Сп 3 1 3 2 3146 13: 16.12.2013 N 65 » 3.1/3.2.3146-13″ |

Нормативные документы | Официальный сайт журнала «СЭС» (Санитарно-эпидемиологческий собеседник)

ПЕРЕЧЕНЬ ОСНОВНЫХ САНИТАРНЫХ ПРАВИЛ И НОРМАТИВОВ

СОКРАЩЕНИЯ. ГТ – гигиенические требования.

СЭТ – санитарно-эпидемиологические требования

Нормативные документы

 

Вступили в силу с 1 января 2021 года

 

 

 

 

 

Вступили в силу с 1 марта 2021 года

 

ОСНОВНЫЕ ФЕДЕРАЛЬНЫЕ ЗАКОНЫ, ПРАВИЛА, РЕГЛАМЕНТЫ

О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения

О защите прав потребителей

О защите прав юридических лиц и индивидуальных предпринимателей при проведении государственного контроля (надзора) и муниципального контроля

О лицензировании отдельных видов деятельности

О полиции

Об основах охраны здоровья граждан

Об охране окружающей среды

О качестве и безопасности пищевых продуктов

Об иммунопрофилактике инфекционных болезней

Об образовании

О техническом регулировании

О порядке рассмотрения обращений граждан

Кодекс РФ об административных правонарушениях

Трудовой кодекс РФ

Жилищный кодекс РФ

Таможенный кодекс Таможенного союза

Единые санитарно-эпидемиологические и ГТ к товарам, подлежащим
санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) (с изм. и доп.)

Правила торговли, оказания услуг, в том числе бытового обслуживания, медицинских, почтовых, гостиничных, образовательных услуг, услуг общественного питания и др.

Р 3.5.1904-04. Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха
в помещениях

МУ 3.5.2644-10. Организация и проведение дезинфекционных мероприятий при дерматомикозах

 

МУ 2.3.975-00. Применение ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздушной среды помещений организаций пищ. пром., общественного питания и торговли продовольственными товарами

Правила оказания услуг общественного питания

Правила торговли

 

МР 3.5.1.0113-16. Использование перчаток для профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в медицинских организациях

МУ 3.5.1.3439-17. Оценка чувствительности к дезинфицирующим средствам микроорганизмов, циркулирующих в медицинских организациях

МУ 3.1.2313-08. Требования к обеззараживанию, уничтожению
и утилизации шприцев инъекционных однократного применения

Р 3.5.1904-04. Использование ультрафиолет. бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях

СП 1.1.1058-01. Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпид. (профилактических) мероприятий

СП 3.1/3.2.3146-13. Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней

СП 3.1.5.2826-10. Профилактика ВИЧ-инфекции

СП 3.1.958-00. Профилактика вирусных гепатитов

СП 3.1.1. 2341-08. Профилактика вирусного гепатита В

СП 3.1.3112-13. Профилактика вирусного гепатита C

СП 3.5.1378-03. СЭТ к размещению к организации и осуществлению дезинфекционной деятельности

СанПиН 3.5.2.1376-03. СЭТ к размещению к организации

и проведению дезинсекционных мероприятий против синантропных членистоногих

СП 3.5.3.1129-02. СЭТ к проведению дератизации

СанПиН 2.2.0.555-96. ГТ к условиям труда женщин

СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. ГТ к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения

СанПиН 2.1.2.2645-10 СЭТ к условиям проживания
в жилых зданиях и помещениях (при функционировании объекта на первых этажах жилых домов)

МУ 3.5.2644-10. Организация и проведение дезинфекционных мероприятий при дерматомикозах

МУ 287-113. Метод. указ. по дезинфекции, предстерилизац. очистке и стерил. изд. медназначения

РЕНТГЕН (отдельные требования
для рентгенкабинетов в медорганизациях

)

СП 2.6.1.2612-10. Осн. сан. прав. обесп. рад. безоп.
(ОСПОРБ – 99/2010) (с изм. и доп.)

СанПиН 2.6.1.2523-09. Нормы радиационной безопасности (НРБ-99/2009)

СанПиН 2.6.1.1192-03. ГТ к уст. и экспл. рентген. каб.,
аппаратов и пров. рентг. исслед

СанПиН 2.6.1.2891-11. Требования радиац. безопасности при производстве, эксплуатации и выводе из экспл. (утилизации) медтехники, содержащей источн. ионизир. излуч

МУ 2.6.1.1982-05. Проведение радиац. контроля в рентгеновских кабинетах

МУ 2.6.1.2944-11. Контроль эффект. доз облуч. пациентов при пров. мед. рентг. иссл.

МУ 2.6.1.3015-12. Орг. и пров. индивид. дозиметрич. контр. Персонал медорганизаций

МР 2.6.1.0066-12. Применение референтных

диагностических уровней для оптимизации радиационной защиты пациента в рентгенологич. исследованиях общего назначения

УЗИ (отдельные требования для кабинетов УЗИ в медорганизациях)

Р 2.2.4/2.2.9.2266-07. ГТ к условиям труда медработников, выполняющих УЗИ

ЭНДОСКОПИЯ (отдельные требования для кабинетов эндоскопии)

Обеспечение эпидемиологической безопасности нестерильных эндоскопических вмешательств на желудочно-кишечном тракте и дыхательных путях. МУ 3.1.3420-17

ЛАБОРАТОРИИ (работа с микро-организмами I-II, III-IV групп патогенности)

МУ 1.3.2569-09. Организация работы лаборат., использующ. методы амплификации нуклеиновых кислот при работе

с материалом, содержащим микроорг. I-IV групп патоген.

МУ 4.2.2039-05. Техника сбора и трансп. биоматериалов в микробиолог. лаборатории

ПРОФИЛАКТИКА

• Организация работы в очагах инфекционных и паразитарных болезней. МУ 3.1.3114/1-13
• Эпид. надзор за внебольничными пневмониями. МУ 3.1.2.3047-13
• Эпид. надзор, лаб. диагност. и профилактика ротавирусной инфекции. МУ 3.1.1.2957-11
• Эпиднадзор, лаб. диагн. и проф. норовирусной инфекции.
  МУ 3.1.1.2969-11
• Порядок проведения профилактических прививок. МУ 3.3.1889-04

• Орг. раб. привив. каб. детск. поликл., каб. иммунопр. и привив. бригад. МУ 3.3.1891-04
• Применение термоиндикаторов. МУ 3.3.2.2437-09

и более 200  правил, нормативов, законов, методических указаний, технических регламентов

По вопросам приобретения санитарных правил, нормативов, методических указаний, журналов, законов, оформления подписки на журнал «СЭС» за наличный или по безналичному расчету обращаться по тел.: (495) 508 3383, (499) 393 3803

Ответы на главные вопросы работодателей об обязательной вакцинации 60% персонала

В связи с поступающими вопросами от руководителей организаций, индивидуальных предпринимателей (далее — работодатели) об обязательной вакцинации 60% работников организаций, определенных постановлением Главного государственного санитарного врача по Пермскому краю, Уполномоченным по защите прав предпринимателей в Пермском крае сделан запрос с просьбой дать разъяснения на часто задаваемые вопросы в Управление Роспотребнадзору по Пермскому краю. Предлагаем ознакомиться с позицией Главного государственного санитарного врача по Пермскому краю

.

1. Обязан ли работодатель организовать вакцинацию от COVID-19 работников, сотрудников, входящих в перечень сфер, утвержденных постановлением?

В силу требований федерального законодательства руководители организаций, индивидуальные предприниматели (далее — работодатели) в период эпиднеблагополучия обязаны обеспечить проведение вакцинации работников, сотрудников от COVID-19 в сроки, установленные Главным государственным санитарным врачом по Пермскому краю: первым компонентом вакцины или однокомпонентной вакциной в срок до 15 августа 2021г., вторым компонентом вакцины в срок до 15 сентября 2021г.

В соответствии с п. 6 ч. 1 ст. 51 Федерального закона от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (далее — Федеральный закон № 52-ФЗ), ст. 10 Федерального закона от 17.09.1998 № 157-ФЗ «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» (далее — Закон № 157-ФЗ), п. 18.3 СП 3.1/3.2.3146-13 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней», Приказом Минздрава России от 21.03.2014 № 125н «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям» (зарегистрирован в Минюсте России 25.04.2014 № 32115) Главным государственным санитарным врачом по Пермскому краю принято Постановление от 13.07.2021 № 206, предусматривающее проведение обязательной вакцинации отдельных групп населения по эпидемическим показаниям.

В силу ст. 10, ст. 11 Федерального закона № 52-ФЗ граждане, а также работодатели обязаны выполнять требования санитарного законодательства, а также постановлений, предписаний осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор должностных лиц.

При этом работодатели обязаны проводить санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия. К таким мероприятиям относятся, в том числе, и профилактические прививки, санитарно-просветительная работа среди населения, проводимые в целях предупреждения возникновения и распространения инфекционных заболеваний (п. 2 ст. 25, п. п. 1 и 3 ст. 29, ст. 35 Федерального закона № 52-ФЗ).

Профилактика инфекционных заболеваний осуществляется работодателями, в частности, путем осуществления программы иммунопрофилактики инфекционных болезней в соответствии с национальным календарем профилактических прививок, которые доступны для всех граждан и проводятся бесплатно (ч. 1 ст. 30 Федерального закона от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» (далее — Закон № 323-ФЗ), п. 2 ст. 4 Закона № 157-ФЗ). Прививки от COVID-19 включены в национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, утвержденный Приказом Минздрава России от 21.03.2014 № 125н (далее — НК).

Также, согласно ч. 1 ст. 209, ст. 212 Трудового кодекса Российской Федерации (далее — ТК РФ) работодатель обязан обеспечить безопасные для работников условия труда и охраны труда, в том числе и путем проведения санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий, т.е. организационных, административных, медико-санитарных и иных мер, направленных на предотвращение возникновения и распространения инфекционных заболеваний и их ликвидацию.

2. В постановлении № 206 указана цифра 60% вакцинированных от общей численности сотрудников. Кто имеется в виду — только вакцинированные? Или в этих 60% также учитываются лица, имеющие медицинский отвод от прививки и ранее переболевшие COVID-19 с наличием антител?

В 60% привитых учитываются исключительно работники (сотрудники), получившие вакцинацию. Они могут быть привиты любой зарегистрированной вакциной. В оставшихся 40% учитываются сотрудники, имеющие временные медицинские отводы, переболевшие коронавирусом, и другие лица на усмотрение самих организаций.

3. Сотрудники, работающие удаленно (дистанционно), и самозанятые, привлеченные на основании договоров, включаются в общий штат при определении процента вакцинированных?

Да, включаются.

4. На основании каких требований будет осуществляться отнесение сферы деятельности юридического лица к перечисленным в пункте 1 Постановления № 206, в частности торговля, транспорт общего пользования (ОКВЭД/ОКОНХ, иные критерии)?

В Постановлении № 206 определяется категория лиц, которые по сфере своей деятельности имеют высокий уровень эпидемиологических контактов и участвуют в цепочке передачи вирусов. К сфере торговли относятся все работники данной сферы, включая работников оптовой и дистанционной торговли. И хотя оптовая и дистанционная торговля не предусматривает посещения гражданами общественных мест, но тем не менее предполагает прямой контакт с конечным потребителем в момент получения товара.

Под транспортом общего пользования, указанным п. 1 Постановления № 206, понимаются исключительно общественный транспорт и такси (пассажирский транспорт), предусматривающие контакт сотрудников с гражданами-пассажирами.

5. Кому положен медицинский отвод, то есть кто из работников не подлежит обязательной вакцинации?

Вопрос установления противопоказаний для проведения вакцинации пациенту относится исключительно к компетенции врача, обследующего больного перед прививкой. В каждом отдельном случае с учетом анамнеза конкретного лица и состояния его здоровья именно врачом принимается решение о наличии оснований для медицинского отвода от проведения вакцинации.

6. Какие титры антител к коронавирусу приравниваются к прививке?

Постановлением № 206 не предусмотрено исключение для лиц, имеющих какие-либо титры антител к коронавирусу.

Согласно пункту 2.21 Методических рекомендаций Минздрава России от 29.06.2021 № 30-4/И/2-9825 «Порядок проведения вакцинации взрослого населения против COVID-19» (далее — МР № 30-4/И/2-9825) вакцинация против новой коронавирусной инфекции COVID-19 проводится без необходимого изучения и учета данных гуморального иммунитета. В настоящий момент не существует утвержденного маркера (определенного защитного уровня антител). Работы по выработке такого параметра находятся в стадии исследований и пока не приняты, в том числе ВОЗ. Имеющиеся в настоящий момент тест-системы для определения клеточного иммунитета не могут использоваться в широком обороте из-за отсутствия достоверных данных по интерпретации результатов исследования (длительность защиты, ее выраженность (протективность) и степень устойчивости иммунной системы к ответу на мутацию вируса).

В данный связи согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения важно своевременно вакцинироваться вне зависимости от наличия и количества антител.

7. Обязательно ли прохождение теста на антитела с титром перед вакцинацией? Какие обследования необходимо пройти, чтобы убедиться в отсутствии противопоказаний к вакцине?

Прохождение тестирования на наличие антител перед вакцинацией от COVID-19 не является обязательным согласно вышеуказанным положениям п.2.21 МР № 30-4/И/2-9825.

8. Какие основания предусмотрены законодательством для отстранения от работы сотрудника, отказавшегося от проведения профилактической прививки от COVID-19?

Постановление № 206 не предусматривает необходимость отстранения от работы сотрудника, отказавшегося от проведения вакцинации.

Вместе с тем, согласно разъяснениям Федеральной службы по труду и занятости (Письмо от 13.07.2021 № 1811-ТЗ) Трудовым кодексом РФ предусмотрена возможность отстранения работника от выполнения трудовых обязанностей. Абзацем 8 части первой статьи 76 ТК РФ предусмотрено, что отстранение возможно только в случаях, предусмотренных ТК РФ и федеральными законами, но и иными нормативными правовыми актами Российской Федерации. Одним из таких случаев является нарушение положений Федерального закона от 17.09.1998 № 157-ФЗ «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней» (далее — 157-ФЗ), согласно которым отсутствие профилактических прививок влечет отказ в приеме на работу или отстранение граждан от работ, выполнение которых связано с высоким риском заболевания инфекционными заболеваниями.

9. Как будет осуществляться контроль за исполнением работодателями постановления № 206?

Контроль за исполнением работодателем Постановления № 206 будут осуществлять должностные лица Управления Роспотребнадзора по Пермскому краю.

10. Какие санкции ожидают работодателя в случае несоблюдения требования о количестве вакцинированных сотрудников и (или) непредставления отчета о вакцинации сотрудников?

За невыполнение работодателем требований Постановления № 206 административная ответственность предусмотрена ч. 2, 3 ст. 6.3 КоАП РФ.

Вместе с тем, необходимо отметить, что Постановление № 206 имеет профилактическую направленность и вынесено в целях предупреждения распространения новой коронавирусной инфекции среди населения с ориентированием хозяйствующих субъектов и населения на проведение вакцинации против COVID-19 с целью формирования коллективного иммунитета и достижения его уровня не менее 60% от численности взрослого населения, который с учетом создавшейся эпидемической ситуации может быть достигнут путем «экстренной» вакцинации.

При проведении надзорных мероприятий по проверке исполнения Постановления № 206 Управление Роспотребнадзора по Пермскому краю будет, прежде всего, руководствоваться требованиями ст. 8 Федерального закона от 31.07.2020 N 248-ФЗ «О государственном контроле (надзоре) и муниципальном контроле в Российской Федерации», в соответствии с которой проведение профилактических мероприятий, направленных на снижение риска причинения вреда (ущерба), является приоритетным по отношению к проведению контрольных (надзорных) мероприятий. К таким мероприятиям относятся, в том числе, информирование, объявление предостережения, консультирование, профилактический визит, в ходе которых предполагается осуществить разъяснения по вопросам необходимой вакцинации.

Вопрос привлечения хозяйствующего субъекта к административной ответственности по ч. 2, 3 ст. 6.3 КоАП РФ за неисполнение Постановления № 206 будет решаться в исключительных случаях индивидуально с учетом всех обстоятельств дела.

11. Можно ли работать без масок и перчаток тем, кто привит или имеет справку с антителами?

Нет. Требование о соблюдении масочно-перчаточного режима сохраняется для всех работников (сотрудников) вне зависимости от прохождения вакцинации.

Стерилизация изделий медицинского назначения (ИМН) это

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 3

1. Комплекс мероприятий предупреждающих попадания микробов в рану

2. Уничтожение патогенных и условно патогенных микроорганизмов

3. Механическое удаление микробов с поверхности изделий медицинского назначения

4. *Обеспечивание гибели на ИМН ( внутри них) микроорганизмов всех видов в том числе и споровых форм

 

Понятие «Профилактическая дезинфекция» включает в себя

1. *Плановую профилактическую дезинфекцию

2. *Дезинфекцию по эпид. показаниям

3. *Дезинфекцию по санитарно-гигиеническим показаниям

4. Проведение текущей дезинфекции

5. Проведение заключительной дезинфекции

 

Уничтожение в окружающей среде переносчиков патогенных микроорганизмов называется

1. Дератизация

2. Дезинфекция

3. Стерилизация

4. *Дезинсекция

 

38. Режим кварцевания процедурного кабинета в учреждениях оказывающих медицинскую помощь проводится

1. Через каждые 60 мин. на 15 мин.

2. 2 раза в день

3. 3 раза в день

4. *Через 2 часа по 30 мин.

 

Вид дезинфекции которая проводится в присутствии инфекционного больного ( источника инфекции) называется

1. Заключительная

2. *Текущая

3. Очаговая

4. Профилактическая по эпидемическим показаниям

 

 

Обработка изделий медицинского назначения (ИМН) включает в себя этапы

1. *Обеззараживание

2. *Предстерилизационная очистка (ПСО)

3. *Стерилизация

4. Дезинфекция

5. Дезинсекция

6. Дератизация

 

Очаговая дезинфекция проводится

1. *При выявлении источника инфекции в эпидемическом очаге

2. *После выписки, переводе, смерти инфекционного больного

3. В помещениях ЛПО находящихся в неудовлетворительном санитарном состоянии

4. С целью не допустить распространение возбудителей ИСМП и их переносчиков в ЛПО

 

Документы, регламентирующие проведение мероприятий по дезинфекции в ЛПО

1. Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней

2. Профилактика вирусных гепатитов. Общие требования к эпидемиологическому надзору за вирусными гепатитами

3. *Санитарно-эпидемиологические требования к организации и дезинфекционной деятельности

4. Безопасность иммунизации

5. *Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность

 

Одноразовые системы для переливания крови после использования необходимо

1. Подвергнуть дезинфекции и утилизации

2. *Поместить в герметично закрытый контейнер

3. Сдать по счету старшей медсестре

4. Утилизировать по схеме удаление бытовых отходов

5. Разрезать и замочить в дезрастворе

 

Гигиеническая обработка рук проводится в соответствии с

1. СП 3.1/3.2.3146-13 общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней

2. СП 3.1.5.2826-10 профилактика ВИЧ инфекции

3. СП 3.5.1378-03 санитарно-эпидемические требования к организации и дезинфекционной деятельности

4. МР 3.5.1.013-16 Использование перчаток для профилактики инфекций связанных с оказанием медицинской помощи в медицинских организациях

5. *Сан Пин 2.1.3.2630-10 Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность

 

 

Гигиеническая обработка рук проводится

1. Перед непосредственным контактом с пациентом

2. После контакта с секретами или экскретами организма слизистыми оболочками повязками

3. После лечения пациентов с гнойными процессами

4. После каждого контакта с загрязненными поверхностями и оборудованием

5. *Все вышеперечисленное

 

Эпидемический процесс – это

1. Распространение микроорганизмов в человеческом обществе

2. Взаимодействие патогенных микроорганизмов с макроорганизмами

3. *Возникновение и распространение инфекционных заболеваний среди людей

4. Распространение микроорганизмов в окружающей среде

 

Инфекционный процесс — это

1. Распространение микроорганизмов в человеческом обществе

2. *Взаимодействие патогенных микроорганизмов с макроорганизмами проявляющиеся болезнью или носительством

3. Возникновение и распространение инфекционных заболеваний среди людей

4. Распространение микроорганизмов среди людей

 

Эпидемический процесс включает в себя

1. Проведение дезинфекционных мероприятий

2. *Источник инфекции, механизм передачи, восприимчивый организм

3. Вакцинопрофилактику

4. Источник инфекции и способы передачи возбудителей инфекционных заболеваний

 

Основной механизм заражения при кишечных инфекциях

1. Аэрогенный

2. *Фекально-оральный

3. Вертикальный

4. Контактный

 

Основной механизм заражения при гриппе и ОРЗ

1. *Аэрогенный

2. Контактный

3. Вертикальный

4. Трансмиссивный

 

Основной механизм передачи инфекции при клещевом энцефалите

1. Аэрогенный

2. Фекально-оральный

3. Артифициальный

4. *Трансмиссивный

 

 

При возникновении инфекционных заболеваний мероприятия проводятся в отношении

1. Источника инфекции

2. Путей и факторов передачи инфекции

3. *Трех звеньев эпидемического процесса

4. Восприимчего организма

 

Какие мероприятия проводятся в отношении источника инфекции

1. *Выявление и диагностика инфекционного больного

2. *Лечение инфекционного больного диспансерное наблюдение

3. Дезинфекция

4. Дезинсекция

5. Иммунизация

6. Осмотр и опрос контактных

 

Какие мероприятия проводятся в отношении путей и факторов передачи возбудителей инфекционных заболеваний

1. Выявление и диагностика случая инфекционного заболевания

2. Дератизация

3. *Дезинфекция

4. *Дезинсекция

5. Иммунизация

6. Наблюдение за очагом в течении срока инкубационного периода

 

Какие мероприятия проводятся в отношении лиц общавшихся с инфекционным больным

1. Учет и регистрация случая инфекционного заболевания

2. Дератизация

3. Дезинфекция

4. Дезинсекция

5. *Специфическая профилактика

6. *Санитарно-просветительская работа

 

Нормативно-правовые документы регламентирующие работу медицинских работников по иммунопрофилактике

1. *Федеральный закон от 30 марта 1999г № 52-ФЗ « О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения

2. *Федеральный закон от 17 сентября 1998г № 157-ФЗ « Об иммунопрофилактике инфекционных болезней»

3. *« Национальный календарь профилактических прививок и прививок по эпидемическим показаниям» утвержденный приказом Минздрава РФ от 21.03.2014 № 125н

4. СП 3.1.5.2826-10 « Профилактика ВИЧ-инфекции»

5. СП 3.5.1378-03 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и осуществлению дезинфекционной деятельности»

 

 

Иммунопрофилактика инфекционных болезней

1. *Система мероприятий, осуществляемых в целях предупреждения , ограничения распространения и ликвидации инфекционных болезней путем проведения профилактических прививок

2. *Защита организма человека от возбудителей инфекционных заболеваний после проведения профилактических прививок

3. Система мероприятий по прерыванию путей и факторов передачи инфекции

4. *Введение вакцин и сывороток населению

 

Иммунитет — это

1. Свойство организма отвечать инфекцией на введение микроорганизма

2. Введение вакцин

3. *Свойство организма отличать «свое» от «чужого»

4. Введение анатоксинов

59. 1,2,4,5

Для создания пассивного иммунитета в организм человека вводятся

1. *Иммуноглобулины

2. Вакцины

3. *Сыворотки

4. Анатоксины

 

Для создания активного иммунитета в организм человека вводятся

1. Антибиотики

2. *Вакцины

3. Сыворотки

4. Бактериофаги

5. *Анатоксины

 

Бактериофаг запивается

1. *Водой

2. Молоком

3. Минеральной водой

4. Соком

 

Место введения внутрикожной инъекции

1. Наружная поверхность бедра

2. Передняя поверхность брюшной стенки

3. Наружная поверхность плеча

4. *Внутренняя поверхность предплечья

 

Внутрикожно вводится следующие препараты

1. *Туберкулин

2. *Вакцина БЦЖ

3. Ампицилин

 

 

Положение больного во время внутримышечной инъекции в ягодицу

1. *Лежа на животе, на боку

2. Сидя

3. Стоя

4. Лежа на спине

 

Местом внутримышечного введения лекарственных препаратов является

1. Подлопаточная область

2. Внутренняя поверхность предплечья

3. Передняя брюшная стенка

4. *Дельтовидная мышца

 

ИСМП при внутривенной инъекции может проявиться

1. *Сепсисом

2. Невралгией

3. Гематомой

4. Некрозом

5. *Флебитом

 

Специфические методы профилактики инфекционных болезней

1. Витаминизация

2. Прием антибиотиков

3. *Вакцинация

4. Закаливание

 

В соответствии с Национальным календарем профилактических прививок проводятся прививки против инфекционных заболеваний

1. *Гепатит В

2. *Туберкулез

3. *Полиомиелит

4. Ветряная оспа

5. Рак шейки матки

 

Рекомендуемые страницы:

Количественное картирование взаимодействий выявляет расширенный домен UBX в ASPL, который разрушает функциональные гексамеры p97

Производство и очистка рекомбинантных белков

Полноразмерные кДНК, кодирующие человеческий ASPL и p97, были получены из библиотеки коллекции генов млекопитающих. Все плазмиды были созданы с использованием стандартных стратегий клонирования на основе ПЦР; Секвенирование по Сэнгеру подтверждено нуклеотидными последовательностями. Человеческий C-концевой His-меченный полноразмерный ASPL (остатки 1–553), ASPL-C (остатки 313–553), ASPL-C _Δ (остатки 313–500), R11-ASPL-C _Δ — EGFP (и его варианты: PP437-438AA, D351A), варианты ASPL-C _Δ -EGFP и ASPL-C, содержащие указанные мутации, были получены из pQLinkG ⁵⁷ в виде слитых GST с N-концом, за которыми следует TEV (Tobacco Etch Virus) сайт расщепления протеазой в штамме-хозяине Escherichia coli BL21 DE3 Rosetta2.Бактерии выращивали до оптической плотности 1 при 37 ° C; Экспрессию гена индуцировали с использованием 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG), и бактерии выращивали в течение ночи при 18 ° C. Клетки, ресуспендированные в PBS, содержащем 5% глицерина, 1 мкМ бензоназы (Roche) и полный коктейль ингибиторов протеазы без EDTA (Merck), разрушали короткой обработкой ультразвуком (UW 2200, Bandelin). После удаления клеточного дебриса центрифугированием супернатант инкубировали с гранулами глутатион-сефароза 4B (GE Healthcare).Затем шарики промывали PBS и связанные белки элюировали PBS, содержащим 30 мМ восстановленного глутатиона (Sigma). Элюированные белки инкубировали с протеазой TEV, меченной His ₆ , и диализовали в течение ночи против буфера А (20 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 200 мМ NaCl и 2 мМ DTT). Протеазы GST и TEV были отделены от ASPL-C с использованием гранул глутатион-сефарозы и смолы Ni-NTA (Qiagen) с последующей эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex S200 (GE Healthcare) в буфере A.Очищенные фракции ASPL-C объединяли, концентрировали (10000 MWCO, Amicon) и мгновенно замораживали в жидком азоте.

Человеческий p97 (остатки 2–806), почти полноразмерный p97 (остатки 2–766) и p97-ND1 (остатки 1–480) были продуцированы как слитые слияния с меткой His ₆ из pQLinkH (ссылка 57) в E. coli BL21 DE3 Rosetta2, используя условия, описанные для ASPL-C. Белки очищали согласно ссылке ¹⁹ . После аффинной очистки с использованием смолы Ni-NTA белки инкубировали с протеазой TEV и диализовали против буфера A в течение ночи с последующей эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex S200 (GE Healthcare) в буфере A.Очищенные фракции p97 объединяли, концентрировали с использованием ультрафильтрации (отсечение молекулярной массы 30000; Amicon) и мгновенно замораживали в жидком азоте. Очищенный белок p97 исследовали на наличие связанных нуклеотидов с помощью обращенно-фазовой хроматографии (колонка Hypersil ODS-2 C18). Все биохимические эксперименты проводились с полноразмерным p97 (остатки 2–806).

Кристаллизация и определение структуры

Очищенный p97-ND1 (остатки 1–480) предварительно инкубировали с 2 мМ АДФ и 5 мМ MgCl ₂ в течение 1 ч при 4 ° C и смешивали с очищенным ASPL-C (остатки 313 –553) в мольном соотношении 1: 3.Восстановленные белковые комплексы подвергали эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex S200 (GE Healthcare) в буфере A с добавлением 2 мМ АДФ и 5 мМ MgCl ₂ . Очищенный белковый комплекс p97-ND1: ASPL-C был сконцентрирован и дополнен 15 мМ KCl (300 нл при концентрации 12,3 мг / мл ^-1 ) и смешан с равным объемом резервуарного раствора, содержащего 23% PEG 3350, 0,3 M Li ₂ SO ₄ , 0,1 M HEPES / NaOH (pH 7,0). p97: Белковые комплексы ASPL-C _Δ получали, как описано выше для комплекса p97-ND1: ASPL-C.Эксперименты по кристаллизации проводили с использованием метода диффузии паров в сидячем положении при 4 ° C с помощью робота-дозатора Gryphon (Matrix Technologies Corporation) и системы хранения Rock Imager 1000 (Formulatrix). Кристаллы комплекса p97: ASPL-C _Δ (300 нл при концентрации 15,5 мг / мл ^-1 ) были получены путем смешивания равного объема (200 нл) резервуарного раствора (2 M сульфата аммония, 0,1 M Bis. -Tris pH 5,5) с белковым раствором. Кристаллы обоих комплексов появились через 2 недели и были мгновенно заморожены в жидком азоте в криорастворе, содержащем дополнительно 20% глицерина по отношению к резервуарному раствору.Все данные были записаны на BL14.1 в BESSY II (Helmholtz-Zentrum Berlin, HZB) на длине волны 0,9184 Å, обработаны и масштабированы с помощью XDS Suite ⁵⁸ . Фазы для комплекса p97-ND1: ASPL-C были получены путем молекулярной замены на Phaser ⁵⁹ с использованием домена p97-ND1 (код PDB 1S3S) в качестве модели поиска. Для p97: ASPL-C _Δ полностью очищенную комплексную структуру p97-ND1: ASPL-C использовали для молекулярного замещения. Обе структуры белкового комплекса были созданы вручную с использованием COOT ⁶⁰ и итеративно уточнены с использованием Phenix ⁶¹ и Refmac ⁶² .Конечная структура p97-ND1: ASPL-C включает аминокислоты 313–495 для ASPL-C и 21–480 для p97-ND1. Остатки 313–316, 468–470 и 498–553 для ASPL-C и остатки 1–20, 428–432 и 462–472 для p97-ND1 неупорядочены и поэтому не видны в электронной плотности. Комплекс p97: ASPL-C _Δ состоит из остатков 317–499 для ASPL-C _Δ и 13–761 для p97. Неструктурированные области были обнаружены для остатков 313–316 в ASPL-C _Δ и остатков 2–12, 427–433, 495–510, 585–596, 613–615 и 762–766 в p97.В комплексе p97-ND1: ASPL-C 99,8% остатков находились в разрешенных областях карты Рамачандрана. В структуре p97: ASPL-C _Δ 100% всех остатков находились в разрешенных областях карты Рамачандрана. Статистические данные Рамачандрана были проанализированы с помощью Molprobity ⁶³ для обоих комплексов. Рисунки и суперпозиции доменов были созданы с помощью PyMol (http://www.pymol.org). Сервер Dali ⁶⁴ был использован для поиска структурных гомологов ASPL. Анализ интерфейса p97: ASPL был выполнен с помощью PISA ⁶⁵ .Перестройка домена p97 D2 была определена как шарнирное вращение на 141 ° с центром в Leu ⁴⁶⁴ , связанное с перемещением 3 Å вдоль оси вращения посредством DynDom ⁶⁶ . Фильмы S1–4 были созданы с помощью программы Pymol. Моделирование перестройки домена D2 было произведено с использованием сервера морфинга ⁶⁷ .

Коиммунопреципитации

Экстракты головного мозга человека получали из ~ 4 г мозга и кратковременно гомогенизировали в ледяном PBS с добавлением 1% Triton X-100, смеси полного ингибитора протеазы (Roche) и бензоназы (Merck).Гомогенат подвергали центрифугированию при 20 000 g в течение 10 мин при 4 ° C; супернатант собирали и использовали для экспериментов по совместной иммунопреципитации, как описано ранее, с указанными модификациями ⁶⁸ . Магнитные шарики, связанные с белком G (Dynabeads; Invitrogen), инкубировали с антителом против ASPL (Abnova, клон 3D10-1D11, разведение в соотношении 1: 500) в течение 1 ч при 4 ° C. Антитела, связанные с магнитными шариками, сшивали с использованием 5 мМ BS (ссылка 3) (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.Магнитные шарики со сшитыми антителами инкубировали с гомогенатом головного мозга человека при 4 ° C с вращением в течение 1 часа. Связанные белковые комплексы кратковременно промывали PBS, содержащим 1% Triton X-100, с последующим элюированием белковых комплексов буфером для образцов SDS. Белки анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием антител против ASPL (клон Abnova 3D10-1D11, разведение 1: 500) и анти-p97 (PROGEN, клон 58.13.3, разведение 1: 20 000). Co-IP эксперименты в обратном направлении проводили с использованием набора для иммунопреципитации Pierce Crosslink (кат.26147) в соответствии с инструкциями производителя с использованием антитела против p97 (LifeSpan Biosciences, каталожный LS-C287469, разведение 1: 2000).

Рекомбинантные меченные V5 белки ASPL были сверхпродуцированы в человеческих эмбриональных клетках почек 293 (HEK293). Через 48 ч среду аспирировали и клетки кратковременно промывали PBS, лизировали с использованием буфера, содержащего 0,1% NP40, 20 мМ HEPES / NaOH, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ EDTA и свежеприготовленную добавку полного коктейль ингибиторов протеаз (Roche), нуклеаза бензоназ (Merck).Лизис проводили на льду в течение 30 мин. Гомогенат ненадолго центрифугировали на настольной центрифуге в течение 1-2 минут для удаления клеточного дебриса, и осветленный супернатант инкубировали с гранулами V5-агарозы (Abcam, каталожный ab1229) в течение 1 часа при 4 ° C с вращением. Связанные белковые комплексы промывали трижды с использованием буфера, содержащего 0,1% NP40, 20 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂ и 1 мМ EDTA. За этим следовало элюирование белковых комплексов элюирующим буфером, содержащим первичный амин с pH 2.8 из набора для иммунопреципитации Pierce Crosslink (кат. 26147). Белки анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием анти-V5 (Abcam, каталожный ab27671, разведение 1: 1000), анти-p97 (PROGEN, клон 58.13.3, разведение 1: 20 000) и β-актина (Sigma- Aldrich, кат. A5441, 1: 40 000) антител.

DULIP assay

Слитые белки, содержащие метку протеин A (PA) -рениллюцифераза (RL), продуцировались совместно с белками, меченными люциферазой V5-светлячка (FL), в клетках HEK293. Через 48 ч клетки собирали, лизировали в буфере В (0.1% NP40, 50 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl ₂ , 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT), содержащий коктейль полного ингибитора протеазы (Roche) и бензоназу (Merck). Люциферазную активность в белковых экстрактах измеряли для контроля продукции гибридных белков. Белковые комплексы собирали с использованием IgG (Jackson Immunoresearch), иммобилизованного на 96-луночных белых планшетах с высоким уровнем связывания (Greiner). Связанные белковые комплексы промывали на короткое время буфером B, в котором отсутствовал NP40, и связывание слитого белка, меченного V5 светлячка (Co-IP), с меченным PA-Renilla гибридным белком определяли количественно путем измерения активности люциферазы светлячка в считывающем устройстве для люминесцентных планшетов. (TECAN Infinite M200).Активность ренил-люциферазы также измеряли в качестве контроля (IP). Люциферазную активность измеряли с помощью системы анализа люциферазы Dual-Glo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Индивидуальные ИПП тестировались в трех экземплярах; эксперименты повторяли не менее трех раз.

Синий нативный-PAGE

Белки анализировали с помощью BN-PAGE в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Пробы белков разделяли на 4–16% гелях Bis-Tris BN-PAGE при 200 В при комнатной температуре и визуализировали путем окрашивания кумасси бриллиантовым синим.Молярную концентрацию p97 рассчитывали в отношении его мономера для всех экспериментов in vitro (дополнительный рисунок 11). Интенсивность полос белка определяли количественно с использованием программного обеспечения анализатора изображений Aida. Нативные p97-содержащие белковые комплексы из экстрактов клеток HEK293 разделяли с помощью BN-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом с использованием антитела против p97 (PROGEN, клон 58.13.3, разведение 1: 20 000) (дополнительный рисунок 11). Вестерн-блоттинг гелей BN проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Электронная микроскопия с отрицательным окрашиванием

Количество 3,5 мкл очищенных гексамеров p97 (остатки 2–806) или гетеротетрамеров p97: ASPL-C с концентрацией белка 10–20 нг мкл. Производство и очистка рекомбинантных белков) наносили на свежевыгруженные светящимися дырчатыми углеродными сетками (сетки Quantifoil 300 меш R2 / 4, Quantifoil Micro Tools GmbH, Йена, Германия), покрытые дополнительным тонким слоем сплошного углерода и отрицательно окрашенные 2% (мас. / об.) уранилацетат.Образцы оценивали при номинальном увеличении в 28500 раз с использованием электронного микроскопа Philips CM100, работающего при 100 кВ, который был оснащен камерой CCD F114 Fastscan (TVIPS) размером 1 k × 1 k (TVIPS).

Анализ АТФазы

Активность АТФазы 0,5 мкМ p97 в присутствии и в отсутствие ASPL-C определяли при 37 ° C в АТФазном буфере, содержащем 20 мМ HEPES / NaOH (pH 7,4), 40 мМ NaCl, 10 мМ MgCl ₂ . Реакции инициировали добавлением к образцам 250 мкМ АТФ. В разные моменты времени отбирали реакционные аликвоты, разбавляли в 15 раз буфером АТФазы и быстро переносили в жидкий азот.Нуклеотиды в этих образцах разделяли на обращенно-фазовой колонке Hypersil ODS-2 C18 (250 × 4 мм) с 10 мМ тетрабутиламмонийбромидом, 100 мМ фосфатом калия (pH 6,5), 7,5% ацетонитрилом в качестве рабочего буфера. Денатурированные белки адсорбировались на защитной колонке C18. Нуклеотиды детектировали по поглощению при 254 нм и количественно определяли интегрированием соответствующих пиков. Скорости были получены из линейной аппроксимации начальной реакции.

Анализы каспазы 3/7

Клетки HEK293 выращивали при 37 ° C и 5% CO ₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 1 г / л ^-1 D-глюкозы, 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), пенициллин (100 мкг мл ^-1 ) и стрептомицин (100 мкг мл ^-1 ).Равное количество клеток HEK293 высевали на 96-луночный микротитровальный планшет. Через 24 часа клетки трансфицировали гибридными конструкциями pEGFP-C1 (Clontech), кодирующими ASPL или указанными вариантами ASPL, с использованием PEI (полиэтиленимин, Polysciences) в течение 72 часов. Активацию каспаз 3/7 контролировали с помощью набора для анализа гомогенной каспазы-3/7 Apo-ONE (Promega). Субстрат каспазы-3/7, добавленный в каждую лунку, быстро перемешивали встряхиванием и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Сигнал флуоресценции определяли с помощью планшет-ридера (TECAN Infinite M200).Экспрессию конструкций ASPL и p97 контролировали с помощью IB с использованием антител против GFP (Abgent, каталожный AM1009a, разведение 1: 10 000) и антител против p97 (PROGEN, клон 58.13.3, разведение 1: 20 000) соответственно. Экспрессию β-актина также контролировали с помощью IB с использованием антитела против β-актина (Sigma-Aldrich, кат. A5441, 1: 40 000).

ERAD assay

CFP-меченая субъединица Т-клеточного рецептора CD3δ, модельный субстрат ERAD, коэкспрессировалась с EGFP-ASPL в клетках HEK293. Через 24 часа готовили клеточные лизаты и анализировали установившиеся уровни CFP-CD3δ с помощью SDS-PAGE и IB с использованием антитела против CD3δ (Santa Cruz, cat.SC-137137, 1: 500) (Дополнительный рис.11). Экспрессию конструкций ASPL и p97 контролировали с помощью IB с использованием антител против GFP (Abgent, каталожный AM1009a) и анти-p97 (PROGEN, клон 58.13.3, разведение 1: 20 000) соответственно. Экспрессию β-актина также контролировали с помощью IB с использованием антитела против β-актина (Sigma-Aldrich, каталожный A5441, 1: 40 000).

LIVE / DEAD assay

HEK293, HeLa (клетки рака шейки матки), U20S (клетки остеосаркомы человека) и HCT116 (клетки карциномы толстой кишки человека) выращивали при 37 ° C и 5% CO ₂ в среде DMEM с добавлением с 1 г л ^-1 D-глюкозы (HEK293, HeLa, U20S) или 4 г л ^-1 D-глюкозы (HCT116), 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллином (100 мкг мл ^-1 ) и стрептомицин (100 мкг мл ^-1 ).Фиксируемый краситель LIVE / DEAD на дальние эритроциты (Life Technologies) использовали для различения живых и мертвых клеток в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 1 × 10 ⁶ клеток собирали, промывали и обрабатывали либо указанными рекомбинантными белками ASPL-C _Δ в течение 24 часов, либо трансфицировали гибридными конструкциями pEGFP-C1 (Clontech), кодирующими ASPL, или указанными вариантами ASPL с использованием PEI ( полиэтиленимин, Polysciences) в течение 72 часов. Клетки собирали и к каждому образцу добавляли 1 мкл красителя, перемешивали и затем инкубировали в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали и фиксировали в 2% формальдегиде в PBS в течение 15 минут.Фиксированные клетки поддерживали в 300 мкл PBS с 1% FCS при 4 ° C в темноте до начала анализа проточной цитометрии. Все окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре BD FACSCanto (BD Biosciences). Смерть клеток всегда анализировали в 10000 EGFP-положительных клеток на образец с использованием программного обеспечения для анализа проточной цитометрии FlowJo.

Обнаружение и идентификация вновь синтезированных белков

Клетки HeLa выращивали при 37 ° C и 5% CO ₂ в SILAC DMEM. Среды SILAC были по существу приготовлены, как описано ранее ⁴² .Вкратце, мы использовали DMEM Glutamax без аргинина и лизина (специальный препарат от Gibco) с добавлением 10% диализованной фетальной бычьей сыворотки (dFBS, Gibco) для всех экспериментов. Для приготовления «тяжелой» (H) или «средней» (M) среды SILAC мы добавили следующие изотопно меченные аминокислоты: тяжелые, ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-аргинин и ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₂ L-лизин; Средний, ¹³ C ₆ L-аргинин и ² H ₄ L-лизин.Меченые аминокислоты были приобретены в Cambridge Isotope Laboratories. Среду «Light» (L) SILAC готовили путем добавления соответствующих немеченых аминокислот (Sigma).

Временные трансфекции клеток плазмидами проводили с использованием линейного полиэтиленимина (Sigma). Через 24 часа после трансфекции клетки трижды промывали предварительно нагретым PBS; затем их дополнительно культивировали в течение часа в соответствующей среде для культивирования клеток, не содержащей метионина. Через 1 час клетки обрабатывали 1 мМ AHA (L-азиодогомоаланин, Anaspec) и выращивали в течение 4 часов.Клетки обрабатывали трипсином и собирали для последующего анализа. Клетки

лизировали в соответствии с протоколом «Click-iT Enrichment Kit» (Invitrogen) с небольшими модификациями, как описано ранее ⁶⁹ . Вкратце, клетки инкубировали в буфере для лизиса мочевины с добавлением полных ингибиторов протеаз (Roche) и нуклеаз (бензоназа, Merck) на льду. Образцы центрифугировали до 13000 г и супернатанты переносили в свежие пробирки Эппендорфа. Лизаты смешивали в соотношении 1: 1: 1 всегда с контролем EGFP либо «легким», либо «тяжелым», присутствующим в виде пика.Пик был добавлен так, чтобы все образцы можно было сравнить между запусками масс-спектрометрии. Щелкающие реакции между вновь синтезированными белками, несущими азид, и гранулами алкин-агарозы проводили в течение ночи в соответствии с инструкциями набора. Восстановление белков денатурацией при 70 ° C в присутствии 10 мМ DTT сопровождалось алкилированием сульфгидрильных групп 40 мМ йодацетамидом, все выполнялись в соответствии с протоколом набора. Затем алкинские шарики тщательно промывали последовательно в буфере SDS, 8 М мочевины в 100 мМ Трис (pH 8) и, наконец, 80% ацетонитриле встряхиванием в буфере с последующим центрифугированием шариков и декантированием супернатанта.AHA-содержащие белки, ковалентно связанные с алкиновыми гранулами, расщепляли LysC в 50 мМ буфере бикарбоната аммония с 5% ацетонитрилом в течение трех часов, а затем трипсином в течение ночи. Полученные пептиды хранили в StageTips ⁷⁰ .

Пептиды элюировали из StageTips 80% ацетонитрилом и 0,1% муравьиной кислотой с последующим выпариванием органического растворителя. Пептиды ресуспендировали в 5% ацетонитриле и 3% трифторуксусной кислоте и в этом буфере загружали на колонку длиной 15 см с внутренним диаметром 75 мкм, заполненную смолой ReproSil-Pur 120 C18-AQ 3 мкм (Dr Maisch GmbH).Пептиды элюировали из колонки с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ThermoScientific) четырехчасовым градиентом возрастающей концентрации ацетонитрила со скоростью потока 250 нл / мин ^-1 . Элюированные пептиды ионизировали нагретым источником ионизации электрораспылением (ThermoScientific) и анализировали на масс-спектрометре Q Exactive (ThermoScientific). Ионы в полных сканированных изображениях MS анализировались на орбитальной ловушке с разрешением 70 000 после сбора 3 000 000 ионов или после максимального времени сбора 20 мс.Был использован режим, зависящий от данных, и были выбраны 10 самых интенсивных ионов в полном сканировании для фрагментации в ячейке диссоциации, вызванной столкновениями с более высокой энергией. Полученные ионные фрагменты анализировали на орбитальной ловушке с разрешением 17 500 после сбора 1 000 000 ионов или максимального времени сбора 60 мс.

Необработанные файлы были обработаны с использованием программного обеспечения MaxQuant версии 1.5.2.8 (ссылка 71) с настройками по умолчанию, за исключением «сопоставления между прогонами», которое было активировано. Arg10 и Lys8 были установлены как метки, карбамидометил на С-концах был установлен как фиксированная модификация, а ацетилирование по N-концу, дезамидирование аспаргина и глутамина и окисление метионина были установлены как переменные модификации.Поисковая машина Andromeda сопоставила полученные спектры MS / MS с базой данных in silico, расщепленной трипсином / P человека, Uniprot (2014-01). Уровень ложного обнаружения был установлен на уровне 1% как на уровне пептида, так и на уровне белка и оценивался путем параллельного поиска по обратной версии базы данных. Графики и статистика были выполнены с использованием R версии 2.15.1 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия).

Трансдукция белков и конфокальная микроскопия

Трансдукция белков выполнялась, как описано ранее, с указанными модификациями.Вкратце, 4 × 10 ⁵ клеток HeLa высевали на чашки со стеклянным дном (Mattek), а на следующий день клетки промывали трижды DMEM (Gibco). Замороженные рекомбинантные белки размораживали и ненадолго центрифугировали при 20000 g на настольной центрифуге при 4 ° C. Клетки обрабатывали рекомбинантными белками (25, 75 и 100 нМ) в 800 мкл DMEM; через 4–5 ч к клеткам добавляли DMEM с 20% FCS, содержащую пенициллин (100 мкг мл ^-1 ) и стрептомицин (100 мкг мл ^-1 ), и их инкубировали в течение ночи.Затем количество живых и мертвых клеток определяли в популяциях EGFP-положительных клеток. Поглощение рекомбинантных белков клетками контролировали с помощью конфокальной визуализирующей микроскопии. Клетки обрабатывали 100 нМ рекомбинантных белков в течение 4 ч, клетки промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом. Клетки получали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Olympus Fluoview 1000 с линзой из силиконового масла × 60 / 1,3 NA. Изображения были получены с размером шага z 0,2 мкм, отверстием 0,9 а.е. и усреднением линий 48.Изображения были проанализированы с использованием программного обеспечения Fiji.

Статическое рассеяние света

Сопряженный детектор показателя преломления RALS (Right-Angle Light Scattering) (Malvern) был подключен на линии к аналитической гель-фильтрационной колонке Superdex S200 10/300 для определения абсолютных молекулярных масс элюированных белков. Данные были проанализированы с помощью прилагаемого программного обеспечения. Рабочий буфер содержал 20 мМ HEPES (pH 7,5), 200 мМ NaCl, 2 мМ MgCl ₂ и 2 мМ DTT. На каждый образец белка наносили 100 мкл 3 мг / мл раствора ^-1 .

Изотермическая калориметрия титрования (ITC)

Эксперименты ITC проводили с использованием титровального микрокалориметра VP-ITC (GE Healthcare, Фрайбург, Германия). Все титрования проводили в буфере, содержащем 20 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 200 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 2 мМ ADP при 25 ° C. 80 мкМ ASPL-C титровали в 8 мкМ p97-ND1. Исходные данные в виде приращения тепла на моль добавленного лиганда для титрования были подогнаны нелинейным методом наименьших квадратов с помощью программного обеспечения ORIGIN7 с использованием модели связывания с одним сайтом.

Биослойная интерферометрия (BLI)

Кинетику связывания p97 с ASPL-His измеряли с помощью BLI с использованием одноканального прибора BLItz (Pall, fortéBio). 1 мкМ ASPL-His (20 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 200 мМ NaCl, 1 мг мл ^-1 BSA) улавливали биосенсорами HIS2 (Pall, fortéBio) в течение 400 с, а затем биосенсоры промывали в течение 600 с. в буфере (20 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 200 мМ NaCl). Затем была измерена кинетика, начиная с 60-секундной базовой линии, 200-секундной фазы ассоциации с различными концентрациями p97 (20 мМ HEPES / NaOH, pH 7.4, 200 мМ NaCl, от 100 до 12,5 нМ) и фаза диссоциации 200 с в буфере. Были проведены отрицательные контрольные эксперименты с биосенсором HIS2 без ASPL-His против максимально используемой концентрации p97 (100 нМ). Напротив, биосенсор HIS2, загруженный ASPL-His против буферного контроля (20 мМ HEPES / NaOH pH 7,4, 200 мМ NaCl), также был использован. Все измерения проводились при комнатной температуре. Данные были проанализированы с использованием языка программирования R с использованием модели связывания 1: 1.

Доступность данных

Координаты атомов p97-ND1: ASPL-C и p97: ASPL-C _Δ были депонированы в банке данных белков с кодами доступа 5IFS и 5IFW, соответственно.Все остальные данные, относящиеся к этой работе, доступны у авторов по обоснованному запросу.

1. Введение

1. Введение

Синтез новых гибридных материалов на основе сульфата, фосфата и арсената, который может обладать оригинальными физическими свойствами, является одним из нескольких исследований в химических лабораториях мира из-за его важности в обоих биологических процессах; в различных промышленных и технологических применениях [1] [2]. В силах когезии в этих гибридных соединениях преобладают электростатические взаимодействия, контакты Вандера-Ваальса и водородные связи (O-H… O и N-H… O).Эти водородные связи играют важную роль в механизме ассоциации молекул, которые либо являются биологическими, либо нет. Сильные характеристики и ориентация этих звеньев чрезвычайно важны для получения новых материалов, таких как протонные проводники и удвоители частоты. Таким образом, органические сульфаты, возникающие в результате взаимодействия серной кислоты с органическими молекулами, в которых по крайней мере один из атомов несет неподеленную пару, обязаны своей стабильностью водородным связям [3] — [5]. В этой работе сообщается о химическом получении, кристаллической структуре и физико-химическом исследовании нового органического сульфата (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ .

3. Результаты и обсуждение 3.1. Описание структуры

Атомное расположение структуры трис (2-амонийбензамид) сульфата (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ было

Таблица 1 Кристалл уточнение данных и структуры Цвет / форма Цвет / форма / призматический Размеры ячейки γ = 9029 измерительный прибор 9029 Компьютерные программы SHELX-97 [7]

Состав	(C 7 H 9 N 2 O) 3 HSO 4 SO 4
Формульный вес	314.29 г / моль
Кристаллическая система	моноклинная
Пространственная группа	P2 1 / c
Температура, К	293 (2)
a = 10,3028 (2) Å	α = 90,00
b = 12,4995 (2)	β = 102,355 (2)
c = 20,6730 (2) Å
Объем ячейки, Å 3	2600.61 (7)
Z	8
Плотность (расчетная), г / см 3	1,61
Коэффициент поглощения, мм −1	0,45	Каппа CCD Nonius
Излучение, графитовый монохром.	MoKα (λ = 0,71073 Å)
Макс. размеры кристалла, мм	0,36 × 0,29 × 0,21
режим сканирования	Φ (ПЗС диф.)
Диапазон θ	2 — 25˚
Диапазон h, k, l	−12 ≤ h ≤ 11, 0 ≤ k ≤ 14, 0 ≤ l ≤ 24
Количество сканированные отражения	4571
Кол-во независимых исх.	4441
Число наблюдаемых отражений	4441
Критерий наблюдаемых отражений	I> 2σ (I)
Программы редукции данных	Denzo [6]
Уточненные параметры	473
Качество посадки на F 2	0.952
R	0,046
Rw	0,114

описывается трехмерной сетью структурных единиц, образованных кластером (HS ₂ O _{826) ^{3 сульфат и три органических катиона (C 7 H 9 N 2 O) + . На рис. 1 представлена ​​стереоскопическая проекция кристаллической упаковки ОРТЭП [9]. Минеральный скелет этого соединения образован основными и кислотными группами, которые связаны между собой водородной связью типа O (2) -H ∙∙∙ O (7) и организованы в изолированные кластеры (HS 2 O 8 ) 3− в плоскости (а, в) (рисунок 2).Короткое расстояние O (2) ∙∙∙ O (7) = 2,485 (3) Å, показывает, что эта водородная связь считалась прочной. Расстояние S (1) ∙∙∙ S (2) порядка 4,525 (1) Å. Расстояния и валентные углы, описывающие анионы () и (), показаны в таблице 2. Расстояния S-O варьируются в диапазоне [1,438 (3) — 1,506 (4) Å]. Обзор этих расстояний показывает, что последнее расстояние SO (2) [1,506 (4) Å] является самым длинным, это связано с расположением протона на}}

Рисунок 1 ORTEP стереоскопическая проекция расположения атомов (для ясности, Н-связи представлены пунктирными линиями).Тепловые эллипсоиды даны с вероятностью 50%. Рисунок 2 Кластеры (HS ₂ O ₈ ) ^{3 —} , если смотреть вниз по кристаллографической оси b

кислорода O (2) аниона, эта характеристика находится в линии, наблюдаемой в протонированных оксоанионах [10] — [12], средние значения расстояний SO и углов OSO составляют: 1,466 (3) Å, 109,46 (19), 1,473 (3) Å, 109,38 (20) соответственно для тетраэдры S (1) O4 и S (2) O4. Эти значения также хорошо согласуются с наблюдаемыми для аналогичных анионных групп [13] [14].Атомы кислорода O (1) и O (3) тетраэдра протонированы дважды, HSO ₄ имеет самые длинные расстояния [1,456 (3), 1,466 (3) Å], а O (4) участвует в единственном водородная связь на расстояние SO меньше [1,438 (3) Å]. Взаимодействие серной кислоты с органической молекулой (C ₇ H ₈ N ₂ O) приводит к протонированию азота, привитого к бензольному кольцу, и образованию трех катионов (C ₇ H ₉ N ₂ O) ⁺ кристаллографически независимая.Обозначается соответственно: A {C (1) C (7)}, B {C (8) C (14)} и т.д. C {C (15) C (21). На рисунке 3 показана проекция вдоль оси а атомного расположения в (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ . Основные геометрические характеристики этих катионов приведены в таблице 3; эти органические виды не имеют локальной симметрии в структуре. Обратите внимание, что два катиона A и C связаны двумя водородными связями N (1) -H (1N1) ∙∙∙ O (10)

Таблица 2 Основные межатомные расстояния (Å) и валентные углы (°) в SO ₄ и HSO ₄ тетраэдров (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ )

S (1)	O (2)	O (3)	O (4)
O (1)	1.456 (3)	107,1 (2)	110,3 (20)	109,3 (2)
O (2)	2,381 (1)	1,506 (4)	108,96 (18)	108,7 (2)
O (3)	2,397 (1)	2,419 (1)	1,466 (3)	112,38 (17)
O (4)	2,362 (1)	2,391 (2)	2,413 (0)	1,438 (3)
S (2)	O (5)	O (6)	O (7)	O (8)
О (5)	1.466 (3)	109,4 (2)	105,25 (19)	112,2 (2)
O (6)	2,404 (1)	1,479 (3)	107,33 (19)	113,7 (2)
O (7)	2,354 (1)	2,397 (2)	1,497 (3)	108,4 (2)
O (8)	2,421 (0)	2.455 (0)	2.392 (1)	1.452 (3)

Рисунок 3 Проекция вдоль оси А атомного расположения в (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ Таблица 3 Основные межатомные расстояния (Å) и валентные углы (°) в органических группах (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄

Катион A
N (2) ―C (7)	1.333 (6)	C (6) ―C (1) ―C (2)	118,2 (4)
C (1) ―C (6)	1,387 (6)	C (6 ) C (1) C (7)	121,1 (3)
C (1) C (7)	1,521 (6)	C (2) ―C (1) ―C ( 7)	120,6 (3)
C (2) ―N (3)	1,458 (6)	C (1) ―C (2) N (3)	121,2 (3)
C (2) ―C (1)	1,411 (6)	C (3) ―C (2) ―N (3)	118,6 (4)
C (2) ―C (3)	1.380 (6)	C (3) ―C (2) ―C (1)	120,2 (4)
C (3) C (4)	1,382 (7)	C (2 ) C (3) ―C (4)	120,5 (4)
C (4) ―C (5)	1,376 (7)	C (5) ―C (4) ―C ( 3)	120,0 (4)
C (6) ―C (5)	1,389 (7)	C (4) ―C (5) C (6)	119,9 (4)
C (7) ―O (11)	1,225 (5)	C (1) ―C (6) C (5)	121,1 (4)
		O (11) ―C (7) ―N (4)	120.9 (4)
		O (11) ―C (7) ―C (1)	121,5 (3)
		N (4) ―C (7) ―C (1)	117,5 (4)
		C (6) ―C (1) ―C (2)	118,2 (4)
Катион B
N (3) ―C (8 )	1,446 (6)	C (9) ―C (8) ―C (13)	120,7 (4)
N (4) C (14)	1,331 (6)	C (9) ―C (8) ―N (1)	117,5 (4)
C (8) ―C (9)	1.383 (6)	C (13) ―C (8) ―N (1)	121,8 (4)
C (8) ―C (13)	1,398 (6)	C (10 ) C (9) ―C (8)	121,1 (4)
C (10) ―C (9)	1,374 (7)	C (9) ―C (10) ―C ( 11)	119,2 (4)
C (10) ―C (11)	1,383 (7)	C (10) ―C (11) C (12)	119,7 (4 )
C (12) C (11)	1,387 (6)	C (11) C (12) ―C (13)	121.9 (4)
C (13) ―C (12)	1,389 (6)	C (12) ―C (13) C (8)	117,3 (3)
C (14) ―C (13)	1,504 (6)	C (12) ―C (13) ―C (14)	121,9 (3)
C (14) ―O (9)	1,241 (5)	C (8) ―C (13) ―C (14)	120,7 (3)
		O (9) C (14) ―N2	120,1 (4)
		O (9) ―C (14) ―C (13)	121,5 (3)
		N (2) C (14) ―C (13)	118.4 (3)
		C (9) ―C (8) ―C (13)	120,7 (4)
Катион C
N (5) ―C (15)	1,460 (6)	C (16) ―C (15) ―N (5)	117,8 (4)
N (6) C (21)	1,327 (6)	C ( 20) C (15) ―N (5)	121,6 (3)
C (15) C (16)	1,389 (7)	C (16) ―C (15) ―C (20)	120,6 (4)
C (16) C (17)	1.375 (8)	C (17) ―C (16) ―C (15)	120,5 (4)
C (18) C (17)	1,382 (8)	C (16 ) ―C (17) ―C18	119,3 (4)
C (19) ―C (18)	1,369 (7)	C (19) ―C (18) ―C (17)	120,8 (4)
C (19) ―C (20)	1,400 (6)	C (18) ―C (19) ―C (20)	121,2 (4)
C (20) ―C (21)	1,505 (6)	C (15) — C (20) ―C (19)	117.5 (3)
C (21) ―O (10)	1,244 (5)	C (15) ―C (20) ―C (21)	120,8 (3)
		C (19) ―C (20) ―C (21)	121,6 (3)
		O (10) C (21) ―N (6)	120,4 (4)
		O (10) C (21) ―C (20)	121,0 (3)
		N (6) C (21) C (20)	118,7 (3)

и N (5) -H (2N5) ∙∙∙ O (11), чтобы сформировать диммер первого типа, расположенный в плоскостях z = (2n + 1) / 4.Диммер второго типа, образованный двумя катионами B, которые связаны посредством водородной связи N (3) -H (2N3) ・ ・ ・ O (9), расположен вокруг центра инверсии (0, 0, 0) (Рисунок 4, Рисунок 5).

Работа, демонстрирующая важную роль водородных связей, стабильности структуры, выявляет два типа связей: OH ∙∙∙ O и NH ∙∙∙ O, структура, изучаемая в данной работе, содержит одинарную водородную связь первого типа. а второй тип семнадцать. Единственное звено O (2) -H (O2) ∙∙∙ O (7) считается высоким [O (2) -H (O2) ∙∙∙ O (7) = 2.485 (3) Å] [14], объединяет два анионных компонента в виде кластера (HS ₂ O ₈ ) ^3–. отмечено, что среди семнадцати водородных связей NH ∙∙∙ O шесть сильных, для которых расстояние N ∙∙∙ O находится в диапазоне от 2,621 (1) Å до 2,756 (1) Å [14] и одиннадцать умеренно низких [N ∙∙∙ O> 2,76Å] [15]. Второй тип водородных связей, соединяющих различные кластеры, создает трехмерную сетчатую структуру.

Характеристики различных водородных связей приведены в таблице 4.В результате два типа водородных связей, O-H ∙∙∙ O и N-H-O, вносят вклад в сплоченность в сети настоящей кристаллической структуры.

3.2. Thermal Behavior

Термическое исследование проводилось с использованием термоанализатора типа Setaram TG-ATD92. Термограмма (TG-DTA) на рисунке 6 зарегистрирована в атмосфере воздуха с использованием образца массой 19,8 мг, помещенного в платиновый тигель и нагретого от температуры окружающей среды до 400 ° C.

Кривая ТГ показывает отсутствие потери массы в данной области, комнатная температура 200˚C.Однако он показывает значительную потерю от 200 ° C и выше. Кривая ДТА показывает два эндотермических пика, менее интенсивных при 98˚C и 110˚C, что приписывается двум вероятным стадиям перехода, поскольку при этой температуре не было замечено никакой потери массы. Обратите внимание, что наблюдаемые тепловые явления при дифференциальном термическом анализе многочисленны и разнообразны. Большинство этих пиков являются эндотермическими, такими как плавление, испарение, сублимация, дегидратация. Остальные пики являются экзотермическими, такими как адсорбция, кристаллизация и разложение; однако два последних явления также могут быть эндотермическими.Кривая ДТА показывает последовательность экзотермических и эндотермических пиков между 200 ° C и 400 ° C, что может быть объяснено разложением молекулы. Эндотермический пик, наблюдаемый при 199 ° C, объясняется плавлением безводного соединения.

Рисунок 4 Диммер AC Рисунок 5 Диммер BB Таблица 4 Длины связей (Å) и углы (˚) в схеме водородной связи ^a N ∙— h ∙∙ O3 .91 (5)

	N (O) -H (Å )	H ・ ・ ・ O (Å)	N (O) ・ ・ ・ O (Å)	N (O) -H ・ ・ ・ O (˚)
N1-h2N ∙∙∙ O10 (i)	0.97 (5)	2,2298 (4)	2,7814 (4)	115,41 (3)
N1-h2N1 ∙∙∙ O11	0,97 (5)	1,8046 (5)	2,65 )	145,81 (4)
N1-h3N1 ∙∙∙ O6	0,81 (5)	1,7589 (6)	2,7956 (5)	173,54 (5)
0,80 (5)	2,0505 (5)	2,8452 (5)	177,63 (4)
N2-h3N2 ∙∙∙ O8 (vii)	0.87 (7)	2,1151 (6)	2,9045 (5)	149,32 (5)
N3-h2N3 ∙∙∙ O5 (iii)	1,00 (6)	1,7850 (5)	2,7562 (5)	163,01 (5)
N3-h3N3 ∙∙∙ O9	0,73 (5)	2,0095 (4)	2,6275 (5)
142,71
N3-h3N3 ∙∙ O9 (в)	0,73 (5)	2,4115 (4)	2,9392 (5)	130.62 (4)
N3-h4N3 ∙∙∙ O1	1,00 (8)	1,7438 (8)	2,7449 (5)	166,81 (6)
N4-h2N4 (iv)	0,81 (5)	2,1193 (4)	2,8967 (5)	161,11 (4)
N4-h3N4 ∙∙∙ O3 (v)	0,81 (6 )	2,2504 (5)	3,0311 (5)	162,22 (4)
N5-h2N5 ∙∙∙ O1	0,89 (6)	1.9790 (5)	2,8361 (5)	161,91 (4)
N5-h3N5 ∙∙∙ O10	0,89 (6)	1,9040 (5)	2,6208 (4)	)
N5-h3N5 ∙∙∙ O11 (ii)	0,90 (5)	2,1974 (5)	2,8039 (4)	124,25 (4)
N5-h4 ∙ O6 (iii)	0,90 (5)	1,5978 (9)	2,7287 (4)	156,46 (7)
N6-h2N6 ∙∙∙ O7 (ii) 0	2,0838 (4)	2,9929 (5)	169,47 (4)
N6-h3N6 ∙∙∙ O5 (vi)	0,91 (5)	2,2571 (4)	3,0961 (5)	153,70 (3)
O2-HO2 ∙∙∙ O7	0,840 (4)	1,838 (2)	2,485 (3)	132,60

^a Операторы симметрии: i) −x, y — 1/2, −z + 1/2; ii) −x, y + 1/2, −z + 1/2; iii) x — 1, y, z; iv) x, −y + 3/2, z + 1/2; v) −x, −y + 1, −z + 1; vi) x — 1, −y + 3/2, z — 1/2; vii) −x + 1, y — 1/2, −z + 1/2.

Рисунок 6 TG-DTA термограммы (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ Рисунок 7 ИК-спектр (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ 3.3. ИК-абсорбционная спектроскопия

Литературное исследование, проведенное на нескольких сульфатах [16] [17], показывает, что удельные частоты колебаний свободного иона SO ₄ с идеальной симметрией Td равны ν ₁ = 981 см ⁻¹ , ν ₂ = 451 см ⁻¹ , ν ₃ = 1104 см ⁻¹ и ν ₄ = 614 см ⁻¹ [18].Часто встречающиеся в структурах, тетраэдры SO ₄ часто имеют искаженные узлы с низкой симметрией. Снятие вырождения и активности неактивных мод в идеальной симметрии увеличивает количество полос в инфракрасном спектре. ИК-спектр соединения (C ₇ H ₉ N ₂ O) ₃ HSO ₄ SO ₄ представлен на рисунке 7.

Попытка присвоить частоты различным валентным колебаниям и деформациям. органического катиона выполняется на основе предыдущей работы [19] [20].Полосы, наблюдаемые в области 2562-3375 см ⁻¹ , относятся к симметричным и асимметричным колебаниям валентности ν (NH ₃ ), ν (NH ₂ ), ν (CH) и ν (OH). Полосы между 1538 — 1681 см ^-1 относятся к деформационным колебаниям связей (NH ₃ ) и (NH ₂ ), а также колебаниям валентностей ν (C = C) и ν (CN). Вибрационная симметричная и асимметричная деформации δ _s (CH) и δ _as (CH) происходят в области от 1276 до 1499 см ⁻¹ .Деформационные колебания типа качания: ρ (NH ₃ ), ρ (NH ₂ ) и ρ (CH) возникают в области 721 — 965 см ⁻¹ . Скручивания τ (NH ₃ ) и τ (NH ₂ ) проявляются в полосах 514–560 см ⁻¹ . Наконец, полосы 1926 — 2369 см ^-1 доменов назначаются обертонам и комбинационным полосам. Полосы частот в области 410–484 см ⁻¹ относятся к симметричному деформационному колебанию δ _с (SO ₄ ).Асимметричная деформационная симметрия δ _as (SO ₄ ) наблюдалась в области 602 — 671 см, ⁻¹ . В то время как связанная с симметрией валентности группа SO ₄ представлена ​​полосой 992 см ^-1 . Полосы, наблюдаемые в области 992 — 1186 см ⁻¹ , на асимметричном валентном колебании ν _с (SO ₄ ) δ _{как область} (SO ₄ ).

3,4. Дополнительный материал

Кристаллографические данные для структурного анализа депонированы в Кембриджском банке структурных данных, CCDC № 1000722.Копии этой информации можно бесплатно получить у директора, CCDC, 12 Union Road, Cambridge, CB2 IEZ, UK (факс: + 44-1226-336033; электронная почта: [email protected]).

% PDF-1.4 % 51 0 obj> эндобдж 52 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 53 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 54 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 55 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 56 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 57 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 58 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 59 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 60 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 61 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 62 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 63 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 64 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 65 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 66 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 67 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 68 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 69 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 70 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 71 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 72 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 73 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 74 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 75 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 76 0 obj> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> эндобдж 77 0 obj> эндобдж 78 0 obj> эндобдж 80 0 obj> эндобдж 81 0 объект> эндобдж 82 0 объект> эндобдж 83 0 obj> эндобдж 84 0 obj> эндобдж 85 0 obj> поток

.

No related posts.