать курение и «парение» в общественных местах. По данным ВОЗ, выдыхаемый пар повышает концентрацию вредных веществ в помещениях, так что наносит вред окружающим.
Кроме того, в докладе рекомендовано тестировать ароматизаторы и другие ингредиенты жидкостей для курения на безопасность, а также запрещать или ограничивать в них долю веществ, которые «вызывают серьёзную токсикологическую озабоченность».
ВОЗ считает неубедительными существующие доказательства, что электронные системы помогают бросить курить. И прежде всего потому, что они сохраняют поведенческую модель, а также содержат то самое вещество, которое и вызывает зависимость. Поэтому ВОЗ призвала государства ограничивать продвижение вейпов и других подобных устройств как средства для тех, кто хочет покончить с вредной привычкой.
Не менее важно пресекать попытки табачных гигантов позиционировать ЕСДН как менее опасные или вообще безвредные, говорится в докладе. По данным ВОЗ, использование таких устройств наносит урон сердечно-сосудистой системе, повышает риск получить инфаркт миокарда. Кроме того, «парение» может провоцировать астму и хроническую обструктивную болезнь лёгких.
Без цвета и запахаРоссия присоединилась к антитабачной конвенции ВОЗ в 2008 году. В 2013-м приняли закон о борьбе с курением. В него вошли все основные предписания всемирной организации. Например, с тех пор россияне забыли, что такое прокуренные кафе и как выглядели пачки сигарет без жутких картинок и предупреждений Минздрава. Зато все привыкли к регулярному подорожанию сигарет и просьбам кассиров показать паспорт при покупке табака.
Постепенно закон обрастал дополнениями, не отставая от новых рекомендаций ВОЗ. К примеру, кальяны стали «нон грата» в заведениях общепита, запретили оборот нюхательного и жевательного табака.
Никотиносодержащую продукцию, то есть вейпы, айкосы и прочие устройства, приравняли к обычным сигаретам ещё год назад. Их нельзя использовать в общественных местах, рекламировать и продавать детям. Также ограничена максимальная концентрация никотина в жидкости для курения — 20 миллиграммов на миллилитр.
На очереди — запрет на использование во всех изделиях, содержащих никотин, ароматизаторов и красителей, сообщил 27 июля в своём телеграм-канале замминистра здравоохранения Олег Салагай. Впрочем, этот вопрос уже давно в разработке: он вошёл в план антитабачных мер до 2035 года, которые Правительство опубликовало в мае.
Также в планах — запретить классификацию табачной продукции по уровню содержания токсических веществ. «Это позволит не вводить в заблуждение потребителей», — пояснил Салагай.
Ещё планируют обязать производителей сигарет выпускать одинаковые обезличенные пачки, на которых 75 процентов площади займут картинки и рисунки о вреде курения.
Учитывая внимательное отношении российских властей к позиции и советам ВОЗ, вполне можно ожидать, что в будущем последуют и новые ограничения для электронных систем. Например, что безникотиновые жидкости приравняют к никотиновым и начнут печатать на них предупреждения Минздрава.
Фосфорилирование тирозина орфанного рецептора ESDN / DCBLD2 служит каркасом для сигнального адаптера CrkL
. 2013 2 августа; 587 (15): 2313-8. DOI: 10.1016 / j.febslet.2013.05.064. Epub 2013 13 июня.Принадлежности Расширять
Принадлежность
- 1 Биологический факультет Вермонтского университета, Берлингтон, VT 05405, США.
Элемент в буфере обмена
Тайлер М. Атен и др. FEBS Lett. .
Бесплатная статья PMC Показать детали Показать вариантыПоказать варианты
Формат АннотацияPubMedPMID
.2013 2 августа; 587 (15): 2313-8. DOI: 10.1016 / j.febslet.2013.05.064. Epub 2013 13 июня.Принадлежность
- 1 Биологический факультет Вермонтского университета, Берлингтон, VT 05405, США.
Элемент в буфере обмена
Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplayПоказать варианты
Формат АннотацияPubMedPMID
Абстрактный
Количественный протеомный скрининг для выявления субстратов семейства тирозинкиназ (SFK) семейства Src, фосфорилирование которых способствует связыванию CrkL-Sh3, выявил известный Crk-ассоциированный субстрат (Cas) Src, а также нейропилин эндотелиального рецептора и нейропилина, полученного из гладкомышечных клеток. -подобный белок (ESDN).Анализ мутагенеза семи внутриклеточных тирозинов ESDN в мотивах YxxP обнаружил, что некоторые из них вносят вклад в связывание ESDN с доменами Sh3 как CrkCT10-регулятора киназы Crk-Like (CrkL), так и репрезентативного SFK Fyn. Количественная масс-спектрометрия показала, что по крайней мере три из них (Y565, Y621 и Y750), а также не-YxxP Y715 обратимо фосфорилируются. Было показано, что активность SFK достаточна, но не требуется для взаимодействия между ESDN и доменом CrkL-Sh3. Наконец, опосредованная антителами кластеризация ESDN индуцирует фосфорилирование тирозина ESDN и связывание CrkL-Sh3.
Ключевые слова: С-концевую киназу Src; ЦСК; CUB; Cas; Crk-ассоциированный субстрат; CrkCT10 регулятор киназы Crk-Like; CrkL; DCBLD2; ЕСДН; Функциональная фосфопротеомика; GRB2-ассоциированный связывающий белок 1; GST; Gab1; ИРС-1; LC; РС; Масс-спектрометрии; ПЦР; Фосфорилирование; СФК; Sh3; СИЛАК; Передача сигнала; Киназа семейства Src; Тирозинкиназа семейства Src; WCE; дополнение C1r / C1s Uegf Bmp1; дискоидин CUB и домен LCCL, содержащий 2; нейропилин-подобный белок, полученный из эндотелиальных и гладкомышечных клеток; глутатионстрансфераза; субстрат-1 рецептора инсулина; жидкостная хроматография; масс-спектрометрии; полимеразной цепной реакции; мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток; цельноклеточный экстракт.
Авторское право © 2013 Федерация европейских биохимических обществ. Опубликовано Elsevier B.V.Все права защищены.
Цифры
Рис.1
Количественная функциональная протеомика на основе SILAC идентифицирует…
Рис.1
Количественная функциональная протеомика на основе SILAC определяет Cas и ESDN как субстраты PP2-чувствительной тирозинкиназы…
рисунок 1 Количественная функциональная протеомика на основе SILAC идентифицирует Cas и ESDN как субстраты PP2-чувствительной тирозинкиназы, которые взаимодействуют с доменом CrkL-Sh3. Клетки HEK 293 выращивали в контрольной среде (C), тяжелой (H) среде или легкой (L) среде и обрабатывали, как указано.Экстракты целых клеток (WCE) подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу непосредственно (A, левая панель) или после анализов с понижением частоты с использованием либо GST, либо GST-CrkL-Sh3 (A, правая панель). Блоты исследовали антифосфотирозиновыми антителами. * Указывает положение фоновой реактивности GST-CrkL-Sh3. (B) Соотношения SILAC для пептидов ESDN и Cas статистически различаются (pРис.2
(A) Доменная структура ESDN и…
Фиг.2
(A) Структура домена ESDN и соответствующие аминокислоты человека, включая семь внутриклеточных…
Рис. 2(A) Структура домена ESDN и соответствующие аминокислоты человека, включая семь внутриклеточных тирозинов, обнаруженных в мотивах YxxP.TM = трансмембранный. (B) Weblogo мотива связывания Crk-Sh3, выровненного с последовательностями внутриклеточного мотива YxxP ESDN в порядке убывания (высокий, средний и низкий) их Scansite, предсказал связывание Crk-Sh3. Обратите внимание, что предполагаемые остатки фосфотирозина находятся в нулевом положении. (C) Множественные регулируемые остатки фосфотирозина участвуют в связывании ESDN с доменом CrkL-Sh3. Клетки НЕК 293, трансфицированные указанными конструкциями, обрабатывали, как указано. Экстракты целых клеток подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу непосредственно с указанными антителами или после обработки либо GST-CrkL-Sh3 (верхние панели), либо иммунопреципитации против Flag (нижние панели).Окрашивание мембраны по Понсо перед иммуноблоттингом показывает уровни перенесенного GST-CrkL-Sh3 в каждой дорожке. * Обозначает неспецифические фоновые полосы.
Фиг.3
(A) Дикий тип, но не ESDN Y7F связывается с доменом Sh3…
Рис. 3(A) Дикий тип, но не ESDN Y7F связывается с доменом Sh3 Fyn после стимуляции H 2 O 2 .Клетки HEK 293 трансфицировали ESDN-Flag дикого типа или ESDN-Flag Y7F и либо оставляли необработанными, либо стимулировали H 2 O 2 . Экстракты целых клеток подвергали SDS-PAGE и иммуноблоттингу с указанными антителами непосредственно или после выпадающих анализов со слияниями GST-CrkL-Sh3 или GST-Fyn-Sh3. Окрашивание мембран по Понсо перед иммуноблоттингом указывает на уровни перенесенных слитых белков GST. (B) Fyn индуцирует связывание ESDN дикого типа, но не Y7F ESDN, с доменами Sh3 как CrkL, так и Fyn.Клетки обрабатывали, как в А, за исключением того, что, где указано, Fyn коэкспрессировался с ESDN. (C) Фармакологическое нарушение SFK снижает, но не устраняет H 2 O 2 -индуцированное связывание ESDN с доменом CrkL-Sh3. Клетки, стабильно экспрессирующие ESDN-Flag, предварительно обрабатывали указанными ингибиторами перед стимуляцией H 2 O 2 . Экстракты подвергали иммуноблоттингу до или после удаления GST-CrkL-Sh3, как указано.
Рис.4
(A) Модель, изображающая возможный механизм…
Фиг.4
(A) Модель, изображающая возможный механизм, с помощью которого ESDN действует как каркас для…
Рис. 4(A) Модель, изображающая возможный механизм, с помощью которого ESDN действует как каркас для адаптера CrkL.Эктодомены ESDN могут реагировать на факторы (X, Y, Z), которые вызывают кластеризацию ESDN в непосредственной близости от SFK с низкой активностью. ESDN служит субстратом для SFK, а также для неидентифицированных тирозинкиназ по множеству остатков тирозина, некоторые из которых могут связываться с доменом Sh3 SFK и тем самым снимать аутоингибирование. Сайты фосфотирозина на ESDN служат сайтами стыковки для CrkL и других фосфотирозин-связывающих белков. В силу в первую очередь своего N-концевого домена Sh4 CrkL может привлекать дополнительные эффекторные белки.(B – C) Индуцированная антителами кластеризация индуцирует фосфорилирование тирозина ESDN и его взаимодействие с доменом CrkL-Sh3. Клетки HEK 293, экспрессирующие дикого типа или Y7F ESDN-Flag, обрабатывали, как указано, двумя мкг / мл антитела против ESDN, распознающего домен внеклеточного фактора V / VIII. Клетки лизировали и экстракты подвергали иммунопреципитации против Flag. Иммунные комплексы и экстракты целых клеток подвергали блоттингу либо антителами против фосфотирозина, либо антителами против Flag, как указано. * Указывает на неспецифический диапазон.(C) Клетки обрабатывали, как в (B), за исключением того, что экстракты подвергали обработке GST-CrkL-Sh3 перед иммуноблоттингом.
Похожие статьи
- FYN и ABL регулируют сети взаимодействия семейства рецепторов DCBLD.
Schmoker AM, Weinert JL, Markwood JM, Albretsen KS, Lunde ML, Weir ME, Ebert AM, Hinkle KL, Ballif BA.Schmoker AM, et al. Протеомика клеток Mol. 2020 Октябрь; 19 (10): 1586-1601. DOI: 10.1074 / mcp.RA120.002163. Epub 2020 30 июн. Протеомика клеток Mol. 2020. PMID: 32606017 Бесплатная статья PMC.
- Динамическое мультисайтовое фосфорилирование с помощью Fyn и Abl управляет взаимодействием между CRKL и новыми каркасными рецепторами DCBLD1 и DCBLD2.
Schmoker AM, Weinert JL, Kellett KJ, Johnson HE, Joy RM, Weir ME, Ebert AM, Ballif BA.Schmoker AM, et al. Biochem J., 21 ноября 2017 г .; 474 (23): 3963-3984. DOI: 10.1042 / BCJ20170615. Биохим Дж. 2017. PMID: 2
73 Бесплатная статья PMC. - Идентификация белков, связывающих CrkL-Sh4 из эмбрионального мозга мыши: значение для передачи сигналов Reelin во время развития мозга.
Cheerathodi M, Ballif BA. Cheerathodi M, et al. J Proteome Res.2011 7 октября; 10 (10): 4453-62. DOI: 10.1021 / pr200229a. Epub 2011 15 сентября. J Proteome Res. 2011 г. PMID: 21879738 Бесплатная статья PMC.
- Семейство рецепторов DCBLD: новые сигнальные роли в развитии, гомеостазе и болезни.
Шмокер А.М., Эберт А.М., Баллиф Б.А. Schmoker AM, et al. Biochem J. 22 марта 2019 г .; 476 (6): 931-950. DOI: 10.1042 / BCJ201
. Биохим Дж.2019. PMID: 30
8 Рассмотрение. - Тирозин-фосфорилирование каркасного белка ADAP и его роль в передаче сигналов Т-клетками.
Куропка Б., Шравен Б., Клише С., Краузе Е., Фройнд К. Куропка Б. и др. Эксперт Rev Proteomics. 2016 июн; 13 (6): 545-54. DOI: 10.1080 / 14789450.2016.1187565. Эксперт Rev Proteomics. 2016 г. PMID: 27258783 Рассмотрение.
Процитировано
8 статей- Положительная обратная связь между Т-клеточной киназой Zap70 и ее субстратом LAT действует как зависимый от кластеризации сигнальный переключатель.
Dine E, Reed EH, Toettcher JE. Dine E, et al. Cell Rep.2021, 22 июня; 35 (12): 109280. DOI: 10.1016 / j.celrep.2021.109280. Cell Rep.2021. PMID: 34161759 Бесплатная статья PMC.
- Гомозиготная нонсенс-мутация в DCBLD2 является вероятной причиной задержки развития, дисморфических особенностей и рестриктивной кардиомиопатии.
Альхамуди К.М., Бархуми Т., Аль-Эди Х., Асири А., Нашабат М., Алаамери М., Альхарби М., Альхайдан И., Табарки Б., Умайр М., Альфадель М.Альхамуди К.М. и др. Sci Rep.2021, 18 июня; 11 (1): 12861. DOI: 10.1038 / s41598-021-92026-0. Sci Rep.2021. PMID: 34145321 Бесплатная статья PMC.
- FYN и ABL регулируют сети взаимодействия семейства рецепторов DCBLD.
Schmoker AM, Weinert JL, Markwood JM, Albretsen KS, Lunde ML, Weir ME, Ebert AM, Hinkle KL, Ballif BA. Schmoker AM, et al. Протеомика клеток Mol.2020 Октябрь; 19 (10): 1586-1601. DOI: 10.1074 / mcp.RA120.002163. Epub 2020 30 июн. Протеомика клеток Mol. 2020. PMID: 32606017 Бесплатная статья PMC.
- Скрининг протеомики in silico для прогнозирования и определения приоритетов белок-белковых взаимодействий, зависящих от посттрансляционно модифицированных мотивов.
Schmoker AM, Driscoll HE, Geiger SR, Vincent JJ, Ebert AM, Ballif BA. Schmoker AM, et al.Биоинформатика. 2018 15 ноября; 34 (22): 3898-3906. DOI: 10.1093 / биоинформатика / bty434. Биоинформатика. 2018. PMID: 29868839 Бесплатная статья PMC.
- Fyn-зависимое фосфорилирование PlexinA1 и PlexinA2 по консервативным тирозинам важно для развития глаз рыбок данио.
St Clair RM, Emerson SE, D’Elia KP, Weir ME, Schmoker AM, Ebert AM, Ballif BA. St Clair RM и др.FEBS J. 2018, январь; 285 (1): 72-86. DOI: 10.1111 / febs.14313. Epub 2017 17 ноября. ФЕБС J. 2018. PMID: 2
53 Бесплатная статья PMC.
Типы публикаций
- Научно-исследовательская поддержка, N.I.H., заочная форма
- Поддержка исследований, за пределами США. Правительство
- Поддержка исследований, Правительство США, Non-P.H.S.
Условия MeSH
- Адаптерные белки, преобразование сигналов / метаболизм *
- Мембранные белки / химия
- Мембранные белки / метаболизм *
- Ядерные белки / метаболизм *
- Гомология последовательностей, аминокислота
Вещества
- Адаптерные белки, преобразование сигналов
LinkOut — дополнительные ресурсы
Источники полных текстов
Источники другой литературы
Медицина
Базы данных по молекулярной биологии
цитировать
КопироватьФормат: AMA APA ГНД NLM
Кто такие вейперы и почему они взлетают туда, куда хотят
Кто такие вейперы?
Вейперы — это люди, которые курят электронные сигареты. Но с оговорками.
Резервирование первое. Их курение сильно отличается от курения обычных сигарет, сигар и трубок.
Вторая резервация. Электронные сигареты — слишком простое название для тех устройств, которые используют вейперы.
Что они курят?
Электронные системы доставки никотина (ЭСДН), как их называют в официальных документах, представляют собой специальные устройства, в которых вместо табака используется жидкость (это тоже «жидкость», это еще и «сок»). Строго говоря, это не сигарета, потому что там ничего не горит.В руках вейперы держат парогенератор. Кто-то называет это кальяном, кто-то ингалятором, кто-то атомайзером. Жидкость в нем испаряется. Этим паром и дышат вейперы.
Как это работает?
В электронной сигарете (для простоты мы будем называть эти устройства) несколько частей. Это корпус, мундштук, аккумулятор, ТЭН, емкость для жидкости.
Все это встречается в сотнях вариаций и модификаций, в зависимости от модели и производителя.Восторженные вайперы делают трубки сами, учитывая массу нюансов.
Что входит в состав жидкости?
Основными компонентами для заправки электронной сигареты являются глицерин и пропиленгликоль, никотин, ароматизаторы.
Всегда ли в паре никотин?
Не всегда. Можно париться с жидкостями без содержания никотина, просто с ароматизатором. И количество никотина регулируется, опять же, в зависимости от жидкости.
Кто-то с помощью снижения дозы никотина бросает курить, кто-то просто снижает риски для здоровья.А кто-то привязывается к паре безотносительно никотиновой зависимости.
Это нездорово?
Приверженцы паровой культуры скажут, что от пара вреда нет, а если и есть, то в несколько раз меньше, чем от обычной (так называемой аналоговой) сигареты. С одной стороны, это так: в паре электронных сигарет нет смолы и продуктов сжигания табака и бумаги. Как мы уже выяснили, никотина может и не быть.
Но ВОЗ, например, не поддерживает оптимистичный настрой вейперов.
Растворы, используемые в ЕСДН, и выделяемые из них вещества содержат другие химические вещества, некоторые из которых считаются токсичными.
Всемирная организация здравоохранения
ВОЗ даже подготовила большой отчет, в котором совершенно специально расписала, для чего не любит пароварки, вроде тех, кто разливает жидкости с никотином, и тех, кто никотином не балуется. Эксперты пока не могут подтвердить заявления вейперов о том, что пар не вреден и не безвреден для окружающих.Опровергните тоже: мало исследований. Однако повод задуматься есть.
Это законно?
Использование электронных сигарет не подпадает под действие законодательства Российской Федерации. По крайней мере на данный момент. То есть любой может лететь куда угодно (хотя на борту самолета это уже запрещено).
А если мне не нравятся пары рядом со мной?
Мол, приличные вейперы не парят там, где не нужно курить. Но мем «Пару, где хочу» появился не просто так.
Если вам не нравится вдыхать пар рядом с вапером, вы можете проверить его на такт и вежливость, попросив парить в другом месте.
Кстати, вейперы, гадюки или пароварки?
Слово «wapers» происходит от английского пара — «пары». То есть «Вейперы» будут правильными, хотя они и не называются. А сам процесс обозначается глаголом «парить», то есть выпускать пар.
Почему столько мемов и анекдотов про вауперы?
Надо с кем-то что-то делать, и вейперы успешно раскрутили интернет по горячим клавишам.
Какие вейперы заслужили такое внимание, неясно. Скорее всего, дело в том, что они внезапно появились на фоне изменений в законодательстве о курении и начали стремительно распространяться. Буквально пару лет назад об электронных сигаретах мало кто слышал, а сегодня проходят целые фестивали вейперов, которые уже получили название субкультуры. Так что шутки и мемы — это естественная реакция Интернета на них.
Так это субкультура?
Давайте посмотрим, что такое субкультура.
Субкультура — это система норм и ценностей, отличающих группу от большинства общества, автономное целостное образование в рамках доминирующей культуры, определяющее образ жизни и мышление ее носителей, различающихся своими обычаями, нормами, наборами ценности и даже институты.
Новейший философский словарь
Кальяны и электронные сигареты — это просто продукт. В конце концов, как обычные сигареты, как пиво, как сыр.Да, у вейперов есть свой жаргон, сайты и форумы. Но этого недостаточно для образования субкультуры. У бухгалтеров тоже есть свой жаргон и форумы, но никто не выделяет их в культурную группу. И фестивали не показатель. На Октоберфест ходят люди, принадлежащие к разным культурам, а не та «суб».
Взлететь может каждый, с любыми ценностями, взглядами и нормами. Но парение — это модно, значит, на этом можно заработать. Поэтому вейперов будут называть как угодно, хоть партией, лишь бы их количество приумножалось.
Веллер 100-1000-ЕСДН. МГ 100С Установка дымоудаления МГ 100С
Веллер 100-1000-ЕСДН. MG 100S Установка дымоудаления MG 100SМагазин будет работать некорректно, если куки отключены.
Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для максимального удобства работы на нашем сайте обязательно включите Javascript в своем браузере.
Блок удаления дыма MG 100S
- Большой объем газового фильтра
- Электронное управление фильтром с аварийной сигнализацией фильтра
- Настройка переменной скорости
- Минимальная площадь следа
- Импульсный источник питания 100 — 240 В
- Оптимизированный срок службы фильтра
- Устройство очищает воздух на 2 рабочих места
- Дымоудаление MG 100S подходит для применений с повышенными требованиями к газам.Регулируемая скорость и функция сигнализации для замены фильтра могут быть установлены с пульта дистанционного управления. Чтобы упростить установку, MG 100S можно подвесить на рабочем столе с помощью специального монтажного набора (780-3001-ESD).
Лист данных
Технические характеристики
| Размеры Д x Ш x В (мм) | 460 x 210 x 610 | |
|---|---|---|
| Напряжение | 110-240 В, 50/60 Гц | |
| Мощность | 100 Вт | |
| Уровень шума (расстояние 1 м) дБ (A) | <52 | |
| FT-приложения | Мелкая пыль | |
| FT-приложения | 9028 Ручная пайкаПрименения FT | Приклеивание, очистка, литье |
| Применение FT | Растворители | |
| Применение FT | Метилэтилкетон (MEK) | |
| Применение FT | 9028 Существенное образование дымовых газов | |
| 18.11 x 8,26 x 24,15 | ||
| Вес (прибл.) В кг | 15 | |
| Защита от электростатических разрядов | на | |
| Макс. мощность | 1-2 рабочих места | |
| Макс. емкость | 2 рабочих места | |
| Макс. вакуум нагнетателя (Па) | 2.300 | |
| Компактный фильтр | Сажевый фильтр h23, Широкополосный газовый фильтр (50% активированный уголь + 50% Chemisorb) | |
| Диаметр | — | |
| Высота — | ||
| Расход воздуха л / мин | na | |
| Производительность м³ / ч | 140 | |
| Предохранитель | 2 x 6,3 | |
| Интерфейс RS232 (дистанционное управление) 1 | (TTL)||
| Фильтр предварительной очистки | — |
Сопутствующие товары
Компоненты, входящие в комплект поставки
Принадлежности
700-3057 Пульт дистанционного управления вытяжными агрегатами MG блок экстракции WFE 2X, MG 100, MG 200, MG 400 длиной 2 м (78.74 дюйма) кабель
Запасной фильтр для устройств MG
Руководства
| Номер производителя | 100-1000-ESDN |
|---|---|
| Производитель | EAN |
| 40030161 | |
| Срок поставки | 2-3 недели |
| Вес | 0,009900 |
35-740 Ideal Industries — Дополнительные инструменты и производственные принадлежности
Часто задаваемые вопросы
Где я могу найти дополнительную информацию, спецификации и документы для 35-740?
Дополнительные спецификации, посадочные места и схемы для 35-740 перечислены на нашей вкладке «Детали детали».Вы также можете найти изображение 35-740 и аналогичные детали на этой странице деталей.
Какую информацию о ценах и запасах я могу просмотреть?
Информация о ценах и запасах дистрибьюторадля 35-740 доступна на вкладке «Цены и инвентарь» рядом с деталями. Вы можете просмотреть 35-740 ценовых разрывов, MOQ, сроки поставки, инвентарь и артикулы от дистрибьюторов.
К какой категории относится 35-740?
Модель 35-740 указана в разделе Инструменты и производственные принадлежности> Другие инструменты и производственные принадлежности.
Могу ли я просмотреть похожие или альтернативные детали?
Вы можете просмотреть детали, аналогичные 35-740, если они доступны в ассортименте «Дополнительные инструменты и производственные материалы» в разделе технических характеристик в нижней части страницы с подробными сведениями.
К кому я могу обратиться за технической поддержкой продукта?
Задавайте любые вопросы непосредственно в службу поддержки дистрибьютора, разместившего товар. Для модели 35-740 вы можете напрямую связаться с дистрибьютором для получения поддержки по продукту, запросов на доставку и т. Д.
Соответствует ли 35-740 RoHS?
Эта деталь не отмечена как соответствующая RoHS.
У каких официальных дистрибьюторов 35-740 есть складские запасы?
Авторизованные дистрибьюторы, включая Newark Electronics, Allied Electronics & Automation, Rapid Electronics и Relay Specialties, имеют в наличии или на складе 35-740 штук.
Как мне проверить наличие на складе и время выполнения заказа для всех дистрибьюторов?
Наличие на складе и время выполнения заказа будут отображаться для 35-740 часто в режиме реального времени на страницах сравнения.
Что делать, если я не могу найти на складе 35-740?
Вы можете заполнить нашу справочную форму, которую вы можете использовать, чтобы запросить расценки на 35-740 у некоторых из наших проверенных поставщиков устаревшего оборудования. Или свяжитесь с нами через наш веб-чат в левом нижнем углу экрана, и один из наших сотрудников попытается помочь.
Полипептид ESDN, полинуклеотиды, кодирующие полипептид, и полезность полипептида
Изобретение относится к новому полипептиду, называемому нейропилин-подобная молекула, полученная из эндотелиальных и гладкомышечных клеток (далее просто называемая «ESDN»), способу получения, кДНК, кодирующей ESDN, вектору, содержащему кДНК, трансформированным клеткам-хозяевам вектором, антителом к ESDN, фармацевтическими препаратами, композициями, содержащими полипептид или антитело, методами и реагентами для измерения количества ESDN, методами скрининга с использованием ESDN.
С момента выделения фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) сложная сеть передачи внеклеточного сигнала в ангиопоэзе была полностью прояснена. Исследование мышей, у которых есть нацеленная мутация тирозинкиназы, например, этого лиганда, Flk-1 / VEGFR2, Flt-1 / VEGFR1 и т. Д., Было первым ключевым моментом, связанным с первым этапом ангиопоэза и васкуляризации.
Рецептор-2 VEGF (VEGFR-2) необходим для образования эндотелия, и целенаправленная мутация этого гена привела к нехватке клеток крови или организованных кровеносных сосудов и гибели эмбриона в возрасте 9 лет.5 дней после полового акта. Однако, согласно анализу раннего маркера с помощью ОТ-ПЦР, показывающего ранний гемопоэз, и сообщению о том, что эндотелиальные клетки-предшественники фактически образовывались в отсутствие VEGFR-2, предполагается, что VEGFR-2 необходим для последующего роста, но не является абсолютно необходимым. для образования гематобластов.
Мыши с нокаутом по рецептору-1 VEGF (VEGFR-1) также были мертвы в эмбрионе через 9,5 дней после полового акта, но дифференцировка их эндотелиальных клеток не подвергалась прямому влиянию. Вместо этого предполагается, что движение гематобластов мезенхимы может быть застойным, и что их перенаселенность эндотелиальными клетками-предшественниками может привести к серьезному разрушению сосудистой системы.Мыши с нокаутом VEGF также были мертвы в эмбрионе через 9,5 дней после полового акта, и дифференцировка их эндотелиальных клеток не была дефектной. То есть, по существу, это было то же самое для мышей с нокаутом VEGF-1, но фенотип был слабее, чем у мышей с нокаутом VEGF-1. Заметной характеристикой, связанной с целевой мутацией в этом гене, было то, что делеция гена гетерозиготы была смертельной для эмбриона мыши через 11,5 дней после полового акта. Это показало, что развитие эмбриона может строго зависеть от количества экспрессии VEGF.
Другие рецепторы тирозинкиназ, такие как Tie-2 и его лиганд, специфически экспрессируются в эндотелиальных клетках сосудов, внося вклад в стадию васкуляризации на поздней стадии ангиопоэза. Хотя разрушение этих генов, которое не влияет на ангиопоэз, влияет на ремоделирование сосудов, вызывая смерть эмбриона через 10,5 дней после полового акта. Они играют определенную роль во взаимодействии между эндотелиальными клетками и окружающими их гладкомышечными клетками сосудов (VSMC) или клетками мезенхимы.В дополнение к системе, специфичной для сосудов, PDGF-BB, TGF-β и их рецепторы также играют сходные роли во взаимодействии между эндотелиальными клетками и окружающими их клетками. Исследования взаимосвязи между сосудистой системой и нейропилином-1 (NP-1), который был клонирован как антиген, распознаваемый моноклональным антителом, распознающим первый развитый нейрон, привели в этой области к новой фазе.
Затем идентификация в качестве рецептора семафорина 3A (sema3A) стала привлекать внимание в связи с образованием аксонов, а поиск других рецепторов VEGF привел к открытию NP-1, который также является корецептором VEGFR-2.NP-1 усиливает не только связывание с одной изоформой VEGF-2, но также хемотаксис и вероятный митоз эндотелиальных клеток. Перед этой идентификацией было обнаружено, что химерные мыши, сверхэкспрессирующие NP-1, имели фенотип гипертрофического сосудистого образования. Мыши с нокаутом NP-1 имели фенотип низкого ангиогенеза в центральной нервной системе и больших сосудистых вариаций. С другой стороны, не сообщалось, были ли у мышей с нокаутом sema3A аномальные сосуды, хотя интересно, что эти мыши имели фенотип тонкого миокарда, который также наблюдался у мышей со сверхэкспрессией NP-1.
Другой пример — система Eph / Ephrin, которая впервые была широко изучена в неврологической сфере. Позже эта система была повторно идентифицирована как единственный поверхностный маркер, различающий артерии и вены. Они экспрессируются в клетках мезенхимы, которые окружают сосуды и контактируют с эндотелиальными клетками. Предполагая, что в сосудах есть много молекул внеклеточной передачи сигнала, помимо вышеуказанных молекул, изобретатели предположили, что доказательство этого предположения будет способствовать лучшему пониманию этой сложной системы.
Авторы настоящего изобретения привлекли свое внимание и провели энергичные исследования, чтобы найти полезные и новые факторы (полипептиды), которые играют важную роль в патологии гладкой мускулатуры сосудов при рестенозе после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики (ЧТКА) и склерозе артерий при рестенозе. область сердечно-сосудистой системы, особенно секреторный и мембранный белок, содержащий сигнальную последовательность.
Обычно, когда специалист в данной области намеревается получить конкретный полипептид или кодирующую его кДНК, он обычно использует методы, подтверждая предполагаемую биологическую активность в ткани или в клеточной среде, выделяя и очищая полипептид, а затем клонируя ген или методы «экспрессии-клонирования» с контролем биологической активности.
Однако физиологически активные полипептиды в живом организме часто выполняют разные функции. Следовательно, ген, который был клонирован с целью определенной активности, часто оказывается идентичным гену, кодирующему уже известный полипептид. Более того, в стромальных клетках костного мозга многие факторы экспрессируются в очень небольшом количестве или только в определенных физиологических условиях, что затрудняет выделение и очистку фактора и подтверждение его биологической активности.
Авторы настоящего изобретения изучили способы клонирования генов, кодирующих факторы пролиферации и / или дифференцировки, функционирующие в гематопоэтических системах и иммунных системах. Сосредоточение их внимания на том факте, что большинство секреторных белков, таких как факторы пролиферации и / или дифференцировки (например, различные цитокины), и мембранные белки, такие как их рецепторы (в дальнейшем эти белки будут в целом называться секреторными белками и т.п.), имеют последовательности, названные сигнальными пептидами на N-концах, изобретатели провели обширные исследования процесса эффективного и селективного клонирования гена, кодирующего сигнальный пептид. Наконец, авторы настоящего изобретения успешно изобрели метод скрининга кДНК, содержащих сигнальные пептиды, кодирующие последовательность и названных метод перехвата сигнальной последовательности (в дальнейшем именуемый просто «SST») (см. Японскую патентную заявку №6-13951). Авторы настоящего изобретения также разработали метод SST дрожжей на основе той же концепции. С помощью метода с использованием дрожжей можно более легко и эффективно идентифицировать гены, включая последовательность, кодирующую сигнальный пептид (см. Патент США № 5,536,637).
Используя недавно измененный метод SST, авторы настоящего изобретения достигли выделения нового мембранного белка, продуцируемого сосудистой клеткой. Белок по изобретению, называемый ESDN, представляет собой новый трансмембранный белок типа I и содержит характерные домены, такие как нейропилин.
Как это может быть подробно объяснено ниже, поскольку ESDN по настоящему изобретению экспрессируется в коронарных клетках и гладкомышечных клетках, а также в гладкомышечных клетках артерий и средней оболочке сонной артерии после баллонного повреждения, предполагается, что ESDN Настоящее изобретение полезно для лечения рестеноза после ЧТКА и артериального склероза в области сердечно-сосудистой системы.
Последовательность кДНК по изобретению была идентифицирована как человеческий ESDN, показанный в SEQ ID NO.2. На основе информации, полученной с помощью дрожжевого метода SST, он был выделен из библиотек кДНК, созданных из первичной культуры клеток коронарных артерий и гладкомышечных клеток человека. Клон человеческого ESDN, показанный в SEQ ID NO. 3 представляет собой полноразмерную кДНК, содержащую полную последовательность кДНК, кодирующую секреторный белок (показан здесь как человеческий белок ESDN).
Последовательность кДНК по изобретению была идентифицирована как ESDN мыши, показанная в SEQ ID NO. 6. На основании информации, полученной с помощью метода SST дрожжей, он был выделен из библиотек кДНК мыши.Клон ESDN мыши, показанный в SEQ ID NO. 5 представляет собой полноразмерную кДНК, содержащую полную последовательность кДНК, кодирующую секреторный белок (обозначенный здесь как мышиный белок ESDN).
Последовательность кДНК по изобретению была идентифицирована как крысиный ESDN, показанный в SEQ ID NO. 9. На основании информации, полученной с помощью дрожжевого метода SST, он был выделен из библиотек кДНК крыс. Клон крысиного ESDN, показанный в SEQ ID NO. 8 представляет собой полноразмерную кДНК, содержащую полную последовательность кДНК, кодирующую секреторный белок (показан здесь как белок ESDN крысы).
В GeneBank и NCBI полипептид крысы по изобретению и последовательность ядерной кислоты, кодирующая полипептид, сравнивали с помощью поисков BLASTN, FASTA и UNIGENE с известными последовательностями ядерных кислот, зарегистрированными в базах данных нуклеотидных последовательностей, или с помощью BLASTP, базы данных FLy, SwissProt выполняет поиск аминокислотных последовательностей известных полипептидов, зарегистрированных в базах данных аминокислотных последовательностей. В результате не было последовательности, которая соответствовала бы ESDN крысы в качестве полипептида по настоящему изобретению и последовательности ядерной кислоты, кодирующей полипептид, так что было обнаружено, что полипептид по настоящему изобретению является новым секреторным белком.
РИС. 1 показано выравнивание ESDN человека, мыши и крысы.
РИС. 2 показано схематическое изображение соответствующих доменных структур в ESDN, нейропилине и Coch.
РИС. 3 показано выравнивание соответствующих модулей LCCL из ESDN человека, мыши или крысы, Limulus фактора C, двух доменов LCCL предсказанного крысиного Lgl-1 и Coch человека, мыши или курицы.
РИС. 4 показаны профили гидрофобности ESDN человека и мыши.
РИС. 5 показывает схематический вид векторов экспрессии.
РИС. 6 показан вестерн-блот-анализ рекомбинантного полноразмерного ESDN.
РИС. 7 показаны изображения поверхностной экспрессии ESDN.
РИС. 8 показан вестерн-блоттинг, показывающий, что самая длинная секреторная сигнальная последовательность ESDN расщепляется в предсказанном сайте.
РИС. 9A показан зооблот-анализ ESDN по Саузерну, выполненный с использованием кДНК ESDN человека в качестве зонда, а 9 B показывает, что ген ESDN человека находится на хромосоме 3.
Фиг. На фиг.10А и В показан Нозерн-блоттинг с кДНК человека и кДНК крысы с использованием РНК из клеток коронарных артерий человека и органов крысы или культивированных клеток гладких мышц аорты.
РИС. 11 показывает индукцию мРНК ESDN в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека в ответ на стимуляцию PDGF-BB или FCS.
РИС. 12 показана повышающая регуляция мРНК ESDN в поврежденных баллоном сонных артериях крысы.
РИС. 13 показано иммуногистохимическое окрашивание, которое выявляет повышенную регуляцию белка ESDN в сонной артерии крысы после баллонного повреждения.
РИС. 14 показывает подавление поглощения BrdU в клетках, сверхэкспрессирующих ESDN.
Изобретение обеспечивает:
(1) По существу очищенную форму полипептида, содержащую одну из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO.2, 5 или 8, или их гомолог, их фрагмент, или полипептид, содержащий гомолог фрагмента.
(2) Полипептид согласно (1), содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 2, 5 или 8.
(3) кДНК, кодирующая полипептид в соответствии с (1) или (2).
(4) кДНК согласно (3), содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 3, 6 или 9, или фрагмент кДНК, селективно гибридизованный с последовательностью.
(5) Вектор репликации или экспрессии, несущий кДНК в соответствии с (3) — (4).
(6) Клетка-хозяин, трансформированная вектором репликации или экспрессии согласно (5).
(7) Способ получения полипептида согласно (1) или (2), который включает культивирование клетки-хозяина согласно (6) в условиях, эффективных для экспрессии полипептида согласно (1) или (2).
(8) Моноклональное или поликлональное антитело против полипептида в соответствии с (1) или (2).
(9) Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид согласно (1) или (2) или антитело согласно (8) в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем и / или носителем.
(10) Фармацевтическая композиция, которая терапевтически эффективна при лечении рестеноза после ЧТКА и содержащая полипептид в соответствии с (1) или (2) или антитело в соответствии с (8) в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем и / или перевозчик.
(11) Фармацевтическая композиция, описанная выше в (10), которая терапевтически эффективна при лечении артериального склероза и содержащая полипептид согласно (1) или (2) или антитело согласно (8), в сочетании с фармацевтически приемлемый разбавитель и / или носитель.
(12) Способ измерения количества полипептида в соответствии с (1) или (2).
(13) Иммунохимический способ измерения количества полипептида согласно (1) или (2), включающий использование антитела согласно (8).
(14) Реагент для обнаружения полипептида согласно (1) или (2), который используется в способе согласно (12) или (13).
(15) Реагент для исследования рестеноза после ЧТКА методом по (12) или (13).
(16) Реагент для исследования склероза артерий, который используется в методе по (12) или (13).
(17) Способ скрининга для выбора реагентов, обладающих антагонистической или агонистической активностью в отношении полипептида, включающий использование полипептида в соответствии с (1) или (2).
Селективно гибридизующиеся кДНК содержат комплементарные последовательности по отношению к указанной выше последовательности. Гибридизация в строгих условиях является предпочтительной.
Обычно полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 2, 5 или 8 в практически очищенной форме означает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность No.2, 5 или 8 в 90% или более, например 95%, 98% или 99% в препарате.
Гомолог полипептида, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 2, 5 или 8, как правило, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере 80 или 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95% гомологичны полипептиду в области по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, например 40, 60, 80 или еще 100 смежных аминокислот. Такой гомолог полипептида называется полипептидом по настоящему изобретению.
Обычно фрагмент полипептида, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO.2, 5 или 8, или фрагмент его гомологов имеет длину не менее 10, предпочтительно, не менее 15, например, 20, 25, 30, 40, 50 или 60 аминокислот в длину, и его также называют полипептидом настоящего изобретения. изобретение.
кДНК, способная селективно гибридизоваться с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 3, 6 или 9, как правило, по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 90% и более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны кДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 3, 6 или 9 в области по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30 или более, например 40, 60, 80 или 100 смежных нуклеотидов.Такая кДНК называется кДНК по настоящему изобретению.
Фрагменты ДНК, содержащие нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 3, 6 или 9 имеют длину по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15, например 20, 25, 30 или 40 нуклеотидов в длину, и также называются кДНК настоящего изобретения в контексте настоящего изобретения.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к векторам репликации и экспрессии, несущим кДНК настоящего изобретения. Векторы могут быть, например, плазмидными, вирусными или фаговыми векторами, снабженными ориджином репликации, необязательно промотором для экспрессии указанной кДНК и необязательно регулятором промотора.Вектор может содержать один или несколько генов селектируемых маркеров, например ген устойчивости к ампициллину. Вектор можно использовать in vitro, например, для получения РНК, соответствующей кДНК, и для трансфекции клетки-хозяина.
Еще один вариант осуществления изобретения относится к клеткам-хозяевам, трансформированным векторами для репликации и экспрессии ДНК по изобретению, включая ДНК SEQ ID NO. 3, 6 или 9 или их открытая рамка считывания. Клетки будут выбраны так, чтобы они были совместимы с вектором и могут, например, быть бактериальными, дрожжевыми, насекомыми или млекопитающими.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ получения полипептида, который включает культивирование клеток-хозяев настоящего изобретения в условиях, эффективных для экспрессии полипептида настоящего изобретения. Кроме того, предпочтительно, чтобы такой способ осуществлялся в условиях, в которых полипептид по изобретению экспрессируется, а затем продуцируется из клеток-хозяев.
кДНК по настоящему изобретению также может быть вставлена в векторы, описанные выше, в антисмысловой ориентации, чтобы доказать продукцию антисмысловой РНК.Такую антисмысловую РНК можно использовать для контроля уровня полипептида по настоящему изобретению в клетке.
Настоящее изобретение также относится к моноклональным или поликлональным антителам против полипептида настоящего изобретения. Настоящее изобретение также относится к способу получения моноклональных или поликлональных антител к полипептидам настоящего изобретения. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью общепринятой гибридомной технологии с использованием полипептидов по настоящему изобретению или их фрагментов в качестве иммуногена.Поликлональные антитела также могут быть получены обычными способами, которые включают инокуляцию животных-хозяев, например крысу или кролика, полипептидами по изобретению и восстановление иммунной сыворотки.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид по настоящему изобретению или его антитело в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем и / или носителем.
Что касается полипептидов по настоящему изобретению, то полипептиды, которые имеют дефицит в части своей аминокислотной последовательности (например,g., полипептид, состоящий из единственной существенной последовательности для выявления биологической активности в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO. 2), те, у которых часть их аминокислотной последовательности заменена другими аминокислотами (например, те, которые заменены аминокислотой, имеющей аналогичное свойство), и те, у которых есть другие аминокислоты, добавленные или вставленные в часть их аминокислотной последовательности , а также те, которые содержат аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 2, 5 или 8.
Как хорошо известно, существует от одного до шести типов кодонов, кодирующих одну аминокислоту (например, один тип кодона для метионина (Met) и шесть типов кодонов для лейцина (Leu) известны. ).Соответственно, нуклеотидная последовательность кДНК может быть изменена без изменения аминокислотной последовательности полипептида.
кДНК по настоящему изобретению включает каждую группу нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептиды, показанные в SEQ ID NO. 2, 5 или 8. Существует вероятность того, что выход полипептида повышается за счет изменения нуклеотидной последовательности.
кДНК, указанная в SEQ ID NO. 3, 6 или 9 представляет собой вариант ДНК, показанной в SEQ ID NO. 2, 5 или 8 и обозначает последовательность естественной формы.
кДНК, несущая нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO. 3, 6 или 9 получают следующим способом:
Во-первых, дрожжевой метод SST (см. Патент США № 5,536,637) кратко описывается ниже.
Дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae , должны выделять инвертазу в среду, чтобы использовать сахарозу или раффинозу в качестве источника энергии или углерода (инвертаза — это фермент, расщепляющий рафинозу на сахарозу и мелибиозу, сахарозу на фруктозу и глюкозу.). Известно, что многие из известных сигнальных последовательностей млекопитающих заставляют дрожжи секретировать свою инвертазу.
На основании этих знаний был разработан метод SST как метод скрининга для поиска новой сигнальной последовательности, которая обеспечивает секрецию инвертазы дрожжей из библиотеки кДНК млекопитающих с ростом дрожжей в качестве показателя.
Ген инвертазы несекреторного типа SUC2 (GENBANK Accession No. V 01311) без инициирующего кодона ATG вставляли в вектор экспрессии дрожжей для получения вектора SST pSUC2 дрожжей. В этом векторе экспрессии промотор ADH, терминатор ADH (оба происходили из плазмиды AAH5 (Gammerer, Methods in Enzymol.101, 192-201, 1983)), 2μ ori (как ориджин репликации дрожжей), TRP1 (как селективный маркер дрожжей), ColE1 ori (как ориджин репликации E. Coli ) и ген устойчивости к ампициллину (как лекарственное средство). маркер сопротивления). КДНК млекопитающих вставляли выше гена SUC2 для получения библиотеки кДНК SST дрожжей. Дрожжи, лишенные инвертазы секреторного типа, трансформировали с помощью этой библиотеки.
Если вставленная кДНК млекопитающего кодирует сигнальный пептид, дрожжи могут выжить в среде раффинозы в результате восстановления секреции инвертазы.Посредством культивирования дрожжей в колониях для получения плазмид и определения нуклеотидной последовательности вставленных кДНК можно быстро и легко идентифицировать новый сигнальный пептид.
Приготовление библиотеки кДНК SST дрожжей выглядит следующим образом:
(1) мРНК выделяют из клеток-мишеней, двухцепочечную кДНК синтезируют с использованием случайного праймера с сайтом распознавания определенного рестрикционного фермента (фермента I),
( 2) двухцепочечная кДНК лигируется с адаптером, содержащим сайт узнавания определенной эндонуклеазы рестрикции (фермент II), отличный от фермента I, расщепляется ферментом I и фракционируется до подходящего размера,
(3) полученный фрагмент кДНК вставляется в дрожжи вектор экспрессии в вышестоящей области гена инвертазы, из которого удален сигнальный пептид, и библиотека трансформируется.
Подробное описание каждого этапа следующее:
На этапе (1) мРНК выделяют из органов и клеточных линий млекопитающих после их стимуляции с помощью соответствующего стимулятора, если необходимо, известными методами (как описано в Molecular Cloning (Sambrook, J. , Fritsch, EF и Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) или Current Protocol in Molecular Biology (FM Ausubel et al, John Wiley & Sons, Inc.)), если не указано иное.
Подходящей тканью может быть сердце эмбриона мыши.Синтез двухцепочечной кДНК с использованием случайного праймера осуществляется известными методами.
Любые сайты могут использоваться в качестве сайта I узнавания рестрикционной эндонуклеазы, который связан с адаптером и сайтом узнавания рестрикционной эндонуклеазой II, который используется на стадии (2), поскольку оба сайта отличаются друг от друга. Предпочтительно XhoI используется в качестве фермента I и EcoRI в качестве фермента II.
На этапе (2) концы кДНК притупляются с помощью ДНК-полимеразы Т4, лигируются с адаптером фермента II и расщепляются ферментом I.Фрагмент кДНК анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле (AGE) и отбирают фракцию кДНК размером от 300 до 800 п.н. Как упоминалось выше, в качестве фермента II может быть использован любой фермент, если он не совпадает с ферментом I.
На этапе (3) фрагмент кДНК, полученный на этапе (2), вставляется в вектор экспрессии дрожжей в восходящей области ген инвертазы, сигнальный пептид которого удален. E. coli трансформировали вектором экспрессии. Многие векторы известны как плазмидные векторы экспрессии дрожжей.Например, YEp24 также функционирует в E. Coli . Предпочтительно использовать pSUC2, как описано выше.
Известно, что многие штаммы E. Coli -хозяев могут быть использованы для трансформации, предпочтительно использовать компетентные клетки Dh20B. Доступен любой известный метод превращения, предпочтительно его проводят методом электрополяции. Трансформант культивируют обычными методами для получения библиотеки кДНК для дрожжевого метода SST.
Однако не весь клонированный фрагмент кДНК вводится в эту библиотеку кДНК.Кроме того, не все фрагменты гена кодируют неизвестные (новые) сигнальные пептиды. Следовательно, необходимо провести скрининг фрагмента гена, кодирующего неизвестный сигнальный пептид из библиотеки.
Таким образом, скрининг фрагментов, содержащих последовательность, кодирующую соответствующий сигнальный пептид, выполняется путем трансформации библиотеки кДНК в Saccharomyces cerevisiae (например, штамм YT455) без гена инвертазы или штамм, в котором этот ген искусственно отсутствует (он может быть получен с помощью известные методы.). Трансформацию дрожжей проводят известными методами, например литий ацетатный метод. Трансформант культивируют в селективной среде, затем переносят в среду, содержащую рафинозу в качестве источника углерода. Отбирают выжившие колонии, а затем собирают плазмиду. Выживаемость колоний на среде раффинозы указывает на то, что в этот клон был вставлен некоторый сигнальный пептид секреторного белка.
В отношении изолированных положительных клонов определяется нуклеотид. Что касается кДНК, кодирующей неизвестный белок, полноразмерный клон может быть выделен с использованием фрагмента кДНК в качестве зонда, а затем определяется полноразмерная нуклеотидная последовательность.Манипуляция проводится известными методами.
После того, как нуклеотидные последовательности, показанные в SEQ ID NO. 3, 6 или 9 определены частично или предпочтительно полностью, можно получить кДНК, кодирующую сам белок млекопитающего, его гомолог или подмножество. Путем скрининга библиотеки кДНК или мРНК, полученных от млекопитающих, методом ПЦР с любыми синтезированными олигонуклеотидными праймерами или путем гибридизации с любым фрагментом в качестве зонда можно получить кДНК, кодирующую белок-гомолог другого млекопитающего, из библиотеки кДНК или генома других млекопитающих.
Если полученная выше кДНК содержит нуклеотидную последовательность фрагмента кДНК, полученного с помощью SST (или ее консенсусную последовательность), это означает, что кДНК кодирует сигнальный пептид. Соответственно, ясно, что кДНК имеет полную или почти полную длину. (Все сигнальные последовательности существуют на N-концах белка и кодируются на 5′-концах открытой рамки считывания кДНК.)
Известными методами подтверждение полноразмерности может быть выполнено посредством Нозерн-анализа с указанным кДНК как зонд.Предполагается, что кДНК имеет почти полную длину, если длина кДНК почти совпадает с длиной мРНК, полученной в полосе гибридизации.
Настоящее изобретение относится к обоим типам белка, то есть полноразмерному и зрелому. Полноразмерные белки имеют аминокислотные последовательности, транслируемые с нуклеотидов, показанных в SEQ ID NO. 2, 5 или 8. Зрелые белки получают путем экспрессии в подходящих клетках млекопитающих или других клетках-хозяевах, трансформированных полноразмерной ДНК, показанной в SEQ ID NO.3, 6 или 9. Последовательности зрелых белков могут быть предсказаны на основе полноразмерных аминокислотных последовательностей. (Показано на фиг. 1)
После определения нуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 3, 6 или 9, кДНК настоящего изобретения получают химическим синтезом или гибридизацией с использованием нуклеотидных фрагментов, которые синтезируются химическим путем. как зонд. Кроме того, кДНК по изобретению получают в желаемом количестве путем трансформации вектора, содержащего ДНК, в подходящего хозяина и культивирования трансформанта.
Полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены:
(1) выделением и очисткой из организма или культивируемой клетки,
(2) химическим синтезом или
(3) с использованием технологии рекомбинантной ДНК,
предпочтительно способом, описанным в (3), в промышленном производстве.
Примерами системы экспрессии (система хозяин-вектор) для получения полипептида с использованием технологии рекомбинантной ДНК являются системы экспрессии бактерий, дрожжей, клеток насекомых и клеток млекопитающих.
При экспрессии полипептида, например, в E. Coli , вектор экспрессии получают путем добавления инициирующего кодона (ATG) к 5′-концу кДНК, кодирующей зрелый пептид, соединяя полученную таким образом кДНК с ниже подходящего промотора (например, промотора trp, промотора lac, промотора λ PL и промотора Т7), а затем вставляют его в вектор (например, pBR322, pUC18 и pUC19), который функционирует в штамме E. coli .
Затем штамм E. coli (e.g., штамм E. coli Dh2, штамм E. coli JM109 и штамм E. coli HB101), которые трансформированы вектором экспрессии, описанным выше, можно культивировать в подходящей среде для получения желаемого полипептида. Когда используется сигнальный пептид бактерий (например, сигнальный пептид pel B), желаемый полипептид также может высвобождаться в периплазму. Кроме того, слитый белок с другим полипептидом также может быть легко получен.
При экспрессии полипептида, например, в клетках млекопитающих, экспрессионный вектор получают, вставляя кодирующий ДНК нуклеотид, показанный в SEQ ID NO.3, 6 или 9 ниже правильного промотора (например, промотора SV40, промотора LTR и промотора металлотионеина) в подходящем векторе (например, ретровирусном векторе, векторе вируса папилломы, векторе вируса осповакцины и векторе SV40). Соответствующая клетка млекопитающего (например, клетка COS-1 обезьяны, клетка COS-7, клетка СНО китайского хомячка, L-клетка мыши и т. Д.) Трансформируется полученным таким образом вектором экспрессии, а затем трансформант культивируется в подходящей среде, секреторный белок по настоящему изобретению может секретироваться в культуральную среду в виде целевого полипептида.Затем путем связывания с фрагментом кДНК, кодирующим другие полипептиды, например, с общей областью (частью Fc) антитела, слитые белки могут быть получены. Полипептиды, полученные описанным выше способом, можно выделить и очистить обычными биохимическими методами.
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что полипептид более высоко экспрессируется в неоинтиме, чем в средней оболочке гладких мышц сосудов. Таким образом, предполагается, что полипептид по настоящему изобретению полезен для терапевтического лечения рестеноза после ЧТКА и артериального склероза в области сердечно-сосудистой системы.
Кроме того, поскольку полипептид по настоящему изобретению показал подавляющую активность в отношении пролиферации клеток в экспериментах и структурное сходство со структурой VEGF, предполагается, что полипептид может обладать следующими активностями.
(1) Активность цитокинов и активность пролиферации / дифференцировки клеток
Поскольку полипептид по настоящему изобретению подавляет пролиферацию клеток в системе сверхэкспрессии, он может проявлять цитокиновую активность, активность в отношении пролиферации (индуцирования или ингибирования) или дифференцировку клеток. (индуцирующая или ингибирующая) активность или может индуцировать или подавлять продукцию других цитокинов в определенных популяциях клеток.
(2) Иммуностимулирующая / подавляющая активность
Полипептид по настоящему изобретению может также проявлять иммуностимулирующую или иммуносупрессивную активность. Полипептид по изобретению может быть полезен при лечении различных иммунодефицитов и нарушений, например, для регулирования (стимуляции или подавления) роста и пролиферации Т- и / или В-лимфоцитов, а также воздействия на цитотоксичность NK-клеток и других клеточные популяции. В частности, предполагается, что полипептид по настоящему изобретению может проявлять подавляющую активность против метастазов лимфогенной опухоли, вызванной васкуляризацией опухоли.
(3) Подавляющая активность против ишемической васкуляризации
Полипептид по настоящему изобретению может подавлять диабетическую ретинопатию. Известно, что VEGF проявляет активность васкуляризации, вызванную ишемией. Васкуляризация при диабетической ретинопатии также является ишемической васкуляризацией после образования авазокулярных областей сетчатки. Структурное сходство с нейрофилином позволяет предположить, что белок по настоящему изобретению может подавлять рост кровеносных сосудов, поскольку новый рецептор VEGF, следовательно, может оказывать терапевтическое действие на диабетическую ретинопатию.
Введение или использование белка или кДНК, кодирующей белок (например, генная терапия (включая регенеративную терапию) или векторов, подходящих для трансфекции кДНК), может обеспечить эффект или биологическую активность, описанную в отношении белка по изобретению.
Количественный анализ полипептида настоящего изобретения in vivo можно проводить с использованием поликлональных или моноклональных антител против полипептида настоящего изобретения. Его можно использовать в исследованиях связи между этим полипептидом и заболеванием или диагностике заболевания и т. Д.Поликлональные и моноклональные антитела могут быть получены с использованием этого полипептида или его фрагмента в качестве антигена обычными способами.
Идентификация, очистка или молекулярное клонирование известных или неизвестных белков (лигандов), которые связаны с полипептидом настоящего изобретения, могут быть выполнены с использованием полипептида настоящего изобретения, например, путем приготовления аффинной колонки.
Идентификация молекул, которые взаимодействуют с полипептидом, молекулярное клонирование гена может быть проведено, например, вестерн-блоттингом с использованием полипептида или дрожжевым двугибридным методом с использованием кДНК (желательно кДНК, кодирующей полипептид).
Метод скрининга, который может идентифицировать агонисты или антагонисты против рецептора полипептида и ингибиторы против взаимодействия между рецепторами и молекулами передачи сигнала, может быть выполнен с использованием полипептида.
Например, метод скрининга может быть выполнен с помощью следующих этапов:
a) Полипептид по изобретению, соединение, подлежащее скринингу, и реакционная смесь, включая клетки, смешиваются (реакционная смесь включает пептиды, за исключением маркеров, которые переносятся в клетки. по мере роста клетки и за исключением полипептида для эффективного наблюдения за функцией полипептида.) при условии, что клетки обычно стимулируются полипептидом, тогда
b) определяют, является ли соединение подходящим агонистом или антагонистом, путем измерения роста клеток.
кДНК по настоящему изобретению может быть полезной не только как важная и необходимая матрица для получения полипептида по настоящему изобретению, который, как ожидается, будет иметь значительную полезность, но также для диагностики и лечения наследственных заболеваний (лечения дефицита гена). или способы лечения, при которых антисмысловые ДНК (РНК) перехватывают экспрессию полипептидов и т.д.).Кроме того, геномные ДНК могут быть выделены с использованием кДНК по изобретению в качестве зонда.
Для лечения заболеваний, упомянутых выше, введение полипептида по изобретению или его антител может осуществляться общим или местным, обычно пероральным или парентеральным путями. Предпочтительно пероральное, внутривенное и интрацеребровентрикулярное введение.
Вводимая доза зависит от возраста, массы тела, симптомов, желаемого терапевтического эффекта, пути введения, продолжительности лечения и т. Д.У взрослых людей одна доза на человека обычно составляет от 100 мкг до 100 мг при пероральном введении до нескольких раз в день и от 10 мкг до 100 мг при парентеральном введении до нескольких раз в день.
Как упоминалось выше, используемые дозы зависят от различных условий. Следовательно, есть случаи, когда можно использовать дозы ниже или выше диапазонов, указанных выше.
Полипептид или соединения по настоящему изобретению можно вводить в виде твердых композиций, жидких композиций или других композиций для перорального введения, в виде инъекций, линиментов или суппозиториев и т. Д.для парентерального введения.
Примеры твердых композиций для перорального введения включают прессованные таблетки, пилюли, капсулы, диспергируемые порошки и гранулы. Примеры капсул включают мягкие и твердые капсулы.
В таких композициях одно или несколько активных соединений представляют собой или смешиваются по крайней мере с одним инертным разбавителем (таким как лактоза, маннит, глюкоза, гидроксипропилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, крахмал, поливинилпирролидон, метасиликат алюминат магния и т. Д. .). Композиции также могут содержать, как это принято на практике, дополнительные вещества, кроме инертных разбавителей: например, смазывающие агенты (такие как стеарат магния и т. д.), дезинтегрирующие агенты (такие как гликолят кальция целлюлозы и т. д.), стабилизирующие агенты (такие как человеческий сывороточный альбумин, лактоза и т. д.) и вспомогательные агенты для растворения (такие как аргинин, аспарагиновая кислота так далее.).
Таблетки или пилюли при желании могут быть покрыты пленкой из желудочных или кишечных материалов (таких как сахар, желатин, гидроксипропилцеллюлоза или фталат гидроксипропилметилцеллюлозы и т. Д.)), или быть покрытым более чем двумя пленками. Кроме того, покрытие может включать в себя удерживание внутри капсул рассасывающихся материалов, таких как желатин.
Жидкие композиции для перорального введения могут содержать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, а также могут содержать обычно используемые инертные разбавители (очищенная вода, этанол и т. Д.). Помимо инертных разбавителей, такие композиции могут также содержать адъюванты (такие как смачивающие агенты, суспендирующие агенты и т.д.), подсластители, ароматизаторы, отдушки и консерванты.
Другие композиции для перорального введения включают композиции в виде спреев, которые могут быть получены известными способами и которые содержат одно или несколько активных соединений. Композиции для спрея могут содержать дополнительные вещества, отличные от инертных разбавителей: например, стабилизирующие агенты (сульфит натрия и др.), изотонический буфер (хлорид натрия, цитрат натрия, лимонная кислота и др.). Для приготовления таких композиций для спрея, например, способ, описанный в патенте США No. № 2868691 или патенте США. Нет.Можно использовать 3 095 355 (включенных в настоящее описание в качестве ссылки).
Инъекции для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. В таких композициях одно или несколько активных соединений представлены или смешаны по меньшей мере с одним инертным водным разбавителем (дистиллированной водой для инъекций, физиологический солевой раствор и т. Д.) Или инертными неводными разбавителями (пропиленом). гликоль, полиэтиленгликоль, оливковое масло, этанол, POLYSOLBATE 80 ™ и т. д.).
Инъекции могут содержать дополнительное соединение, кроме инертных разбавителей: например, консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты, диспергирующие агенты, стабилизирующие агенты (такие как человеческий сывороточный альбумин, лактоза и т. д.) и вспомогательные агенты, такие как вспомогательные агенты для растворения (аргинин, аспарагиновая кислота и т. д.).
Изобретение поясняется следующими примерами, но не ограничивает изобретение.
Первичная культура нормальных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (hCAEC) и гладкомышечных клеток (hCASMC), приобретенных у Clonetech, и совместное культивирование (равное количество эндотелиальных и гладкомышечных клеток смешивали и поддерживали в EGM-2-MV (торговля name, продукт Bio Whittaker) в течение двух дней) использовали в качестве источников для создания библиотек кДНК и ловушки для сигнальной последовательности дрожжей (см. U.С. Пат. № 5 536 637). ESDN, содержащий домен CUB, был выделен из библиотеки кДНК, полученной из совместной культуры.
Клонирование 5′- и 3′-концевых областей кДНК было выполнено методами 5′- и 3′-RACE (Rapid Amplication cDNA End) с использованием набора Marathon cDNA Amplification Kit (торговое название, продукт CLONTECH) для изолировать полноразмерную кДНК. Мыши и крысы были получены с помощью ОТ-ПЦР с использованием двух типов пар праймеров на основе данных о последовательности человека.
Мышиные праймеры:
| (SEQ ID NO.10) | |
| 5′-CTG-CTC-CAA-CTC-CTC-CTC-CTT-C-3 ‘ | |
| (SEQ ID NO. 11) | |
| 5′-CTG-CTT-CAT-TCC-TTT-CCA-CCA-ACC-TG-3 ‘ |
Праймеры для крыс:
| (SEQ ID NO. 12) | |
| 5′-TGT-GCT-GGT-CAT-GGT-CCT-CAC-TAC-TCT-C-3 ‘ | |
| (SEQ ID NO.13) | |
| 5′-TGT-GCT-TTA-AAA-CGA-TGC-TTT-G-3 ‘. |
В результате было обнаружено, что выравнивание аминокислотных последовательностей человека, мыши и крысы показало высокую гомологию между ними. Однако метод 5′-RACE не смог достичь 5′-концевой последовательности, содержащей дефинитивный стартовый кодон, ATG, ни у одного вида из-за высокого содержания GC в 5′-области ESDN. Поэтому изобретатели провели скрининг геномной библиотеки мышей с библиотекой Lambda FIXII (торговое название, продукт Stratagene Inc.), чтобы получить два положительных клона, содержащих сайт инициации трансляции (Met). Двойники человека и крысы получали с помощью ОТ-ПЦР с использованием смыслового праймера 5′-GCA-CTA-TGC-GGG-CGG-ATT-GC-3 ‘(SEQ ID NO. 14), содержащего первый метионин ESDN мыши и антисмысловой праймер 5’-GGA-TGT-AAG-GGT-TCC-ACT-CTC-AGG-3 ‘(SEQ ID NO. 15), расположенный в нижнем экзоне (который не включен в геномный клон). Выравнивание трех продуктов показано на фиг. 1 с аминокислотной гомологией между человеком и грызунами и между мышью и крысой составляла 84-5% и 92% соответственно.
Поиск мотивов показал, что ESDN является трансмембранным белком типа I, состоящим из домена CUB и домена, подобного FV / VIII, и напоминает нейропилин (с двумя доменами CUB, двумя доменами фактора FV / VIII и доменом MAM) в структура. Поиск гомологии последовательности в другой области показал, что область имеет значительную гомологию с Limulus, фактором C и Coch, который является одним из причинных генов нарушения слуха, и имеет консервативный домен с четырьмя цистеинами. В домене Coch сходятся все четыре вида мутаций, идентифицированных на сегодняшний день при расстройстве глухоты DFNA9.Таким образом, этот домен был обнаружен в белке Limulus , который в процессе эволюции был отделен от генеалогического дерева, так что предполагается, что структура этого домена может быть новой доменной структурой. (Показано на фиг. 2 и 3)
Конструкции ESDN человекаклонировали в pEF6V5-His (торговое название, продукт Invitrogen Corp.), заменяя исходный эпитоп V5 меткой FLAG. Эти векторы экспрессии трансфицировали в клетки 293T и COST с помощью CellPhect (торговое название, продукт Amersham BioSciences) и липофектамина (торговое название, продукт Life Technologies, Inc.), соответственно. Далее, после приготовления клеточного лизата целевой белок детектировали вестерн-анализом с использованием различных антител.
Кроличьи поликлональные антитела против CUB и против FV / VIII были индуцированы против KLH-конъюгированных полипептидов GERIRIKFGD G DIEDSD (SEQ ID NO. 16) и QDKIFQGNKDYHKDVRNN (SEQ ID NO. 17), соответственно, против каждого полипептида от Sawady Technology. Вестерн-анализ проводили в соответствии с протоколами вестерн-блоттинга ECL (торговое название, продукт Amersham BioSciences) или Renaissance (торговое название, продукт NEN Life Science).Другое используемое антитело представляет собой моноклональное антитело против FLAG M2 (торговое название, продукт Sigma-Aldrich Co.). В результате были обнаружены белковые полосы 127, 106, 93 кДа, которые не были обнаружены в лизате клеток, трансфицированных только вектором экспрессии. (Показано на фиг. 6)
Профиль гидрофобности аминокислотной последовательности ESDN показал, что предсказанная сигнальная последовательность ESDN очень длинная и атипичная. Клетки COS7, трансфицированные полноразмерной кДНК человека, фиксировали в 4% растворе параформальдегида и реагировали с первичным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей реакцией со вторым антителом в течение 30 минут.Затем их наблюдали и анализировали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом Bio-Rad после двойного окрашивания техасским красным антимышиным IgG (торговое название, продукт Vector Libraries, Ltd.) и FITC-анти-кроличьим IgG (Jackson Laboratories. ). В результате было подтверждено, что этот белок экспрессируется на поверхности клетки. (Показано на фиг. 7)
Затем изобретатели попытались подтвердить местоположение сайта расщепления сигнальной последовательности.
Конструкции ESDN мыши повторно клонировали в вектор экспрессии pCAGGS с mESDN-Ex (Edns), который был сконструирован с С-концом внеклеточной части ESDN мыши, связанной с 6 × His-меткой.Кроме того, другая конструкция, mESDN-Ex (CD5), чья сигнальная последовательность была заменена последовательностью человеческого CD5; Был получен MPMGSLQPLATLYLLGMLVASVLA (SEQ ID NO. 18). Клетки 293T временно трансфицировали этими конструкциями, и культуральные среды анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием поликлонального антитела His-probe H-15 (торговое название, продукт Santa Cruz Biotechnology Inc.) для обнаружения целевых белков. В результате было подтверждено, что обе конструкции, mESDN-Ex (Edns) и mESDN-Ex (CD5) давали белковый продукт точно одинакового размера.(Показано на фиг. 5) Поскольку размер CD5 человека короче, чем размер аминокислотных остатков ESDN 39 мыши, этот результат подтверждает, что два белка принадлежат одному и тому же участку сайтов расщепления сигнальной последовательности. (Показано на фиг. 8)Зооблот-анализ по Саузерну выполняли с зооблотом человека ESDN, меченным [ 32 P] dCTP, у всех млекопитающих (мышь, крыса, кролик, корова и человек), Xenopus , муха и дрожжи (при 37 ° C, промывка 1 × SSC). Помимо сильных полос, наблюдаемых у всех млекопитающих, слабые полосы были обнаружены у Xenopus .У мух и дрожжей полос не наблюдалось. (Показано на фиг. 9A)
Поиск STS (сайта с последовательностью) в последовательности ESDN человека показал, что он содержит два независимых клона STS, stSG29921 и sts-D29024, которые картированы в окрестностях D3S1603-D3S1271 и D3S1552- D3S1603 на радиационной гибридной карте (сайты, которые, как ожидается, будут соответствовать хромосоме 3q11.2 на цитогенетической карте), соответственно. Чтобы подтвердить этот результат из базы данных, для геномной Саузерн-гибридизации использовали линии клеток мыши A9 (Neo3) и A9 (Neo12) (JCRB Cell Bank).Поскольку зонд ESDN человека идентифицировал полосу кросс-гибридизации мыши в обеих дорожках, ESDN мыши был подтвержден как в A9 (Neo3), так и в A9 (Neo12), тогда как полосы человека присутствовали только на дорожке A9 (Neo3). Таким образом, эти результаты показали, что ген ESDN человека расположен в диапазоне, который соответствует цитогенетической области хромосомы 3p11.2 (показано на фиг. 9B)
Суммарная РНК, полученная из hCAEC, hCASMC и смешанной совместной культуры с использованием TRIzol ( торговое название, продукт Life Technologies) были использованы в Нозерн-анализе культивируемых клеток человека.В Нозерн-анализе организаций или клеток крыс использовали общую РНК, полученную из цельной крови и других организаций или культивированных клеток с использованием TRIzol LS и TRIzol соответственно. Затем поли (A) + РНК очищали с помощью Oligotex ™ -dT30 Super (торговое название, продукт Roche Molecular Biochemicals) и проводили Нозерн-анализ (при 65 ° C, промывание 2 × SSC) с использованием человека и крысы. ESDN, их зонды GAPDH, меченные [ 32 P] dCTP. ESDN был высоко экспрессирован в hCASMC (6,4, 3 т.п.н.), тогда как экспрессия в hCAEC была слабее, чем в hCASMC.Кроме того, изменений мРНК ESDN в смешанной совместной культуре не наблюдалось. (Показано на фиг. 10A)
При Нозерн-блот-анализе различных клеток или тканей крысы не было обнаружено ESDN в клетках цельной крови, а экспрессия в печени была очень слабой. (Показано на фиг. 10B)
hCASMC культивировали в среде DMEM / 2 мМ глутанина, обедненной сывороткой, в течение 48 часов, затем стимулировали средой, содержащей PDGF-BB, AT-II или FCS (торговые названия, продукты Sigma- Alsrich Co. и Life Technologies, Inc.) в указанных концентрациях. Тотальную РНК экстрагировали с помощью TRIzol (торговое название, продукт Life Technologies, Inc.), кДНК синтезировали с использованием системы преамплификации SuperScript для синтеза первой цепи кДНК (Life Technologies, Inc.). Кроме того, мРНК измеряли с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей PE Applied Biosystems Prism Model 7700. Нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров следующие.
| (SEQ ID N0.19) |
| ESDN вперед: |
| 5′-CCC-AGC-AAG-GTG-ATG-GAT-G-3 ‘ |
| (SEQ ID NO. 20) |
| ESDN, обратный: |
| 5′-CAA-GAA-TCA-GAA-TCT-TCA-ATG-TCA-AAG-3 ‘ |
| (SEQ ID NO. 21) |
| Зонд ESDN: |
| 5 ′ — (6-FAM) -CCT-GAG-AGT-GGA-ACC-CTT-ACA-TCC-ATA- |
| AAC- (TAMRA) -3 ′ |
Они были основаны на человеческой последовательности, но было подтверждено, что они применимы и к количественным измерениям транскриптов грызунов.Нуклеотидные последовательности человеческого GAPDH следующие.
| (SEQ ID NO. 22) | |
| Человеческий GAPDH вперед: | |
| 5′-GAA-GGT-GAA-GGT-CGG-AGT-C-3 ‘ | |
| (SEQ ID NO. 23) | |
| Обратный GAPDH человека: | |
| 5′-GAA-GAT-GGT-GAT-GGG-ATT- | |
| (SEQ ID NO.24) | |
| Зонд человеческого GAPDH: | |
| 5 ‘- (VIC) -CAA-GCT-TCC-CGT-TCT-CAG-CC- (TAMRA) -3’ |
Taq Контрольные реагенты GAPDH грызунов (биосистемы PE) использовали для измерения GAPDH крыс. Уровень мРНК ESDN и GAPDH означает
копий, поэтому стандартные кривые могут быть построены из известного количества плазмид с ампликонами ESDN или GAPDH, субклонированных в pBlueScript SK (-) (Stratagene), и нормализованный к этому уровень мРНК ESDN. GAPDH был использован для дальнейшего анализа.
Результаты количественной ОТ-ПЦР показали, что ESDN активируется дозозависимо с помощью PDGF-BB, но не стимуляцией AT-II. FCS также дозозависимо увеличивал экспрессию ESDN, но намного меньше, чем PDGF-BB. (Показано на фиг. 11)
Сонные артерии собирали через 0, 5 или 14 дней после баллонного повреждения (n = 5 на 0, 5 день, n = 4 на 14 день). Тотальную РНК экстрагировали с помощью TRIzol (торговое название, продукт Life Technologies, Inc.), кДНК синтезировали с использованием системы предварительной амплификации SuperScript для набора для синтеза первой цепи кДНК (Life Technologies, Inc.). Кроме того, мРНК измеряли с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей PE Applied Biosystems Prism Model 7700. Количественный анализ RT-PCR показал, что экспрессия мРНК ESDN крысы демонстрирует тенденцию к повышению регуляции на 5-й день и значительное увеличение на 14-й день на 30%. Затем для выяснения экспрессии ESDN было проведено иммуногистохимическое исследование. (Показано на фиг. 12)
Под анестезией обработанных или необработанных крыс перфузировали физиологическим раствором, охлажденным до 4 ° C.заранее. Затем ткани с местной перфузией фиксировали холодным 4% параформальдегидом, собранные сонные артерии помещали в Tissue-Tek O.C.T. Соединение (торговое название, продукт Sakura Finetechnical Co., Ltd.) на бане сухой лед / этанол. Заложенные сонные артерии нарезали толщиной 4 мкм и подвергали иммуногистохимическому анализу методом с использованием комплекса авидин-биотин-щелочная фосфатаза (Vector Laboratories). Подложка Vector Red (торговое название, продукт Vector Laboratories, Inc.), который реагировал с щелочной фосфатазой, окрашивал срезы, чтобы контрастировать с окрашиванием метил-зеленым. В качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антипептидные поликлональные антитела в концентрации 5-10 мкг / мл, а нормальный кроличий IgG (DAKO) использовали в той же концентрации для отрицательных контролей. Результат показал, что средняя оболочка аорты и общая сонная артерия в гладких мышцах сосудов были окрашены, и что части (стрелка) центральной нервной системы, головного и спинного мозга и т. Д., А также периферическая часть, блуждающие нервы (наконечники стрелок) и т. Д. Были довольно заметны. окрашенный.(Показано на фиг. 13) A, B, E и F окрашивали антителом против CUB, а C, D, G и H окрашивали равной концентрацией кроличьего IgG в качестве первичного антитела (контроль). M и N, показанные на E и F, обозначают среднюю оболочку и неоинтиму соответственно.
Конструкции ESDN полноразмерного ESDN человека (hESDN-FL) и делеционные мутанты (hESDN-Δ EC, hESDN-Δ Cy), клонированные в один вектор экспрессии, получали с помощью набора QIAfilter Plasmid Midi Kit (QIAGEN). Затем их дважды очищали экстракцией фенолом / CIAA и один раз экстракцией CIAA.Клетки 293T трансфицировали этими векторами экспрессии с помощью CellPhect (Amersham Life Science). После 12 часов инкубации с раствором для трансфекции среду заменяли свежей DMEM + 10% FCS и инкубировали в течение 2 часов.