Последовательность этапов развития заболевания вирусным гриппом: Грипп — симптомы, лечение, протекание

Разное

Содержание

Грипп — симптомы, лечение, протекание

Новости по теме

Дополнительные материалы

Общие сведения

Грипп является острой респираторной вирусной инфекцией, которая поражает в основном нос, горло, бронхи и иногда легкие. Грипп легко передается от человека к человеку. Периодически распространяется в виде эпидемий и пандемий. Возбудители данного заболевания — вирусы гриппа трех типов: A, B, C. Данные вирусы обладают способностью быстро изменяться, так как постоянно циркулируют среди людей и обмениваются генетическим материалом. Среди многих подтипов вирусов гриппа А в настоящее время в основном циркулируют подтипы A(h2N1) и A(h4N2). Эпидемии гриппа, вызванные серотипом А, возникают примерно каждые 2—3 года, а вызванные серотипом В — каждые 4-6 лет. Случаи заболевания гриппом есть во всех частях мира. Случаи заболевания гриппом типа C происходят гораздо реже по сравнению с типами A и B. По этой причине вакцины от сезонного гриппа содержат только вирусы типа А и В.

Вероятность заболеть

Грипп распространен во всем мире, и им может заболеть любой человек из любой возрастной группы. Грипп распространен в глобальных масштабах, а ежегодные коэффициенты пораженности оцениваются на уровне 5%-10% среди взрослого населения и 20%-30% среди детей. Вирус гриппа может приводить к госпитализации и смерти, главным образом среди групп высокого риска (детей самого раннего возраста, беременных женщин, пожилых или хронически больных людей). По оценкам ВОЗ, от всех вариантов вируса гриппа во время сезонных эпидемий в мире ежегодно умирают от 250 до 500 тыс. человек (большинство из них старше 65 лет), в некоторые годы число смертей может достигать миллиона.

Симптомы

Сезонный грипп передается легко и может быстро распространяться в школах, домах престарелых и инвалидов, на предприятиях и в городах. Когда инфицированный человек кашляет, зараженные вирусом капельки попадают в воздух. Их может вдохнуть другой человек и подвергнуться воздействию вируса. Грипп может также передаваться через руки, инфицированные вирусом. Период между инфицированием и заболеванием, известный как инкубационный период, длится около двух дней. Для сезонного гриппа характерны симптомы в виде внезапного появления высокой температуры (38 C – 40 C), кашля (обычно сухого, напряжённого, сопровождающегося болью за грудиной), головной и мышечной болью, болью в суставах, сильного недомогания (плохого самочувствия), болью в горле. Насморка, как правило, нет. Большинство людей выздоравливает в течение недели без какой-либо медицинской помощи. Но грипп может приводить к развитию осложнений или смерти у людей из групп повышенного риска.

(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Грипп: симптомы и профилактика

Инфографика от Роскомнадзор и АиФ. Подробнее

Осложнения после перенесенного заболевания

Ежегодные эпидемии гриппа могут оказывать серьезное воздействие на все возрастные группы. Самый высокий риск развития осложнений от гриппа– у детей в возрасте до двух лет, взрослых в возрасте 65 лет и старше и людей любого возраста с определенными заболеваниями (хронические болезни сердца, легких, почек, крови и болезни обмена веществ (например, диабет) или с ослабленной иммунной системой, а также у женщин во время беременности.Болезнь может приводить к госпитализации и смерти, главным образом, среди этих групп высокого риска. Вирус гриппа подавляет иммунные реакции организма, поэтому значительно снижается способность человека противостоять болезням.

Различают несколько основных видов осложнений при гриппе:

Лёгочные: бактериальная пневмония, геморрагическая пневмония, формирование абсцесса лёгкого, образование эмпиемы плевры (воспаление плевральных листков, сопровождающееся образованием гнойного экссудата в плевральной полости), острый респираторный дистресс-синдром.

Внелёгочные: бактериальные риниты, синуситы, отиты, трахеобронхиты, вирусный энцефалит, менингит, неврит, радикулоневрит, поражение печени (синдром Рея), токсико-аллергический шок.

Смертность

От осложнений, вызванных гриппом, умирают по данным ВОЗ от 250 до 500 тыс. человек ежегодно. При этом основная смертность приходится на людей пожилого возраста (у большинства из которых имеются те или иные хронические заболевания), а также на лиц любого возраста, имеющих хронические заболевания.

Грипп при беременности

  • Грипп невероятно опасен для беременных женщин и новорожденных детей!
  • Пандемия, вызванная вирусом A/h3N2/1957 – летальность среди женщин, находящихся на разных сроках беременности составила более 50%;
  • Пандемия, вызванная вирусом A/h2N1/2009 – по разным данным, летальность среди беременных составила в Великобритании – 6,%, в США и Австралии – до 16%, в России (на примере Ульяновской области) – 42,8%;
  • Перинатальная смертность среди младенцев, родившихся от заболевших гриппом беременных женщин – 39:1000 по сравнению с тем же показателем у детей от неинфицированных гриппом матерей – 7:1000.

Лечение

До последнего времени лечение гриппа было обычно симптоматическое, в виде жаропонижающих, отхаркивающих и противокашлевых средств, а также витаминов. Теперь с помощью современных противовирусных препаратов от гриппа, доступных в некоторых странах, можно эффективно предотвращать и лечить болезнь. Их необходимо принимать, по возможности, на ранних стадиях болезни (в течение 48 часов после проявления симптомов). Однако у некоторых вирусов гриппа развивается устойчивость к противовирусным препаратам, ограничивающая эффективность лечения.

Неосложнённый грипп не лечат антибиотиками, поскольку антибиотики показаны только для терапии бактериальных инфекций (к которым грипп не относится).

Также следует отметить, что большинство лекарственных препаратов для лечения гриппа первоначально люди принимают самостоятельно, а не по назначению врача. Самолечение в случае с гриппом неприемлемо и приводит к потере драгоценного времени!

Эффективность вакцинации

Эффективным путем профилактики болезни или ее тяжелых последствий является вакцинация. Вот уже более 60 лет имеются и используются безопасные и эффективные вакцины. У здоровых людей противогриппозная вакцина может обеспечить умеренную защиту. Однако среди пожилых людей противогриппозная вакцина может быть менее эффективной в предотвращении заболевания, но может ослабить тяжесть протекания гриппа и уменьшить число случаев развития осложнений и смерти.

К примеру, эффективность прививок против сезонного гриппа A (h2N1) многими отрицается, однако в Екатеринбурге (с 2004 г. прививают против гриппа более 30%, а в 2009 г. — 40,1% населения) среди заболевших гриппом А (h2N1) непривитые составили 91,8%, а среди умерших — 100%.

Эффективность иммунизации современными противогриппозными вакцинами составляет 70-90% и зависит как от конкретной вакцины, условии ее хранения и транспортировки, так и от эпидемиологической обстановки в конкретное время, от особенностей организма малыша и прочих факторов.

Вакцинация гриппа во время беременности снижает вероятность заболевания и тяжесть протекания инфекции у детей в возрасте до 6 месяцев жизни, для которых нет вакцин против гриппа и специфической противовирусной терапии, так как: снижается риск инфицирования матери после родов, а соответственно, и ребенка в первые месяцы жизни; формируется пассивный иммунитет у ребенка за счет передачи антител против гриппа от матери плоду.

Вакцины

На протяжении многих лет ВОЗ дважды в год обновляет свои рекомендации в отношении состава вакцины, нацеленной на 3 (трехвалентная) самых характерных из циркулирующих типов вируса (два подтипа A и один подтип B вирусов гриппа). Начиная с сезона гриппа 2013-2014 годов в северном полушарии рекомендуется состав четырехвалентной вакцины, в которую добавлен второй вирус гриппа B в дополнение к вирусам, входящим в состав обычных трехвалентных вакцин. Ожидается, что четырехвалентные вакцины обеспечат более широкую защиту от инфекций, вызываемых вирусами гриппа подтипа В.

Подробнее о вакцинах

Последние эпидемии

Вирусы гриппа А могут также вызывать глобальные пандемии, характеризующиеся быстрым распространением новых подтипов вируса А (или штаммов подтипов), которые обладают способностью передачи от человека к человеку и достаточно отличаются по антигенной структуре от недавно циркулирующих вирусов гриппа. Зарегистрированные с середины 18-го столетия большие пандемии наблюдались с интервалом в 10-40 лет. Из них пандемия «испанского гриппа» 1918 года была наиболее тяжелой и, по расчетам, унесла в мире 20-40 миллионов или более человеческих жизней. Менее тяжелые пандемии наблюдались в 1957 году («азиатский грипп») и в 1968 году («гонконгский грипп»). В 2009 году глобальные вспышки, вызванные штаммом А(h2N1) («свиной грипп»), обозначенные как А(h2N1)pdm09, достигли пандемического уровня, хотя постепенно эволюционировали в картину сезонного гриппа в 2010 году.

Исторические сведения и интересные факты

Самой тяжелой считается пандемия гриппа 1918 года, которую в народе прозвали «испанкой». В конечном итоге, от нее пострадало 40% населения земного шара. Предупреждение и раннее лечение простудных заболеваний высокими дозами

витамина С (аскорбиновой кислоты) пропагандировалось Лайнусом Полингом, из-за его авторитета этот способ получил широкое распространение. Недавнее подробное исследование показало, что приём 1—4 г аскорбиновой кислоты в сутки не приводит к уменьшению количества простудных заболеваний, хотя и несколько облегчает их протекание.

Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

9-10 декабря 2021 г. в Конференц-зале Президентской библиотеки им. Б.Н. Ельцина (г. Санкт-Петербург, Сенатская площадь, д. 3) состоится II Международная научно-практическая конференция по вопросам противодействия новой коронавирусной инфекции и другим инфекционным заболеваниям.

Организаторы конференции: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФБУН Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора; ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

В конференции примут участие ведущие российские и зарубежные учёные, представители стран СНГ, ШОС, Европейского союза, международных организаций, в том числе Всемирной организации здравоохранения.

В ходе Конференции планируется обсуждение следующих научных вопросов:

  • Эпидемиология новой коронавирусной инфекции. Прогнозы и модели. Противоэпидемические мероприятия. Реагирование. Лечение.
  • Опыт международного сотрудничества по борьбе с COVID-19
  • Молекулярно-генетические характеристики SARS-CoV-2: особенности, изменчивость, распространение.
  • Новая угроза — толчок к развитию диагностических технологий. Новые подходы к диагностике, разработка тест-систем. Национальные стратегии лабораторного тестирования.
  • Особенности формирования иммунного ответа при COVID-19.
  • Результаты серологического мониторинга.
  • Специфическая профилактика. Разработка и испытания вакцин, в том числе в контексте эволюции вируса
  • О реализации распоряжений Правительства Российской Федерации (программ помощи зарубежным партнерам) в сфере содействия
    международному развитию по вопросам борьбы с инфекциями, включая приграничное сотрудничество. 

Формат участия в работе Конференции: очно и заочно.

Для очного участия в Конференции необходимо иметь код доступа, который будет направляться в официальных приглашениях, а также действительный QR-код о вакцинации, QR-код переболевшего или справку о медицинском отводе (необходимо приложить при регистрации).

Для аккредитации и доступа в здание Президентской библиотеки всем представителям СМИ необходимо пройти регистрацию, указав паспортные и контактные данные, информацию об оборудовании.

Перед началом работы Конференции 8 декабря 2021 г. Санкт-Петербургским НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера будет организовано обязательное ПЦР-тестирование для участников и представителей СМИ. ПЦР-тестирование будет проводиться в здании гостиницы «Англетер» (ул. Малая Морская, д. 24).

Время тестирования: для представителей СМИ – с 12:00 до 16:00; для участников – с 12:00 до 24:00.

Внимание! ПЦР-тесты других организаций не принимаются!

Регистрация на очное участие закроется 2 декабря 2021 года в 11:00.

Сайт конференции: https://pasteur.rbtour.ru/

Ссылка на регистрацию: https://pasteur.rbtour.ru/registraciya.html

 

Воздействие на клеточные мишени как средство борьбы с гриппозной инфекцией Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Инфекция и иммунитет 2014, Т. 4, № 1, с. 15-26

ВОЗДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТОЧНЫЕ МИШЕНИ КАК СРЕДСТВО БОРЬБЫ С ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

В.В. Зарубаев1, В.С. Смирнов2

1ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия 2 ЗАО МБНПК«Цитомед», Санкт-Петербург, Россия

Резюме. Грипп представляет собой высоко контагиозное заболевание человека. На фоне использования противовирусных препаратов формируются лекарственно-устойчивые штаммы вируса, следствием чего является снижение эффективности этиотропной химиотерапии. В обзоре рассмотрены способы снижения уровня репликации вируса и тяжести патологического процесса, основанные на использовании альтернативных мишеней не вирусного, а клеточного происхождения. Описаны препараты, снижающие продукцию провос-палительных цитокинов (эриторан), ограничивающие дегрануляцию тучных клеток (кетотифен), ингибиторы циклооксигеназ (целекоксиб, месалазин, SC-560), ингибиторы сфингозин-1-фосфатного пути (AAL-R), а также повышающие стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальными клетками (белок Slit). Особое внимание уделено ингибиторам клеточных путей, используемых вирусом для повышения репродукции, таких как NF-kB, Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR. Описана противогриппозная активность ингибиторов киназ и процесса аутофагии, а также препаратов смешанного механизма действия — глицирри-зиновой кислоты и дипептида а-глутамилтриптофана. Дальнейшие исследования в области поиска и оптимизации ингибиторов клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разработке новых противовирусных препаратов высокой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Ключевые слова: грипп, клеточные мишени, воспаление, сигнальные пути, противовирусные препараты.

Обзоры

Грипп представляет собой высококонтагиозное заболевание человека. Ежегодно гриппом на планете переболевает 500 млн человек, умирает около 2 млн [23]. Вирус гриппа вызывает ежегодные эпидемии, а при появлении нового антигенного варианта вируса — пандемии, охватывающие все регионы земного шара и характеризующиеся высокой заболеваемостью, числом пациентов, нуждающихся в госпитализации и смертностью среди всех возрастных групп населения. Пандемия гриппа А(НШ1)рёш09 характеризовалась широким охватом населения многих стран мира, в том числе Российской Федерации, тяжелым клиническим течением и высокой летальностью [5, 16]. Неблагоприятные исходы чаще всего наблюдались не только у лиц с сопутствующими хроническими заболеваниями [16], но и у молодых людей без существенной предшествующей патологии, в том числе у бе-

ременных женщин [3, 4]. В последние годы отмечены также случаи инфицирования человека вирусами гриппа птичьего происхождения подтипов Н5М, Н7Ш и Н7Ш [39].

Вирионы гриппа представляют собой сферические или нитевидные частицы диаметром 80—100 нм, покрытые липидной оболочкой с интегрированными поверхностными гликопро-теидами трех типов — гемагглютинином (НА) и нейраминидазой (НА) и вирусным ионным каналом М2. Оболочка вириона происходит от плазматической мембраны клетки-хозяина и содержит липидные «плотики» — участки ли-пидного бислоя, обогащенные холестерином и имеющие высокую плотность и меньшую текучесть, отделенные друг от друга текучими участками мембраны малой плотности. Под ли-пидной оболочкой расположен слой матриксно-го белка М1, контактирующего с одной стороны

Авторы:

Зарубаев В.В., к.б.н., зав. лабораторией молекулярных основ химиотерапии вирусных инфекций ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург;

Смирнов В.С., д.м.н., главный научный сотрудник ЗАО МБНПК «Цитомед», Санкт-Петербург.

Адрес для переписки:

Зарубаев Владимир Викторович

197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 15/17, ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ. Тел.: (812) 499-15-72 (служебн.). E-mail: [email protected]

поступила в редакцию 11.11.2013 принята к печати 12.11.2013

© В.В. Зарубаев, В.С. Смирнов, 2013

с цитоплазматическими доменами HA и NA, а с другой — с сердцевиной вириона. Сердцевинный рибонуклеопротеин (РНП) представлен восемью сегментами генома — одноцепочечной РНК негативной полярности — в комплексе с белком нуклеопротеина и тремя субъединицами полимеразного комплекса.

При инфицировании клетки РНП попадают в цитоплазму и ядро, где происходит транскрипция, трансляция и репликация сегментов вирусного генома. Транскрипция и репликация вирусспецифических РНК осуществляются вирусным полимеразным комплексом. В отличие от полимераз эукариотических клеток, вирусная полимераза лишена механизма коррекции ошибок. Вследствие этого частота мутаций вирусного генома составляет, по разным оценкам, от 10-4 до 10-6 нуклеотидов на цикл репликации [44, 54]. Это на несколько порядков выше, чем скорость мутирования бактерий и эукариот (1010—1011) [10]. Вследствие этих особенностей, а также короткого жизненного цикла эволюция вируса гриппа протекает быстро. Это служит причиной двух явлений. Во-первых, быстрое формирование мутаций позволяет вирусу ускользать от адаптивного иммунного ответа хозяина. Благодаря этому он способен вызывать ежегодные эпидемии, несмотря на формирование иммунной прослойки населения как следствие вакцинации и естественной заболеваемости. Во-вторых, на фоне использования противовирусных препаратов формируются лекарственно-устойчивые штаммы вируса, следствием чего является снижение эффективности противовирусной химиотерапии.

В настоящее время для профилактики и терапии гриппозной инфекции доступны препараты, обладающие различным механизмом активности. Следуя последовательности событий при развитии гриппозной инфекции, к ним необходимо отнести, во-первых, препараты ин-терферонов и их индукторов, стимулирующие врожденный иммунитет и ограничивающие инфекцию на ранних стадиях [55], и во-вторых, этиотропные препараты, воздействующие на специфические вирусные мишени. Международно признанными противогриппозными препаратами являются химические соединения двух групп — производные адамантана (амантадин и его аналог в России — ремантадин) [49] и ингибиторы вирусной нейрамини-дазы — осельтамивир (Тамифлю®) и занамивир (Реленца®) [8]. В США получено разрешение FDA на использование еще двух ингибиторов нейраминидазы — перамивира (Рапиакта®) внутривенно [50], и ланинамивира (Инавир®) ингаляционно [58]. В России ни перамивир, ни ланинамивир не сертифицированы.

Недостатком препаратов как первой, так и второй группы является снижение их эффективности при позднем начале лечения [29]. Препараты интерферонов и их индукторов про-

являют максимальный уровень защиты при использовании в качестве средств экстренной профилактики, проводимой сразу после инфицирования, еще до появления клинических симптомов. Этиотропные средства эффективны в первые 48 ч после появления клинических симптомов болезни [29]. Кроме того, к этиотроп-ным препаратам вирус, как уже упоминалось, способен быстро вырабатывать устойчивость. С середины 90-х гг., например, отмечен рост доли ремантадин-устойчивых вирусов, и на сегодняшний день практически все изоляты вируса гриппа устойчивы к препаратам адамантаново-го ряда — амантадину и ремантадину [19]. То же было отмечено в пределах подтипа сезонного гриппа А(НШ1), когда за полтора года (с ноября 2007 по март 2009 г.) уровень устойчивости к осельтамивиру вырос с 0 до 100% во всех регионах земного шара [9]. Осельтамивир-устойчивые штаммы отмечены также среди изолятов высокопатогенных вирусов гриппа птиц Н5№ [19] и Н7№ [22], а кроме того, описаны случаи формирования лекарственно-устойчивых вариантов вируса непосредственно в процессе терапии пациентов [22].

Когда речь идет о случаях тяжелого, затяжного, осложненного гриппа, включающих последствия цитокинового шторма [56], или поздних стадий болезни, для уменьшения тяжести заболевания применяют препараты третьей группы, снижающие остроту реактивных процессов. Такие процессы индуцируются вирусом, но реализуются механизмами хозяина. К ним следует отнести такие явления, как отек легких, токсический синдром, гиперпродукцию провоспали-тельных цитокинов, клеточную воспалительную инфильтрацию ткани легких, геморрагический синдром и т.п. Препараты этой группы не влияют на вирусную репродукцию, а представляют собой средства, влияющие на другие факторы патогенеза гриппозной инфекции, то есть средства патогенетической терапии.

Эти соединения являются важной составляющей терапии не только гриппа, но и других заболеваний со сходным патогенезом. Так, например, в качестве средства борьбы с экспрессией провоспалительных цитокинов при сепсисе был разработан антагонист ТЬЯ4 эриторан [42]. Помимо сепсиса, однако, он оказался эффективным средством защиты и от летальной гриппозной инфекции [52]. При дозе вируса, вызывающей гибель 90% животных в контроле, в группе, получавшей эриторан со 2 суток после инфицирования, гибель составила лишь 10—20%, что обеспечивало индекс защиты 78—89%, сопоставимый с показателями препарата сравнения — этиотропного средства осельтамивира. Более того, эриторан проявлял протективную активность и на поздних стадиях инфекции, вплоть до 6-х суток после заражения, когда активность осельтамивира уже не отмечалась [52]. Использование эриторана приводило также к значитель-

ной нормализации морфологической картины легких, снижая степень отека и воспалительной инфильтрации легочной ткани. При этом инфекционная активность вируса не менялась под воздействием препарата за исключением поздних стадий развития инфекции, когда размножение вируса в ткани уже не играет ведущей патогенетической роли.

Тяжесть гриппа, как уже упоминалось, во многом обусловлена дисрегуляцией воспалительного ответа на заражение вирусом. Такая инфекция характеризуется избыточной степенью воспалительных процессов и гиперпродукцией провос-палительных цитокинов, известной как «цито-киновый шторм» [56]. Одним из ведущих путей развития воспаления является каскад реакций, запускаемый ферментами циклооксигеназами СОХ-1 и СОХ-2, катализирующими превращение арахидоновой кислоты в простагландины. Ингибиторы циклооксигеназ широко используются в медицине как анальгетики и противовоспалительные средства. Классические нестероидные противовоспалительные препараты блокируют как СОХ-1, так и СОХ-2, предпочтительнее все же СОХ-1. В эксперименте синтетические ингибиторы СОХ-2 (целекоксиб) и СОХ-1 (БС-560) оказались способны в значительной мере снизить продукцию провоспалительных цитокинов ТНБа и G-CSF в бронхолегочных смывах мышей при гриппозной инфекции [6], однако сколько-нибудь существенного влияния на смертность животных, а тем более на продукцию вируса в легких обнаружено не было. Больше того, избирательное угнетение СОХ-1 приводило даже к повышению смертности, потере веса животными и более выраженной гипотермии, возможно играющей в данном случае ключевую роль.

В другом исследовании [62] была показана дополнительная протективная активность комбинации двух ингибиторов оксигеназ — целе-коксиба и месалазина — с противогриппозным препаратом прямого действия занамивиром. Целекоксиб, как уже указывалось, ингибирует фермент СОХ-2, месалазин способен угнетать как циклооксигеназный, так и липоксигеназ-ный воспалительные пути, приводя к снижению продукции провоспалительных цитокинов и эйкозаноидов, и, как следствие, к деактивации воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы. Кроме того, месалазин ингиби-рует активацию фактора NF-кB и стимулирует синтез фосфатидной кислоты, угнетая тем самым стимуляцию апоптоза церамидами [62]. При начале лечения через 48 часов после инфицирования, что моделирует реальную ситуацию в клинической практике, смертность в группе животных, получавших комбинированное лечение, была ниже, чем в группе, получавшей за-намивир в виде монопрепарата. Снижение титра вируса в легких при этом сопровождалось нормализацией структуры легочной ткани и снижением степени ее воспалительной инфильтрации,

в отличие от группы занамивира, где на фоне снижения инфекционной активности вируса не отмечалось разницы в смертности животных и воспалительной реакции в легких.

Другой противовоспалительный препарат — кетотифен — ингибирует процессы деграну-ляции тучных клеток [26]. Этим достигается ограничение продукции в очаге воспаления про-воспалительных медиаторов, включая гистамин, №N7 и фермент триптазу. Эти свойства кетоти-фена обуславливают его высокую протективную активность на модели летальной гриппозной инфекции, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа подтипа Н5№ [24]. Не влияя собственно на репродукцию вируса в легких, кетотифен, тем не менее, нормализовал показатели веса животных, снижал степень отека и воспалительной инфильтрации легочной ткани, уровень апопто-тических процессов в легких и специфическую смертность животных. При этом активность кетотифена, как и в случае эриторана, превышала активность вирусспецифического препарата осельтамивира [24].

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют, что необходимы дополнительные экспериментальные и/или клинические исследования, чтобы достоверно обосновать и стандартизировать применение ингибиторов цикло-оксигеназ в терапии тяжелого гриппа [25].1Р). Компоненты этого каскада играют важную роль в самых разных аспектах клеточного сигналинга и метаболизма. О важности этого пути свидетельствует, например, тот факт, что стимуляция синтеза S1P приводит к активации факторов транскрипции NF-кB и STAT3 с последующим формированием сигнальной петли, ведущей к злокачестве-ному перерождению клетки. Ингибирование этого процесса фармакологическими препаратами замедляет рост и прогрессирование опухоли и уровень воспалительных медиаторов. На 2013 г. описано свыше 25 препаратов, влияющих на компоненты S1P-сигнального пути, из них 11 находятся на завершающих стадиях клинических испытаний или разрешены к применению как средства терапии опухолей, ревматоидного артрита, язвенного колита, рассеянного склероза, псориаза, то есть патологий, так или иначе основанных на избыточном или неадекватном воспалении [31]. Рецепторы S1P (S1PR1—S1PR5) участвуют в развитии сепсиса, изменении проницаемости сосудов и развитии отека легких. При этом именно последнее касается темы настоящего обзора и обосновывает правомочность регуляции этих компонентов при тяжелом гриппе, признаком которого является как раз отек легких. (рис. 1), направленного против раннего иммунного ответа, приводило к существенному

Рисунок 1. Структура агониста сфингозин-1-фосфатного пути AAL-R

снижению смертности животных в эксперименте [59], причем степень защиты (82%) превосходила соответствующий показатель для препарата сравнения — осельтамивира (50%).

Подобно кетотифену, AAL-R не влиял на репродукцию вируса в легких животных, однако в значительной степени снижал количество клеток, составляющих воспалительный экссудат. Способность к продукции противовирусных антител при этом сохранялась. Оптимальные защитные показатели были достигнуты при совместном применении осельтамивира и AAL-R. Важно также, что использование этого сфин-гозинового аналога оказалось эффективным даже спустя 4 суток после начала инфекции, что свидетельствует о высоком терапевтическом потенциале такого подхода при терапии поздних и осложненных форм гриппа [36].

Отдельного внимания заслуживает еще один подход к терапии тяжелого гриппа — повышение способности организма к преодолению патологического процесса путем минимизации вредного действия воспалительных медиаторов на сосуды. Известно, что характерным свойством гриппа является резкое повышение проницаемости гистогематического барьера, что ведет к развитию множественных геморрагий и обусловливает полиорганную недостаточность при тяжелом гриппе [28]. Для компенсации этой повышенной проницаемости сосудов в организме существуют сигнальные пути противоположной направленности, стабилизирующие состояние эндотелия и базальных мембран. Так, например, последовательность реакций, запускаемая белком Slit и опосредуемая эндотелиальным рецептором Robo4, была идентифицирована как путь, модулирующий стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальны-ми клетками. Активация такого пути оказалась эффективной для снижения проницаемости капилляров, мультиорганного отека и смертности при многих формах экспериментальных инфекций, включая высокопатогенный грипп H5N1 [32]. При этом сам белок Slit не влиял на продукцию вируса. Более того, что особенно важно, он не оказывал воздействия даже на уровень про-воспалительных цитокинов в легких, что свидетельствует о том, что самого по себе ограничения реакции сосудов на гиперцитокинемию достаточно для снижения тяжести заболевания и уровня смертности. В описанных опытах, например, было достигнуто снижение смертности на 40-50%.

В целом, перечисленные препараты применяются как патогенетические средства для терапии тяжелого гриппа. Отличительная их особенность — высокий терапевтический эффект на поздних сроках заболевания и в случаях тяжелого и осложненного гриппа — основана на конкретных мишенях их действия и особенностях патогенеза таких форм инфекции. Известно, что с точки зрения патогенеза любой инфекционный процесс является суммой действия собственно патогена и ответной реакции организма. Как уже упоминалось, препараты прямого противовирусного действия активны лишь в первые дни заболевания, когда в организме протекают интенсивные процессы вирусной репродукции. Однако при уже запущенных реактивных процессах — цитокиновом шторме и массовой деструкции клеток, сформированном отеке легких и нарушениях микроциркуляции органов — основной вклад в патогенез гриппа вносит уже не вирусный, а именно реактивный компонент. Поэтому естественно, что препараты, направленные против этих факторов патогенеза имеют терапевтическую активность.

Выделяется, однако, еще одна, четвертая группа химических препаратов, которая заслуживает отдельного упоминания. Так же, как и препараты предыдущей группы, эти соединения воздействуют не на вирусные, а на клеточные мишени. Особенность этих мишеней состоит в том, что выполняя функции, важные для клетки, они являются необходимыми для жизненного цикла самого вируса. Емкость вирусного генома очень ограничена, и в ходе репродукции он вынужден использовать многие клеточные компоненты, в том числе метаболические и сигнальные механизмы клетки-хозяина. Естественно, что их ингибирование снижает инфекционную активность вируса и уровень его репликации.

Чтобы пояснить зависимость вирусной репродукции от клеточных метаболических путей, приведем наиболее очевидный пример — трансляция вирусных мРНК, полностью обеспечиваемая клеточной системой белкового синтеза. Угнетение этого процесса закономерно приводит к резкому снижению вирусной репродукции. Этот путь используется клеткой, например, в ходе развития антивирусного статуса при воздействии на клетки интерферона [46]. Однако селективность такого воздействия невелика, и действие интерферонов затрагивает как вирусные, так и клеточные процессы. В клетке, находящейся в антивирусном статусе, в равной степени разрушены и вирусные, и клеточные мРНК, благодаря чему подавлен синтез как вирусных, так и клеточных белков.

С развитием методических подходов к изучению внутри- и межклеточных механизмов передачи сигнала было выяснено, что многие вирусы способны использовать для собственной репликации и другие метаболические и сиг-

нальные клеточные сети [47]. В результате многочисленных исследований были разработаны специфические ингибиторы каждого из них, а за последние несколько лет была обнаружена и охарактеризована их противогриппозная активность. Приведем наиболее изученные в этом отношении примеры.

При инфицировании клетки вирусом гриппа активируется центральный и наиболее изученный путь регуляции врожденного противовирусного иммунитета — сигнальный путь NF-kB. В клетках он контролирует экспрессию генов, регулирующих острый воспалительный ответ, адгезию и дифференцировку клеток, апоп-тоз и ответ на вирусную инфекцию. На ранних стадиях инфекция приводит к активации комплекса PI3K/Akt и последующей активации экспрессии NF-kB. Он, в свою очередь, регулирует экспрессию многих генов, включая, в том числе, проапоптотические факторы TRAIL, Fas и FasL. Два последних активируют эффекторные белки апоптоза — каспазы, ферменты, осуществляющие специфическую деградацию комплекса ядерных пор в инфицированной клетке [12, 13, 51, 63]. Такая деградация является одним из первых этапов многоступенчатого процесса программируемой клеточной гибели. При помощи этого механизма ценой гибели инфицированной клетки достигается ограничение размножения вируса во всем организме.

Однако следует учитывать, что в ядре зараженной клетки происходят процессы транскрипции и репликации вирусного генома, и присутствуют многочисленные фрагменты вирусных РНП, которым предстоит выйти через ядерные поры в цитоплазму для участия в сборке вирио-нов потомства. На последней стадии описанного каскада реакций — деградации ядерных пор благодаря активности каспаз — диффузия вирусных РНП через разрушенные поры существенно облегчается по сравнению с порами интактными. Таким образом, являясь исходно противовирусным сигнальным путем, призванным ограничивать вирусную репродукцию, NF-kB в определенный момент, напротив, способствует более активной реализации жизненного цикла вируса [38]. Угнетение этого сигнального пути мешает реализации вирусной программы репликации и снижает эффективность продукции вирионов потомства.

Препараты-ингибиторы этого пути принадлежат к различным химическим группам и воздействуют на различные компоненты каскада [18]. Одни из них (SC75741) нарушают связывание NF-kB с ДНК, препятствуя тем самым индукции факторов апоптоза и активации кас-паз, другие (PS-341 (бортезомиб), MG132, VL-01 и др.) являются ингибиторами протеосом, препятствуя убиквитин-зависимой деградации IkB или ингибируют NF-кВ-активирующую киназу IKK (ацетилсалициловая кислота, LASAG), что в дальнейшем приводит к угнетению процесса

фосфорилирования и деградации 1кВ. В целом, независимо от конкретной точки приложения, ингибирование тех или иных компонентов пути NF-кB приводит к снижению вирусной продукции в клетке [17].

Другим примером использования клеточных путей вирусом гриппа является сигнальный путь Raf/MEK/ERK [33]. Как известно, трансляция вирусных белков происходит в цитоплазме инфицированной клетки.А) — транспортируются к плазматической мембране, встраиваются в нее и формируют кластеры. РНП потомства транспортируются к сайтам скоплений поверхностных белков, взаимодействуют с белком М1 и цитоплазматическими доменами НА и NA, что приводит к искривлению мембраны и дальнейшему почкованию ви-рионов потомства [48].

Формирование вирусных РНП происходит в ядре инфицированной клетки. С одной стороны, для полноценного формирования им необходимо находиться в ядре достаточно долго, чтобы образовать полноценную сердцевину будущих вирионов. С другой стороны, к моменту образования кластеров НА и NA на плазматической мембране им необходимо транспортироваться к сайтам сборки и почкования вирионов, то есть должен существовать механизм, запускающий или подавляющий ядерный экспорт РНП в зависимости от стадии развития инфекционного процесса в клетке. Таким механизмом и является сигнальный путь Raf/MEK/ERK. Его активация индуцируется сборкой агломератов вирусных гликопротеидов на поверхности клетки, и его компоненты направляют транспорт РНП к плазматической мембране. На сегодняшний день неясно, каким именно образом это происходит. Однако ингибиторы этого сигнального пути в значительной степени препятствуют нормальному протеканию вирусной инфекции и накоплению вируса в высоких титрах [35, 45].

Одним из первых этапов пути Raf/MEK/ ERK, является активация белка Raf при помощи ГТФ-связанной формы белка Ras. Поскольку примерно половина новообразований человека содержит в клетках мутации в генах raf или ras, разработка ингибиторов этих генов велась исключительно в аспекте онкологических проблем. Так, шесть препаратов, доведенных до II фазы клинических исследований в области противораковой химиотерапии, оказались эффективными ингибиторами гриппозной инфекции. Это соединения, близкие между собой по химической структуре — и0126, препараты С1-1040 и PD-0325901, AZD-6244 и AZD-8330, а также препарат RDEA-119 (рис. 2). Их 50% ин-гибирующие концентрации в отношении вируса гриппа лежат в пределах от 1200 до 4 нМ, что свидетельствует об их высокой противовирусной активности [11, 20]. р р

Рисунок 2. Ингибиторы сигнального пути Raf/MEK/ERK, доведенные до стадии клинических исследований

Еще один сигнальный путь — PI3K/AKT/ mTOR — также используется вирусом гриппа для обеспечения собственной репликации [12]. В клетке этот путь регулирует дифференци-ровку, метаболизм и инициацию трансляции, а также во многом пересекается с другими сигнальными путями, такими как Raf/MEK/ERK и NF-кB. В ходе вирусной репродукции этот путь используется на ранних этапах вирусной инфекции — для регуляции проникновения вируса в клетку, а также на поздних стадиях — для правильной локализации вирусных РНП и предотвращения преждевременного апопто-за инфицированных клеток. Бактериальный метаболит вортманнин и морфолиновое про-

Рисунок 3. Структура NVP-BEZ235 — ингибитора PI3K/AKT/mTOR [47]

изводное кверцетина LY294002, хотя и не были доведены до стадии клинических исследований из-за низкой биодоступности, явились, тем не менее, важным инструментом для фундаментальных исследований, связанных с передачей сигнала посредством PI3K-пути, а также основой для разработки оптимизированных производных [34]. Одно из них, NVP-BEZ235 (рис. 3), проходит II фазу клинических исследований в качестве противоракового препарата [47].

Описан еще один сигнальный путь, связанный с гриппозной инфекцией. Инфицирование вирусом гриппа активирует сигнальный белок C-Jun терминальную киназу (JNK). Она, в свою очередь, активирует фактор транскрипции AP-1, который стимулирует экспрессию интерферона-в, играющего важную роль в противовирусном ответе клетки. Ингибирование JNK, следовательно, должно приводить к повышению вирусной продукции. Тем не менее, синтетические ингибиторы SP600125 и AS601245 (рис. 4), напротив, снижали уровень репродукции вирусов гриппа независимо от их подтипа. Противовирусная активность этих препаратов была обусловлена их способностью ингибиро-вать синтез вирусных РНК при помощи не выясненного пока механизма [43]. Известно также, что SP600125 не влияет напрямую на активность вирусной РНК-полимеразы, а подавляет активность вирусного белка NS1, что, по-видимому,

Рисунок 4. Структуры SP600125 (а) и AS601245 (б) [43]

приводит к большей эффективности системы противовирусного врожденного иммунитета. Эти результаты были подтверждены в опытах на животных, где SP600125 снижал вирусную нагрузку в легких мышей по сравнению с контрольной группой.

В работе Kumar et al. [30] были идентифицированы два ингибитора тирозинкиназных рецепторов, также проявляющих выраженную противогриппозную активность. Один из них, AG879, является селективным ингибитором сигнального пути, обусловленного рецептором фактора роста нервов и рецептором эпидермального фактора роста 2 (TrkA/HER2), другой — тирфостин А9 — ингибирует сигнальный путь фактора роста тромбоцитов (PDGFR). Каждый из этих ингибиторов угнетает по крайней мере три внутриклеточных стадии жизненного цикла вируса — оба ингибируют синтез всех трех типов вирусспе-цифических РНК, блокируют ядерный экспорт вирусных РНП, а также предотвращают почкование дочерних вирусных частиц, воздействуя на путь, направляемый ферментом биосинтеза липидов — фарнезилдифосфатсинтетазой.

Говоря о роли клеточных киназ в цикле репликации вируса гриппа, следует также упомянуть об исследовании Konig et al. [27], в котором при помощи полногеномного скрининга были идентифицированы 295 клеточных факторов, необходимых для репликации вируса. Большая часть этих белков является киназами, то есть ферментами, регулирующими большинство клеточных сигнальных путей. В дальнейшем путем анализа стандартной библиотеки из 300 киназ [37] были изучены ингибиторы киназ широкого спектра, в результате чего идентифицировано вещество ON108110, эффективно ингибирующее 25 из 300 проанализированных киназ. При этом 8 из них оказались ранее охарактеризованы как необходимые для репликации вируса.

Дальнейшее тестирование показало, что 0N108110 угнетает ядерный экспорт вирусных рибонуклеопротеинов и/или репликацию вирусных РНК, частично воздействуя также на клеточные механизмы транскрипции. Однако вирусный полимеразный комплекс оказался гораздо более чувствителен к воздействию препарата, что позволяет использовать его в дозах, лежащих ниже порога токсичности. Кроме того, 0N108110 снижал продукцию двух других РНК-геномных вирусов — вируса везикулярного

стоматита и вируса болезни Ньюкасла, что указывает на его роль в ингибировании киназ, необходимых для репродукции не только вируса гриппа, но и других вирусов.

Одной их форм реакции клеток на стрессор-ные воздействия является аутофагия — высококонсервативный для всех эукариотических клеток процесс. Исходно аутофагия была идентифицирована как процесс, индуцированный голоданием клетки. Однако к настоящему времени известно, что он играет важную роль в физиологии и патофизиологии и является клеточным ответом на самые разные стимулы, в том числе на вирусную инфекцию. Он также может играть роль в поддержании репродукции вируса гриппа в клетках. В условиях угнетения аутофагических процессов фармакологическими препаратами или при помощи РНК-интерференции выход вирусного потомства и синтез вирусных белков значительно снижаются. Аутофагия, таким образом, является одним из ключевых процессов, обеспечивающих репликацию вируса гриппа.

Zhou et al. [64] было показано, что гриппозная инфекция запускает в зараженных клетках образование аутофагосом и стимулирует синтез белка LC3-II — специфического маркера этих орга-нелл. Обработка таких клеток 3-метиладенином или вортманнином — ингибиторами аутофа-гии — снижала выход вирусных частиц в 2—5 раз, а инфекционность вирусного потомства — приблизительно на порядок. Сходные результаты были получены при инактивации гена LC3 при помощи специфических siRNA. Механизмы подобных взаимоотношений вируса и клетки остаются до конца не выясненными.

Группой исследователей [7] была даже сконструирована система скрининга противогриппозных препаратов на основе анализа взаимодействия между компонентами аутофагического

N. ОН ОН

Рисунок 5. Структура киназного ингибитора ON108110 [37]

Рисунок 6. Структура эводиамина — ингибитора аутофагии, обладающего противогриппозной активностью [7]

пути. Способность химических соединений угнетать взаимодействие белков Atg5, Atg12 и Atg16 была трактована как потенциальная противогриппозная активность. На панели из 83 растительных препаратов традиционной китайской медицины было идентифицировано соединение эводиамин (рис. 6) — алкалоид, содержащийся в экстракте эводии (Evodia rutecarpa Benth.) способное ингибировать образование аутофагосом, индуцированное гриппозной инфекцией, а также обладающее противовирусной активностью в отношении широкой панели вирусов гриппа разных подтипов. При этом токсичность эводиамина составила 100 мкг/мл, а показатель 50% эффективной дозы — 1,6 мкг/мл, что дает индекс селективности около 60 и свидетельствует о высоком противовирусном потенциале этого соединения и возможности дальнейшей оптимизации его структуры для повышения активности.

Таким образом, как видно из приведенных примеров, помимо воздействия непосредственно на вирусные мишени, размножение вируса гриппа может быть подавлено при помощи модуляции клеточных сигнальных путей. Следует отметить, что несмотря ни на доказанный противовирусный потенциал, ни на разрешенное клиническое применение, большинство из перечисленных соединений не используется в качестве средства для терапии гриппа. В первую очередь, это связано с высокой комплексностью сигнальных путей-мишеней. Подавляющее большинство этих препаратов разработаны для использования в области онкологии, то есть способны вмешиваться в работу важных для клетки и организма сигнальных систем, регулирующих такие принципиальные процессы, как апоптоз, деление и дифференцировка, ангиогенез и т.д. Воздействие на них, помимо ограничения продукции вируса, приводит ко многим побочным эффектам, которые могут существенно сдвигать соотношение «выгода/риск» в сторону риска для здоровья. Кроме того, особенности фармакологического рынка диктуют необходимость разделения препаратов для лечения опухолей и респираторных вирусных инфекций. Иными словами, в практике фармакологии стремятся избегать одним и тем же действующим веществом лечить и онкологические заболевания, и грипп. Эти аспекты в некоторой степени ограничивают разработку эффективных противогриппозных препаратов, направленных на клеточные мишени.

Некоторые соединения, как было уже упомянуто, сочетают в себе несколько типов активности, каждая из которых приводит к снижению вирусной нагрузки, уменьшению интенсивности воспалительных процессов, нормализации структуры ткани при тяжелой гриппозной инфекции, и т.п. Так, например, глицирризи-новая кислота (ГК) является эффективным и малотоксичным индуктором IFNy. В работе Utsunomiya et al. [57] было показано, что благодаря этой способности глицирризиновая кислота на 100% предотвращает смертность мышей от гриппозной инфекции при заражении дозой вируса A(h3N2) 10 LD50. Параллельная обработка животных антителами к IFNy полностью снимала протективный эффект ГК, что доказывает механизм ее защитного действия. С другой стороны [40], показано, что ГК является мощным имуномодулятором. В терапевтических дозах на модели гриппозной инфекции макрофагов человека, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа H5N1, ГК снижала продукцию провоспалительных цитокинов CXCL10, IL-6 и CCL-5, а также ингибировала вирусиндуци-рованный апоптоз. При этом не было отмечено никакого влияния этого соединения на продукцию вируса в клетках.

Кроме того показано [41], что в клетках A549, являющихся аналогом альвеолоцитов человека, ГК ингибировала репликацию высокопатогенного вируса гриппа H5N1, снижала степень вирусиндуцированного апоптоза клеток и экспрессию провоспалительных цитокинов. Неясно, является ли такая активность следствием или независима от собственно ее противовирусной активности. Известно, что оболочечные вирусы в процессе слияния вирусной и клеточной мембран нуждаются в определенной текучести липидного бислоя и следовательно, зависят от реологических свойств клеточной мембраны. Так, снижение текучести мембраны на 5% ингибировало размножение ВИЧ-1 на 56%, а 5%-ное повышение текучести напротив, повышало инфекционность вируса в 2,4 раза [21]. Показано также, что те же закономерности применимы и в случае гриппозной инфекции [61]. В высоких концентрациях ГК препятствует интернализации вирионов гриппа, взаимодействуя с мембранами и снижая их текучесть. Эти свойства объясняют также активность ГК in vitro в отношении других вирусов — SARS-ассоциированного коронавируса, ВИЧ-1, респираторно-синцитиального вируса, вируса гепатита В, арбовирусов, вируса осповакци-ны, вирусов группы герпеса (вирус варицелла-зостер, вирус простого герпеса 1 типа, вирус Эпштейна—Барр, цитомегаловирус, вирус саркомы Капоши) и вируса везикулярного стоматита [15]. В дополнение к уже описанным механизмам подавления вирусной репродукции, известно, что ГК снижает мембранный транспорт и сиалирование поверхностного антигена

вируса гепатита В, а также ингибирует ферменты фосфорилирования при инфекции, вызванной вирусом везикулярного стоматита [15].

Таким образом, несмотря на противоречивые сведения о наличии у ГК прямой противовирусной активности в отношении вируса гриппа, можно говорить, что она является, тем не менее, потенциально важным компонентом комплексной противогриппозной терапии благодаря наличию других типов биологической активности, важных при лечении тяжелой и осложненной инфекции. В наших собственных исследованиях [1, 2] продемонстрирована протективная активность ГК против вирусов гриппа A(h2N1) pdm09 и A(h4N2). Снижение титра вируса в ткани легких при этом составило приблизительно 1 порядок. При этом достоверного противовирусного действия в культуре клеток MDCK отмечено не было. Добавление к ГК иммуномоду-лирующего дипептида а-глутамилтриптофана повышало противовирусную активность комбинации, снижая вирусный титр на 5—6 порядков по сравнению с контролем и гибель животных — на 77%. Таким образом, комбинация двух препаратов, неактивных in vitro, имела выраженный эффект in vivo, и механизмы этой активности следует расшифровывать в дальнейших исследованиях.

Преимущества описанного подхода к терапии гриппа очевидны. В отличие от этиотропных соединений, против которых вирус способен вырабатывать устойчивость, препараты против клеточных мишеней лишены этого недостатка. По сравнению с вирусом гриппа, клетка — гораздо более сложная система, обладающая многими уровнями контроля за возникновением мутаций и их коррекции, вплоть до гибели клетки, несущей эти изменения. Во-вторых, в дополнение к антивирусной активности, многие препараты этой группы обладают другими видами биологической активности — противовоспалительной, цитопротекторной и др. Такая активность не столь важна в случаях заболеваний средней тяжести, однако становится жизненно важной, когда речь идет о случаях позднего, тяжелого и осложненного гриппа, где ведущую роль в патогенезе играют не вирусные, а реактивные процессы. Список препаратов — потенциальных кандидатов для комплексной терапии гриппа, разумеется, не исчерпывается соединениями, перечисленными в настоящем обзоре. С развитием представлений о патогенезе

гриппозной инфекции как о сложном процессе, включающем связанные и взаимозависимые каскады реакций, появляются основания включать все больше число ингибиторов каждого из них в число лекарств, способных нормализовать течение гриппа. Сюда относятся статины, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента и блокаторы ангиотензинового рецептора, агонисты рецепторов, активируемых перокси-сомными пролифераторами и агонисты АМФ-активируемых протеинкиназ, и др. [14].

В настоящем обзоре мы ограничились терапией одной только гриппозной инфекции. Описанные соединения, однако, воздействуют на процессы, общие для тяжелых воспалительных заболеваний, независимо от конкретной этиологии — продукцию провоспалительных цитокинов, миграцию клеток в очаг воспаления, и т.п. Поэтому следует ожидать, что соединения, активные при гриппе, окажутся также эффективными и при других вирусных заболеваниях сходного патогенеза, как это имеет место в случае ГК. Следовательно, дальнейшие исследования в области поиска и оптимизации ингибиторов клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разработке новых противовирусных препаратов высокой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Таким образом, препараты для терапии гриппозной инфекции следует разделять как по механизмам действия, так и по срокам применения. Во-первых, это препараты, наиболее эффективные для профилактики и экстренной профилактики (интерфероны и их индукторы). Во-вторых, это препараты этиотропного механизма, использование которых необходимо на всех сроках гриппа после постановки диагноза, но эффективно лишь на ранних стадиях заболевания. Наконец, в-третьих, на дальних стадиях и в случаях тяжелой и осложненной инфекции необходимо использование соединений патогенетического механизма действия, которые могут снижать или не снижать собственно вирусную репродукцию. При этом применение препаратов, действующих на систему врожденного иммунитета, является абсолютно целесообразным как в раннем периоде терапии, так и в более поздние сроки, при этом сочетанное применение специфических и неспецифических препаратов представляет собой оптимальный путь повышения эффективности терапии гриппа.

Списоклитературы

1. Смирнов В.С., Зарубаев В.В., Анфимов П.М., Штро А.А. Влияние комбинации глутамил-триптофана с глицирри-зиновой кислотой на течение острой инфекции у мышей, вызванной вирусом гриппа (h4N2) // Вопросы вирусологии. — 2012. — № 3. — C. 23-27.

2. Смирнов В.С., Гаршинина А.В., Штро А.А., Аникин В.Б., Галочкина А.В., Беляевская С.В., Зарубаев В.В. Протективная активность комбинации глутамил-триптофана и глицирризиновой кислоты при пероральном введении на модели экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной осельтамивир-устойчивым штаммом вируса // Вопросы вирусологии. — 2014 (в печати).

3. Черняев А.Л., Зайратьянц О.В., Полянко Н.И. Патологическая анатомия гриппа A/h2N1 // Архив патологии. — 2010. — № 3. — C. 3-6.

4. Яковлев А.А., Рахманова А.Г., Цинзерлинг В.А. О пандемии гриппа A/h2N1 у иммунодепрессивных лиц в Санкт-Петербурге (апрель-декабрь 2009 г.) // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2010. — Т. 2, № 1. — С. 94-101.

Ссылки 5-64 см. в References (с. 24-26). See References for numbers 5-64 at pp. 24-26.

Infekcia i immunitet (Infection and Immunity) reviews

2014, vol. 4, no. 1, pp. 15-26 RtVItWS

INFLUENCE ON CELLULAR TARGETS FOR TREATING INFLUENZA INFECTION

Zarubaev V.V.a, Smirnov V.S.b

a Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation, St. Petersburg, Russian Federation b MBRD «Cytomed», St. Petersburg, Russian Federation

Abstract. Influenza is a highly contagious infection of humans. The use of specific antivirals leads to emergence of drug-resistant strains following by the decrease of efficacy of ethiotropic chemotherapy. In this review the data about the decrease of the level of viral replication and severity of pathological process based on the use of alternative targets of cellular instead of viral origin are presented. The medicines for decreasing the production of proinflammatory cytokines (eritoran), restricting the degranulation of mast cells (ketotifen), inhibitors of cyclo oxygenases (celexocib, mesalasine, SC-560), inhibitors of sphingosine-1-phospate pathway (AAL-R) and compounds increasing the capillars stability by strengthening the contacts between endothelial cells (Slit protein) have been described in the review. The special attention is paid to the inhibitors of cellular pathways that are used by the virus to provide its reproduction, such as NF-kB, Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR. Information concerning anti-influenza activity of kinase and autophagy inhibitors is summarised as well as data about the preparations of combined mechanism of activity — glycirrhizic acid and dipeptide alpha-glutamyl-tryptophane. Further studies in the field of search and optimization of inhibitors of cellular components as remedies against influenza infection could lead to the development of novel antivirals with high efficacy, broad spectrum of activity and low probability of virus resistance.

Key words: influenza, host targets, inflammation, signal pathways, antivirals. Authors:

Zarubaev V.V.H, PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Anti-Viral Chemotherapy, Research Institute of Influenza. 197376, Russian Federation, St. Petersburg, Professor Popov str., 15/17. Phone: (812) 499-15-72 (office). E-mail: [email protected];

Smirnov V.S., PhD, MD (Medicine), Principal Scientist, MBRD «Cytomed», St. Petersburg, Russian Federation.

References

1. Smirnov V.S., Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Shtro A.A. Vliyanie kombinatsii glutamil-triptofana s glitsirrizinovoy kislotoy na techenie ostroy infektsii u myshey, vyzvannoy virusom grippa (h4N2) [Effect of a combination of glutamyl-tryptophan and glycyrrhizic acid on the course of acute infection caused by influenza (h4h3) virus in mice]. Voprosy virusologii — Problems of Virology, 2012, vol. 57, no. 3, pp. 23—27.

2. Smirnov V.S., Garshinina A.V., Shtro A.A., Anikin V.B., Galochkina A.V., Belyaevskaya S.V., Zarubaev V.V. Protektivnaya ak-tivnost’ kombinatsii glutamil-triptofana i glitsirrizinovoy kisloty pri peroral’nom vvedenii na modeli eksperimental’noy letal’noy grippoznoy infektsii u belykh myshey, vyzvannoy osel’tamivir-ustoychivym shtammom virusa (v pechati) [Antiviral activity of complex of glycirrhysic acid-alpha-glutamyltryptophan against experimental lethal influenza infection in white mice caused by oseltamivir-resistant strain of the virus (in press)].pez S. Molecular Anatomy of 2009 Influenza Virus A (h2N1). Archives of Medical Research, 2009, vol. 40, pp. 643-654.

6. Carey M.A., Bradbury J.A., Rebolloso Y.D., Graves J.P., Zeldin D.C., Germolec D.R. Pharmacologic inhibition of COX-1 and COX-2 in influenza A viral infection in mice. PLoS One, 2010, vol. 5(7), e11610.

7. Dai J.P., Li W.Z., Zhao X.F., Wang G.F., Yang J.C., Zhang L., Chen X.X., Xu Y.X., Li K.S. A drug screening method based on the autophagy pathway and studies of the mechanism of evodiamine against influenza A virus. PLoS One, 2012, vol. 7(8), e42706.

8. De Clercq E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat. Rev. Drug Discov, 2006, vol. 5, pp. 1015—1025.

9. Dixit R., Khandaker G., Ilgoutz S., Rashid H., Booy R. Emergence of oseltamivir resistance: control and management of influenza before, during and after the pandemic. Infect. Disord. Drug Targets, 2013, vol. 13, no. 1, pp. 34—45.

10. Drake J.W., Charlesworth B., Charlesworth D., Crow J.F. Rates of spontaneous mutation. Genetics, 1998, vol. 148, no. 4, pp. 1667—1686.

11. Droebner K., Pleschka S., Ludwig S., Planz O. Antiviral activity of the MEKinhibitor U0126 against pandemic h2N1v and highly pathogenic avian influenza virus in vitro and in vivo. Antiviral Res., 2011, vol. 92, pp. 195—203.

12. Ehrhardt C., Ludwig S. A new player in a deadly game: influenza viruses and the PI3K/Akt signalling pathway. Cell. Microbiol., 2009, vol. 11, pp. 863-871.

13. Ehrhardt C., Wolff T., Pleschka S., Planz O., Beermann W., Bode J.G., Schmolke M., Ludwig S. Influenza A virus NS1 protein activates the PI3K/Akt pathway to mediate antiapoptotic signaling responses. J. Virol., 2007, vol. 81, pp. 3058-3067.

14. Fedson D.S. Treating influenza with statins and other immunomodulatory agents. Antiviral Res., 2013, vol. 99, no. 3, pp. 417-435.

15. Fiore C., Eisenhut M., Krausse R., Ragazzi E., Pellati D., Armanini D., Bielenberg J. Antiviral effects of Glycyrrhiza species. Phytother. Res., 2008, vol. 22, no. 2, pp. 141-148.

16. Gill J.R., Sheng Z.M., Ely S.F., Guinee D.G.Jr., Beasley M.B., Suh J., Deshpande C., Mollura D.J., Morens D.M., Bray M., Travis W.D., Taubenberger J.K. Pulmonary pathologic findings of fatal 2009 pandemic influenza A/h2N1 viral infections. Arch. Pathol. Lab. Med, 2010, vol. 134, pp. 235-243.

17. Gilmore T.D., Garbati M.R. Inhibition of NF-kappaB signaling as a strategy in disease therapy. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2011, vol. 349, pp. 245-263.

18. Gilmore T.D., Herscovitch M. Inhibitors of NF-kappaB signaling: 785 and counting. Oncogene, 2006, vol. 25, pp. 6887-6899.

19. Govorkova E.A., Baranovich T., Seiler P., Armstrong J., Burnham A., Guan Y., Peiris M., Webby R.J., Webster R.G. Antiviral resistance among highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses isolated worldwide in 2002—2012 shows need for continued monitoring. Antiviral Res., 2013, vol. 98, no. 2, pp. 297-304.

20. Haasbach E., Hartmayer C., Planz O. Combination of MEK inhibitors and oseltamivir leads to synergistic antiviral effects after influenza A virus infection in vitro. Antiviral Res., 2013, vol. 98, pp. 319-324.

21. Harada S., Yusa K., Monde K., Akaike T., Maeda Y. Influence of membrane fluidity on human immunodeficiency virus type 1 entry. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, vol. 329, pp. 480-486.

22. Hay A.J., Hayden F.G. Oseltamivir resistance during treatment of H7N9 infection. Lancet, 2013, vol. 381, no. 9885,pp. 2230-2232.

23. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/2003/fs211/en.

24. Hu Y., Jin Y., Han D., Zhang G., Cao S., Xie J., Xue J., Li Y., Meng D., Fan X., Sun L.Q., Wang M. Mast cell-induced lung injury in mice infected with H5N1 influenza virus. J. Virol, 2012, vol. 86, no. 6, pp. 3347-3356.

25. Hui D.S., Lee N., Chan P.K. Adjunctive therapies and immunomodulatory agents in the management of severe influenza. Antiviral Res, 2013, vol. 98, no. 3, pp. 410-416.

26. Huston D.P., Bressler R.B., Kaliner M., Sowell L.K., Baylor M.W. Prevention of mast-cell degranulation by ketotifen in patients with physical urticarias. Ann. Intern. Med., 1986, vol. 104, no. 4, pp. 507-510.

27. Konig R., Stertz S., Zhou Y., Inoue A., Hoffmann H.H., Bhattacharyya S., Alamares J.G., Tscherne D.M., Ortigoza M.B., Liang Y., Gao Q., Andrews S.E., Bandyopadhyay S., De Jesus P., Tu B.P., Pache L., Shih C., Orth A., Bonamy G., Miraglia L., Ideker T., Garcia-Sastre A., Young J.A., Palese P., Shaw M.L., Chanda S.K. Human host factors required for influenza virus replication. Nature, 2010, vol. 463, pp. 813-817.

28. Kuiken T., Riteau B., Fouchier R.A., Rimmelzwaan G.F. Pathogenesis of influenza virus infections: the good, the bad and the ugly. Curr. Opin. Virol., 2012, vol. 2, no. 3, pp. 276-286.

29. Kumar A. Early versus late oseltamivir treatment in severely ill patients with 2009 pandemic influenza A (h2N1): speed is life. J. Antimicrob. Chemother., 2011, vol. 66, no. 5, pp. 959-963

30. Kumar N., Liang Y., Parslow T.G., Liang Y. Receptor tyrosine kinase inhibitors block multiple steps of influenza a virus replication. J. Virol, 2011, vol. 85, no. 6, pp. 2818-2827.

31. Kunkel G.T., Maceyka M., Milstien S., Spiegel S. Targeting the sphingosine-1-phosphate axis in cancer, inflammation and beyond. Nat. Rev. Drug Discov., 2013, vol. 12, no. 9, pp. 688-702.

32. London N.R., Zhu W., Bozza F.A., Smith M.C., Greif D.M., Sorensen L.K., Chen L., Kaminoh Y., Chan A.C., Passi S.F., Day C.W., Barnard D.L., Zimmerman G.A., Krasnow M.A., Li D.Y. Targeting Robo4-dependent Slit signaling to survive the cytokine storm in sepsis and influenza. Sci. Transl. Med, 2010, vol. 2, no. 23, 23ra19.

33. Ludwig S., Wolff T., Ehrhardt C., Wurzer W.J., Reinhardt, J., Planz O., Pleschka S. MEK inhibition impairs influenza B virus propagation without emergence of resistant variants. FEBS Lett., 2004, vol. 561, pp. 37-43.

34. Maira S.M., Finan P., Garcia-Echeverria C. From the bench to the bed side: PI3K pathway inhibitors in clinical development. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2010, vol. 347, pp. 209-239.

35. Marjuki H., Yen H.L., Franks J., Webster R.G., Pleschka S., Hoffmann E. Higher polymerase activity of a human influenza virus enhances activation of the hemagglutinin-induced Raf/MEK/ERK signal cascade. Virol. J., 2007, vol. 4, pp. 134.

36. Marsolais D., Hahm B., Walsh K.B., Edelmann K.H., McGavern D., Hatta Y., Kawaoka Y., Rosen H., Oldstone M.B. A critical role for the sphingosine analog AAL-R in dampening the cytokine response during influenza virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2009, vol. 106, no. 5, pp. 1560-1565.

37. Martinez-Gil L., Alamares-Sapuay J.G., Ramana Reddy M.V., Goff P.H., Premkumar Reddy E., Palese P. A small molecule multi-kinase inhibitor reduces influenza A virus replication by restricting viral RNA synthesis. Antiviral. Res., 2013, vol. 100, no. 1, pp. 29-37.

38. Mazur I., Wurzer W.J., Ehrhardt C., Pleschka S., Puthavathana P., Silberzahn T., Wolff T., Planz O., Ludwig S. Acetylsalicylic acid (ASA) blocks influenza virus propagation via its NF-kappaB-inhibiting activity. Cell. Microbiol., 2007, vol. 9, pp. 1683-1694.

39. Mei L., Song P., Tang Q., Shan K., Tobe R.G., Selotlegeng L., Ali A.H., Cheng Y., Xu L. Changes in and shortcomings of control strategies, drug stockpiles, and vaccine development during outbreaks of avian influenza A H5N1, h2N1, and H7N9 among humans. Biosci. Trends., 2013, vol. 7, no. 2, pp. 64-76.

40. Michaelis M., Geiler J., Naczk P., Sithisarn P., Ogbomo H., Altenbrandt B., Leutz A., Doerr HW., Cinatl J Jr. Glycyrrhizin inhibits highly pathogenic H5N1 influenza A virus-induced pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human macrophages. Med. Microbiol. Immunol., 2010, vol. 199, no. 4, pp. 291—297.

41. Michaelis M., Geiler J., Naczk P., Sithisarn P., Leutz A., Doerr H.W., Cinatl J. Jr. Glycyrrhizin exerts antioxidative effects in H5N1 influenza A virus-infected cells and inhibits virus replication and pro-inflammatory gene expression. PLoS One, 2011, vol. 6, no. 5, e19705.

42. Mullarkey M., Rose J.R., Bristol J., Kawata T., Kimura A., Kobayashi S., Przetak M., Chow J., Gusovsky F., Christ W.J., Rossignol D.P. Inhibition of endotoxin response by E5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J. Pharmacol. Exp. Ther, 2003, vol. 304, pp. 1093-1102.

43. Nacken W., Ehrhardt C., Ludwig S. Small molecule inhibitors of the c-Jun N-terminal kinase (JNK) possess antiviral activity against highly pathogenic avian and human pandemic influenza A viruses. Biol. Chem., 2012, vol. 393, no. 6, pp. 525-534.

44. Nobusawa E., Sato K. Comparison of the mutation rates of human influenza A and B viruses. J. Virol., 2006, vol. 80, no. 7, pp. 3675-3678.

45. Olschlager V., Pleschka S., Fischer T., Rziha H.J., Wurzer W., Stitz L., Rapp U.R., Ludwig S., Planz O. Lung-specific expression of active Raf kinase results in increased mortality of influenza A virus-infected mice. Oncogene, 2004, vol. 23, pp. 6639-6646.

46. Pitha P.M., Kunzi M.S. Type I interferon: the ever unfolding story. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2007, vol. 316, pp. 41-70.

47. Planz O. Development of cellular signaling pathway inhibitors as new antivirals against influenza. Antiviral Res., 2013, vol. 98. no. 3, pp. 457-468.

48. Rossman J.S., Lamb R.A. Influenza virus assembly and budding. Virology, 2011, vol. 411, no. 2, pp. 229-236.

49. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives. Antiviral Res., 1998, vol. 37, pp. 83-95.

50. Shetty A.K., Peek L.A. Peramivir for the treatment of influenza. Expert Rev. Anti Infect. Ther., 2012, vol. 10, pp. 123-143.

51. Shin Y.K., Li Y., Liu Q., Anderson D.H., Babiuk L.A., Zhou Y. Sh4 binding motif 1 in influenza A virus NS1 protein is essential for PI3K/Akt signaling pathway activation. J. Virol, 2007, vol. 81, pp. 12730-12739.

52. Shirey K.A., Lai W., Scott A.J., Lipsky M., Mistry P., Pletneva L.M., Karp C.L., McAlees J., Gioannini T.L., Weiss J., Chen W.H., Ernst R.K., Rossignol D.P., Gusovsky F., Blanco J.C., Vogel S.N. The TLR4 antagonist Eritoran protects mice from lethal influenza infection. Nature, 2013, vol. 497, no. 7450, pp. 498-502.

53. Smee D.F., Julander J.G., Tarbet E.B., Gross M., Nguyen J. Treatment of oseltamivir-resistant influenza A (h2N1) virus infections in mice with antiviral agents. Antiviral. Res., 2012, vol. 96, no. 1, pp. 13-20.

54. Smith D.B., Inglis S.C. The mutation rate and variability of eukaryotic viruses: an analytical review. J. Gen. Virol., 1987, vol. 68, pt 11, pp. 2729-2740.

55. Tazulakhova E.B., Parshina O.V., Guseva T.S., Ershov F.I. Russian experience in screening, analysis, and clinical application of novel interferon inducers. J. Interferon Cytokine Res., 2001, vol. 21, no. 2, pp. 65-73.

56. Tisoncik J.R., Korth M.J., Simmons C.P., Farrar J., Martin T.R., Katze M.G. Into the eye of the cytokine storm. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2012, vol. 76, no. 1, pp. 16-32

57. Utsunomiya T., Kobayashi M., Pollard R.B., Suzuki F. Glycyrrhizin, an active component of licorice roots, reduces morbidity and mortality of mice infected with lethal doses of influenza virus. Antimicrob. Agents Chemother., 1997, vol. 41, no. 3, pp. 551-556.

58. Vavricka C.J., Li Q., Wu Y., Qi J., Wang M., Liu Y., Gao F., Liu J., Feng E., He J., Wang J., Liu H., Jiang H., Gao G.F. Structural and functional analysis of laninamivir and its octanoate prodrug reveals group specific mechanisms for influenza NA inhibition. PLoS Pathog, 2011, vol. 7, e1002249.

59. Walsh K.B., Teijaro J.R., Wilker P.R., Jatzek A., Fremgen D.M., Das S.C., Watanabe T., Hatta M., Shinya K., Suresh M., Kawaoka Y., Rosen H., Oldstone M.B. Suppression of cytokine storm with a sphingosine analog provides protection against pathogenic influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, vol. 108, no. 29, pp. 12018-12023.

60. Warner T.D., Mitchell J.A. Cyclooxygenases: new forms, new inhibitors, and lessons from the clinic. FASEB J., 2004, vol. 18, pp. 790-804.

61. Wolkerstorfer A., Kurz H., Bachhofner N., Szolar O.H. Glycyrrhizin inhibits influenza A virus uptake into the cell. AntivirRes., 2009, vol. 83, pp. 171-178.

62. Zheng B.J., Chan K.W., Lin Y.P., Zhao G.Y., Chan C., Zhang H.J., Chen H.L., Wong S.S., Lau S.K., Woo P.C., Chan K.H., Jin D.Y., Yuen K.Y. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, vol. 105, no. 23, pp. 8091-8096.

63. Zhirnov O.P., Klenk H.D. Control of apoptosis in influenza virus-infected cells by up-regulation of Akt and p53 signaling. Apoptosis, 2007, vol. 12, pp. 1419-1432.

64. Zhou Z., Jiang X., Liu D., Fan Z., Hu X., Yan J., Wang M., Gao G.F. Autophagy is involved in influenza A virus replication. Autophagy, 2009, vol. 5, no. 3, pp. 321-328.

Received 11.11.2013 Accepted 12.11.2013

какие бывают, как распознать грипп по первым признакам и начать его лечить?


При гриппе и других ОРВИ, помимо симптоматических средств, могут применяться этиотропные противовирусные препараты. Некоторые из них обладают дополнительной иммуностимулирующей активностью.

Узнать подробнее…


АМИКСИН® — современный иммуностимулирущий препарат против различных вирусных инфекций, в том числе вирусов гриппа и ОРВИ.

Узнать подробнее…
Имеются противопоказания. Необходимо получить консультацию специалиста.


Для снижения риска заражения гриппом и другими ОРВИ АМИКСИН® достаточно принимать по одной таблетке 125 мг в неделю. Количество таблеток на курс: всего 6 штук.

Как принимать препарат?
Имеются противопоказания. Необходимо получить консультацию специалиста.


Противовирусные препараты с иммуномодулирующей активностью не только борются с вирусами гриппа и других ОРВИ, но и стимулируют активность иммунной системы человека.

Подробнее…



Прием противовирусного препарата АМИКСИН® возможен на любой стадии простуды и гриппа по рекомендации врача.

Как принимать препарат?
Имеются противопоказания. Необходимо получить консультацию специалиста.

Грипп распространен чрезвычайно широко. Это одно из наиболее часто встречающихся инфекционных заболеваний — 95% людей, обратившихся к врачам по поводу инфекций, страдают именно гриппом. В нашей стране гриппом ежегодно заражается от 27 до 41 миллиона человек, а всего в мире с этой болезнью каждый год сталкивается около 500 миллионов человек[1].

Поскольку шансы заразиться гриппом очень высоки, каждый должен знать, каковы типичные признаки гриппа, что можно делать для облегчения состояния, а что нельзя и какие медикаменты предлагает современная медицина для лечения гриппа.

Источники заболевания и эпидемиология

Эпидемии гриппа — явление цикличное, возвращающееся каждый год. Обычно начало приходится на сентябрь, а пик — на период с февраля по март[2]. Грипп передается от человека к человеку — и передается довольно легко. Основной способ передачи — воздушно-капельный, однако грипп передается также и бытовым путем. Для заражения достаточно 0,0001 мл носоглоточного секрета — это микроскопическая капелька, которую практически невозможно разглядеть. Кроме того, вирус гриппа очень живуч — он сохраняет свою вирулентность в течение долгих часов. Например, в воздухе вирус остается активным до 9 часов, на ткани — до 12 часов, а на пластике — до двух суток[3].

Интересный факт
Чаще всего гриппом болеют дети и подростки в возрасте 1–14 лет — на эту возрастную группу приходится 37% всех случаев гриппа[4].

Как отличить грипп от простуды?

Собственно, «простуда» — это не медицинский термин. Так в разговорной речи обозначают любое острое респираторное заболевание вирусной или бактериальной природы. Грипп вызывается вирусом, однако бактериальные ОРЗ тоже распространены, хотя и заметно меньше.

Отличить вирусное ОРЗ от бактериального бывает непросто. Точный ответ могут дать только результаты анализов. Впрочем, есть несколько внешних признаков, позволяющих заподозрить грипп.

При гриппе болезнь начинается очень резко — еще утром вы чувствовали себя хорошо, а после обеда понимаете, что серьезно больны. Температура поднимается до 38–39˚С. Почти всегда грипп сопровождается реакциями, похожими на аллергию, — глаза становятся красными, зудят и слезятся, появляются прозрачные выделения из носа. В самом начале заболевания обычно нет ни сильного насморка с обильными окрашенными выделениями, ни боли в горле, ни кашля.

При бактериальных ОРЗ болезнь развивается медленнее, температура нарастает постепенно и редко пересекает отметку в 38˚С. Для бактериальной инфекции очень характерны локальные поражения, такие как сильная боль в горле, насморк с зеленоватыми или желтоватыми выделениями, отиты, бронхиты и пр. Симптомы, похожие на аллергические, при бактериальных ОРЗ зачастую отсутствуют.

Бактериальная инфекция часто является следствием гриппа — организм, ослабленный вирусом, не может противостоять бактериям, что приводит к развитию бактериальных осложнений.

Что делать, если появились первые симптомы гриппа

Если вы подозреваете, что заразились гриппом, первое, что нужно сделать, — обратиться к врачу и сдать анализы. Только так можно определить, к какому типу относится инфекция, какие именно препараты помогут ее побороть, а также выяснить, нет ли бактериальных осложнений. Прием лекарств можно начинать только после постановки диагноза, однако нелекарственные методы нужно применять сразу же после того, как вы почувствуете недомогание.

Нелекарственные методы

Крайне важно взять больничный и обеспечить себе постельный режим. Человек, заболевший гриппом, очень заразен, и попытки перенести болезнь на ногах приведут к тому, что ваши коллеги и все, с кем придется контактировать, также заболеют. Вы же повысите свои шансы заполучить неприятное (возможно, даже опасное!) бактериальное осложнение гриппа, например, менингит или пневмонию.

При гриппе следует много пить — жар вызывает потливость, и, следовательно, большую потерю влаги. Вопреки расхожему мнению, очень горячие напитки противопоказаны — даже легкий ожог слизистых оболочек гортани сделает их более уязвимыми для бактериальных инфекций. Питье должно быть теплым и обильным. Отлично подойдут травяные чаи, морсы, некислые соки, компоты, кефир, обезжиренное молоко. Кофе пить нежелательно — оно усиливает сердцебиение и может ухудшить состояние. Выпивая не менее 2 литров жидкости в сутки, вы помогаете организму избавляться от токсинов, которые и вызывают значительную часть симптомов гриппа — слабость, сонливость, тошноту, головную боль.

Поддерживайте в комнате комфортную температуру и не забывайте регулярно открывать окна — это понижает концентрацию микробов в воздухе. Если на улице холодно, лучше положите дополнительное одеяло, но не отказывайтесь от проветривания.

Принимать душ при гриппе можно, если, конечно, после душа вы не собираетесь выходить на холодный воздух. Иногда при гриппе человек чувствует себя настолько плохо, что едва может дойти до ванной комнаты. В таком случае можно ограничиться обтиранием влажным полотенцем или гигиеническими салфетками. Так или иначе, пот с кожи желательно смывать.

Фармакотерапия

Все лекарства от гриппа можно разделить на две группы: те, которые борются с причиной болезни (этиотропные препараты), и те, которые не лечат само заболевание, но облегчают его проявления (симптоматические препараты).

Симптоматические средства. Эта группа медикаментов включает в себя:

  • Жаропонижающие. Для улучшения состояния при гриппе применяют нестероидные противовоспалительные средства. Они понижают температуру, а многие из этих средств оказывают и противовоспалительное воздействие. Самые известные жаропонижающие — ибупрофен, ацетилсалициловая кислота, парацетамол.
  • Капли от насморка. При заложенности носа врачи рекомендуют капать сосудосуживающие капли (например, ксилометозолин), они мгновенно снимают отек и позволяют вздохнуть свободно. Но с этими средствами следует обращаться осторожно и не применять их более 3–5 дней — иначе есть риск развития медикаментозного ринита, при котором отек слизистой оболочки носоглотки станет постоянным и вы уже не сможете обходиться без капель.
  • Антигистаминные препараты. Они позволяют снять такие симптомы гриппа, как покраснение глаз, отек носоглотки и прозрачные выделения из носа. В этом отношении эффективны тавегил, лоратадин и другие лекарства от аллергии.

Этиотропные препараты. Это средства, которые воздействуют на возбудителя болезни, то есть на вирусы или на бактерии.

  • Противовирусные средства. Грипп — вирусное заболевание, и потому для его лечения нужно применять именно лекарства, помогающие справиться с вирусом, — «Ремантадин», «Арбидол», «Осельтамивир» и другие подобные препараты. Таких препаратов множество, они воздействуют на вирус на разных стадиях его жизненного цикла, но все такие средства преследуют одну цель — не дать вирусу распространяться. Противовирусные препараты особенно эффективны в первые дни болезни, но совершенно бессмысленны в терапии бактериальных осложнений гриппа вроде пневмонии, бронхита или отита.
  • Антибиотики. Как уже было сказано, антибиотики не воздействуют на вирусы, они активны лишь в отношении бактерий. Но поскольку к вирусной инфекции при гриппе очень часто присоединяется бактериальная (особенно если грипп не лечили должным образом с самого начала), то при гриппе нередко назначают и антибактериальные средства. К таким относятся пенициллин, цефалоспорины и макролиды.
  • Иммуностимуляторы. Так называют препараты, укрепляющие защитные силы организма и помогающие иммунной системе самостоятельно отражать атаки вирусов и бактерий. Широко применяются препараты интерферона и индукторов интерферона — их можно использовать как для лечения, так и для профилактики гриппа во время эпидемий.

Профилактика

Самый надежный способ избежать заболевания — своевременно пройти вакцинацию. Современные вакцины эффективны и безопасны, но нужно помнить, что они не дают долгосрочного иммунитета, поэтому проходить вакцинацию следует ежегодно.

Во время эпидемий нужно соблюдать некоторые меры предосторожности. Старайтесь избегать скопления людей, а если это невозможно, носите одноразовые медицинские маски. Мойте руки как можно чаще, поскольку инфекция часто проникает в организм именно через них. Достаточно прикоснуться к поверхности, на которой находятся невидимые капельки жидкости с вирусом, а потом потереть глаза — и вы уже больны.

Проводите влажную уборку как можно чаще, желательно протирать пол, поверхности и дверные ручки антибактериальным раствором или моющим средством с антибактериальным эффектом. Это касается и рабочего места — мы не призываем вас самостоятельно убирать весь офис, но протирать спиртовыми салфетками стол, телефон и клавиатуру компьютера все же стоит.

Если вы часто болеете, имеет смысл принимать иммуномодуляторы. Стресс, переутомление, бессонница, строгие диеты, хронические заболевания в анамнезе — все эти факторы ослабляют нашу защиту, и во время эпидемий ей требуется помощь.

Лечить грипп необходимо — без своевременной правильной терапии очень велик риск развития осложнений, которые могут давать о себе знать долгие годы. А такие последствия гриппа, как менингит и пневмония, смертельно опасны, особенно для детей, подростков и пожилых людей.


Эволюция сезонных вирусов гриппа

  • 1

    Stöhr, K. Influenza — забота ВОЗ. Ланцетная инфекция. Дис. 2 , 517 (2002).

    PubMed Google ученый

  • 2

    Замбон М.С. Эпидемиология и патогенез гриппа. J. Antimicrob. Chemother. 44 , 3–9 (1999).

    CAS PubMed Google ученый

  • 3

    Рассел, К.A. et al. Улучшение оценки риска пандемического гриппа. eLife 3 , e03883 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 4

    Тонг, С. и др. Летучие мыши Нового Света являются носителями различных вирусов гриппа А. PLoS Pathog. 9 , e1003657 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 5

    Фрэнсис, Т.A. Новый тип вируса эпидемического гриппа. Наука 92 , 405–408 (1940).

    PubMed Google ученый

  • 6

    Биэр, Б., Бауэр, Б. и Швайгер, Б. Дифференциация линий вируса гриппа B Ямагата и Виктория с помощью ПЦР в реальном времени. J. Clin. Microbiol. 48 , 1425–1427 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 7

    Канеги, Ю.и другие. Эволюционная модель гена гемагглютинина вирусов гриппа B, выделенных в Японии: коциркулирующие линии в один и тот же эпидемический сезон. J. Virol. 64 , 2860–2865 (1990).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 8

    Chen, W. et al. Новый митохондриальный белок вируса гриппа А, который вызывает гибель клеток. Nat. Med. 7 , 1306–1312 (2001).

    CAS PubMed Google ученый

  • 9

    Джаггер, Б.W. et al. Перекрывающаяся кодирующая белок область в сегменте 3 вируса гриппа А модулирует ответ хозяина. Наука 337 , 199–204 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 10

    Cohen, M. et al. Грипп A проникает в слизь хозяина, расщепляя сиаловые кислоты нейраминидазой. Virol. J. 10 , 321 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 11

    Вестгест, К.B. et al. Полногеномный анализ реассортации и эволюции вирусов гриппа человека A (h4N2), циркулировавших между 1968 и 2011 годами. J. Virol. 88 , 2844–2857 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 12

    Smith, D. J. et al. Картирование антигенной и генетической эволюции вируса гриппа. Наука 305 , 371–376 (2004). Это плодотворное исследование, которое задокументировало непрерывную генетическую, но прерывистую антигенную эволюцию вирусов A / h4N2 и представило антигенную картографию — вычислительный инструмент для количественной оценки различий в антигенном фенотипе вирусов.

    CAS PubMed Google ученый

  • 13

    Westgeest, K. B. et al. Генетическая эволюция нейраминидазы вирусов гриппа A (h4N2) с 1968 по 2009 г. и ее соответствие эволюции гемагглютинина. J. Gen. Virol. 93 , 1996–2007 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 14

    Сандбулт, М.R. et al. Дискордантный антигенный дрейф нейраминидазы и гемагглютинина в вирусах гриппа h2N1 и h4N2. Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 20748–20753 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • 15

    Солк, Дж. Э. и Суриано П. С. Важность антигенного состава вакцины против вируса гриппа в защите от естественного заболевания. г. J. Publ. Здоровье Нат. Здравоохранение 39 , 345–355 (1949).

    CAS Google ученый

  • 16

    Килборн, Э. Д. и др. Возвращение к полному провалу вакцины против гриппа в 1947 году: серьезное внутриподтипическое антигенное изменение может объяснить неудачу вакцины в послевоенной эпидемии. Proc. Natl Acad. Sci. США 99 , 10748–10752 (2002).

    CAS PubMed Google ученый

  • 17

    Tricco, A.C. et al.Сравнение эффективности противогриппозной вакцины против несовместимых и совпадающих штаммов: систематический обзор и метаанализ. BMC Med. 11 , 153 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 18

    Linderman, S. L. et al. Возможное антигенное объяснение атипичных инфекций h2N1 среди взрослых среднего возраста в сезон гриппа 2013–2014 гг. Proc Natl Acad. Sci. США 111 , 15798–15803 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 19

    Коби С. и Хенсли С. Е. Иммунный анамнез и чувствительность к вирусу гриппа. Curr. Opin. Virol. 22 , 105–111 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 20

    Дилилло, Д. Дж., Палезе, П., Уилсон, П. С. и Раветч, Дж. В. Широко нейтрализующие антитела против гриппа требуют взаимодействия рецептора Fc для защиты in vivo . J. Clin. Инвестировать. 126 , 605–610 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 21

    Terajima, M. et al. Комплемент-зависимый лизис клеток, инфицированных вирусом гриппа А, человеческими моноклональными антителами с широкой перекрестной реакцией. J. Virol. 85 , 13463–13467 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 22

    Jegaskanda, S., Weinfurter, J.T., Friedrich, T.C. & Kent, S.J. Антителозависимая клеточная цитотоксичность связана с контролем пандемического инфицирования макак вирусом гриппа h2N1. J. Virol. 87 , 5512–5522 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 23

    Чен Р. и Холмс Э. С. Эволюционная динамика вируса гриппа B человека. J. Mol. Evol. 66 , 655–663 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 24

    Bedford, T. et al. Характер глобальной циркуляции вирусов сезонного гриппа зависит от антигенного дрейфа. Природа 523 , 217–220 (2015). Это первое подробное сравнение динамики глобальной циркуляции всех четырех вирусов сезонного гриппа, которое на сегодняшний день является наиболее полной характеристикой глобальной динамики вирусов сезонного гриппа.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 25

    Виджайкришна, Д. и др. Противоположная филодинамика вирусов гриппа человека B. eLife 4 , e05055 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 26

    Kucharski, A.J. et al. Оценка продолжительности жизни антител к гриппу A (h4N2) на основе поперечных данных. PLoS Biol. 13 , e1002082 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 27

    Fonville, J. M. et al. Пейзаж антител после заражения вирусом гриппа или вакцинации. Наука 346 , 996–1000 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 28

    Cheung, P.P.H. et al. Генерация и характеристика вирусов гриппа А с измененной верностью полимеразы. Nat. Commun. 5 , 4794 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 29

    Virelizier, J.-L. Защита хозяина от вируса гриппа: роль антител к гемагглютинину. J. Immunol. 115 , 434–439 (1975).

    CAS PubMed Google ученый

  • 30

    Bizebard, T. et al. Структура гемагглютинина вируса гриппа в комплексе с нейтрализующим антителом. Nature 376 , 92–94 (1995).

    CAS PubMed Google ученый

  • 31

    Margine, I. et al. Инфекция вируса гриппа h4N2 индуцирует у людей и мышей широкореактивные антитела к стеблю гемагглютинина. J. Virol. 87 , 4728–4737 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 32

    Муди, М.A. et al. Инфекция гриппа h4N2 вызывает более перекрестно-реактивные и менее клонально расширенные антитела к гемагглютинину, чем вакцинация против гриппа. PLoS ONE 6 , e25797 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 33

    Nachbagauer, R. et al. Возрастная зависимость и изотипическая специфичность антител, реагирующих на стебель гемагглютинина вируса гриппа, у человека. мБио 7 , e01996-15 (2016). Это подробный анализ того, насколько широко нейтрализующие грипп антитела накапливаются с возрастом, и их возможной роли в снижении частоты инфицирования гриппом среди пожилых людей.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 34

    Wiley, D. C., Wilson, I. A. & Skehel, J. J. Структурная идентификация сайтов связывания антител гемагглютинина гонконгского гриппа и их участие в антигенных вариациях. Nature 289 , 373–378 (1981).

    CAS PubMed Google ученый

  • 35

    Skehel, J. J. et al. Углеводная боковая цепь гемагглютининов вирусов гонконгского гриппа ингибирует распознавание моноклональным антителом. Proc. Natl Acad. Sci. США 81 , 1779–1783 (1984).

    CAS PubMed Google ученый

  • 36

    Герхард, В., Юделл, Дж., Франкель, М. Э. и Вебстер, Р. Антигенная структура гемагглютинина вируса гриппа, определяемая гибридомными антителами. Nature 290 , 713–717 (1981).

    CAS PubMed Google ученый

  • 37

    Koel, B. F. et al. Замены возле сайта связывания рецептора определяют основные антигенные изменения во время эволюции вируса гриппа. Наука 342 , 976–979 (2013). Это ключевая статья, показывающая, что большинство существенных антигенных изменений, определенных экспериментальными анализами с 1968 по — были связаны с аминокислотными заменами всего в семи положениях в белке НА.

    CAS PubMed Google ученый

  • 38

    Barr, I.G. et al. Рекомендации ВОЗ по вирусам, использованным в вакцине против гриппа для Северного полушария 2013–2014 гг .: эпидемиология, антигенные и генетические характеристики вирусов гриппа A (h2N1) pdm09, A (h4N2) и B, собранные с октября 2012 г. по январь 2013 г. Vaccine 32 , 4713–4725 (2014).

    PubMed Google ученый

  • 39

    Климов, А.I. et al. Рекомендации ВОЗ по вирусам, которые будут использоваться в вакцине против гриппа для Южного полушария 2012 г .: эпидемиология, антигенные и генетические характеристики вирусов гриппа A (h2N1) pdm09, A (h4N2) и B, собранные с февраля по сентябрь 2011 г. Vaccine 30 , 6461–6471 (2012).

    PubMed Google ученый

  • 40

    Koel, B. F. et al. Антигенная изменчивость вируса клады 2.1 H5N1 определяется несколькими аминокислотными заменами, непосредственно примыкающими к сайту связывания рецептора. мБио 5 , e01070-14 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 41

    Abente, E.J. et al. Молекулярные детерминанты распознавания антител и антигенный дрейф в гемагглютинине h4 вируса гриппа свиней А. J. Virol. 90 , 8266–8280 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 42

    Льюис, Н.S. et al. Глобальное антигенное разнообразие вирусов свиного гриппа А. eLife 5 , e12217 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 43

    Льюис, Н.С. и др. Антигенная и генетическая эволюция вируса гриппа лошадей A (h4N8) с 1968 по 2007 год. J. Virol. 85 , 12742–12749 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 44

    Дуд, М.Б., Хенсли, С. Э. и Блум, Дж. Д. Полное картирование ускользания вируса от нейтрализующих антител. PLoS Pathog. 13 , e1006271 (2017). Это исследование демонстрирует превосходное использование инструментов для глубокого мутационного сканирования с целью изучения генетических последствий отбора антител для вирусов.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 45

    Кирхенбаум Г. А., Картер Д. М. и Росс Т.M. Последовательное инфицирование хорьков антигенно отличными сезонными вирусами гриппа h2N1 усиливает антитела, специфичные для стеблей гемагглютинина. J. Virol. 90 , 1116–1128 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 46

    Nachbagauer, R. et al. Индукция широко реактивных антигемагглютининовых стеблевых антител вакциной H5N1 у людей. J. Virol. 88 , 13260–13268 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 47

    Okuno, Y., Isegawa, Y., Sasao, F. и Ueda, S. Обычный нейтрализующий эпитоп, законсервированный между гемагглютининами штаммов h2 и h3 вируса гриппа А. J. Virol. 67 , 2552–2558 (1993).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 48

    Чай Н. и др. Два механизма ускользания вируса гриппа А от широко нейтрализующего антитела, связывающегося со стеблем. PLoS Pathog. 12 , e1005702 (2016). Это исследование представляет собой важную функциональную демонстрацию способности вирусов гриппа ускользать от широко нейтрализующих антител за счет небольшого числа аминокислотных замен.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 49

    Шульман, Дж. Л., Хакпур, М. и Килборн, Э. Д. Защитные эффекты специфического иммунитета к вирусной нейраминидазе при инфицировании вирусом гриппа мышей. J. Virol. 2 , 778–786 (1968).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 50

    Мерфи Б. Р., Касел Дж. А. и Чанок Р. М. Ассоциация сывороточных антител против нейраминидазы с устойчивостью к гриппу у человека. N. Engl. J. Med. 286 , 1329–1332 (1972).

    CAS PubMed Google ученый

  • 51

    Эйхельбергер, М.C. & Wan, H. Нейраминидаза гриппа как антиген вакцины. Curr. Верхний. Microbiol. Иммунол. 386 , 275–299 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • 52

    Sultana, I. et al. Стабильность нейраминидазы в инактивированных вакцинах против гриппа. Вакцина 32 , 2225–2230 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 53

    Коелле, К., Коби, С., Гренфелл, Б. и Паскуаль, М. Эпохальная эволюция формирует филодинамику межпандемического гриппа A (h4N2) у людей. Наука 314 , 1898–1903 (2006).

    CAS PubMed Google ученый

  • 54

    Koelle, K. & Rasmussen, D. A. Влияние нагрузки вредоносных мутаций на паттерны антигенной эволюции гриппа A / h4N2 у людей. eLife 4 , e07361 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 55

    Зиндер Д., Бедфорд Т., Гупта С. и Паскуаль М. Роль конкуренции и мутации в формировании антигенного и генетического разнообразия при гриппе. PLoS Pathog. 9 , e1003104 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 56

    Реккер М., Пибус О.Г., Ни, С.И Гупта, С. Генерация вспышек гриппа сетью иммунных ответов хозяина против ограниченного набора антигенных типов. Proc. Natl Acad. Sci. США 104 , 7711–7716 (2007).

    CAS PubMed Google ученый

  • 57

    Мейер, А. Г. и Уилке, К. О. Геометрические ограничения доминируют в антигенной эволюции гемагглютинина h4N2 гриппа. PLoS Pathog. 11 , e1004940 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 58

    Бедфорд, Т., Рамбаут, А. и Паскуаль, М. Канализация эволюционной траектории вируса гриппа человека. BMC Biol. 10 , 38 (2012).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 59

    Гог, Дж. Р. Влияние эволюционных ограничений на динамику гриппа. Вакцина 26 , C15 – C24 (2008).

    PubMed Google ученый

  • 60

    Андреасен В. и Сасаки А. Формирование филогенетического древа гриппа с помощью перекрестного иммунитета. Теор. Popul. Биол. 70 , 164–173 (2006).

    PubMed Google ученый

  • 61

    Hensley, S.E. et al. Авидность связывания с рецептором гемагглютинина приводит к антигенному дрейфу вируса гриппа А. Наука 326 , 734–736 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 62

    Гонг, Л. И. и Блум, Дж. Д. Эпистатически взаимодействующие замены обогащаются в процессе эволюции адаптивного белка. PLoS Genet. 10 , e1004328 (2014). Исследование является ключевым примером того, как конкретный генетический контекст, в котором происходят мутации, может иметь существенное влияние на конечную пригодность вирусов.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 63

    Блум, Дж.Д., Гонг, Л. И. и Балтимор, Д. Разрешительные вторичные мутации делают возможной эволюцию устойчивости к осельтамивиру гриппа. Наука 328 , 1272–1275 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 64

    Леонард, А.С. и др. Глубокое секвенирование вируса гриппа А в ходе исследования с заражением человека выявляет селективное узкое место и лишь ограниченную генетическую диверсификацию внутри хозяина. Дж.Virol. 90 , 11247–11258 (2016).

    CAS Google ученый

  • 65

    Debbink, K. et al. Вакцинация оказывает минимальное влияние на разнообразие вирусов гриппа h4N2 внутри хозяев. PLoS Pathog. 13 , e1006194 (2017). Это исследование представляет интересный анализ образцов вируса человека, связывающий данные вируса внутри хозяина с вакцинационным статусом, и обнаруживает минимальную роль индуцированного вакциной иммунитета как источника давления эволюционного отбора.

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 66

    McCrone, J. T. et al. Эволюционная динамика вируса гриппа А внутри и между людьми-хозяевами. bioRxiv http://dx.doi.org/10.1101/176362 (2017).

  • 67

    Xue, K. S. et al. Параллельная эволюция гриппа в нескольких пространственно-временных масштабах. eLife 6 , e26875 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 68

    Парвин, Дж.Д., Москона, А., Пан, В. Т., Лейдер, Дж. М. и Палезе, П. Измерение частоты мутаций вирусов животных: вируса гриппа А и полиовируса типа 1. J. Virol. 59 , 377–383 (1986).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 69

    Нобусава, Э. и Сато, К. Сравнение частоты мутаций вирусов гриппа человека A и B. J. Virol. 80 , 3675–3678 (2006).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 70

    Блум, Дж. Д. Экспериментально определенная эволюционная модель значительно улучшает филогенетическое соответствие. Мол. Биол. Evol. 31 , 1956–1978 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 71

    Паули, М. Д., Прокарио, М. К. и Лауринг, А. С. Новый тест на флуктуацию двенадцати классов показывает более высокую, чем ожидалось, частоту мутаций для вирусов гриппа А. eLife 6 , e26437 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 72

    Сидоренко Ю. и Райхл У. Структурированная модель репликации вируса гриппа в клетках MDCK. Biotechnol. Bioeng. 88 , 1–14 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • 73

    Wu, N.-H. и другие. Дифференцированный эпителий дыхательных путей, инфицированный вирусами гриппа, сохраняет барьерную функцию, несмотря на резкую потерю реснитчатых клеток. Sci. Отчет 6 , 39668 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 74

    Guillot, L. et al. Участие toll-подобного рецептора 3 в иммунном ответе эпителиальных клеток легких на двухцепочечную РНК и вирус гриппа А. J. Biol. Chem. 280 , 5571–5580 (2005).

    CAS PubMed Google ученый

  • 75

    Алексопулу, Л., Holt, A.C., Medzhitov, R. & Flavell, R.A. Распознавание двухцепочечной РНК и активация NF-κB Toll-подобным рецептором 3. Nature 413 , 732–738 (2001).

    CAS PubMed Google ученый

  • 76

    Marois, I., Cloutier, A., Garneau, E. & Richter, M. V. Начальная инфекционная доза определяет врожденную, адаптивную реакцию и реакцию памяти на грипп в дыхательных путях. J. Leukoc. Биол. 92 , 107–121 (2012).

    CAS PubMed Google ученый

  • 77

    Le Goffic, R. et al. Белок вируса гриппа A PB1-F2 усиливает экспрессию IFN-β в клетках респираторного эпителия человека. J. Immunol. 185 , 4812–4823 (2010).

    CAS PubMed Google ученый

  • 78

    Le Goffic, R. et al. Транскриптомный анализ иммунного ответа хозяина и ответа клеточной смерти, связанных с белком PB1-F2 вируса гриппа А. PLoS Pathog. 7 , e1002202 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 79

    Эверит, А. Р. и др. IFITM3 ограничивает заболеваемость и смертность от гриппа. Природа 484 , 519–523 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 80

    Циммерманн, П., Манц, Б., Haller, O., Schwemmle, M. & Kochs, G. Вирусный нуклеопротеин определяет Mx-чувствительность вирусов гриппа А. J. Virol. 85 , 8133–8140 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 81

    Gnirss, K. et al. Чувствительность вирусов гриппа A к тетерину зависит от штамма: роль гемагглютинина и нейраминидазы. J. Virol. 89 , 9178–9188 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 82

    Эндрюс, С.F. et al. Иммунный анамнез в значительной степени влияет на защитные реакции В-клеток на грипп. Sci. Transl Med. 7 , 316ra192 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 83

    Slütter, B. et al. Динамика индуцированных гриппом резидентных Т-клеток памяти в легких лежит в основе ослабления гетероподтипического иммунитета. Sci. Иммунол. 2 , eaag2031 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 84

    Баккам, П., Beauchemin, C., Macken, C.A., Hayden, F.G. и Perelson, A.S. Кинетика инфицирования вирусом гриппа A у людей. J. Virol. 80 , 7590–7599 (2006).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 85

    Китфати Р. и др. Кинетика и продолжительность реакции антител на инфекцию вируса гриппа A H5N1 у людей. Clin. Вакцина Иммунол. 16 , 978–981 (2009).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 86

    Оксенбейн, А.F. et al. Защитная долговременная память антител за счет управляемой антигеном и зависимой от Т-помощи дифференцировки долгоживущих В-клеток памяти в короткоживущие плазматические клетки независимо от вторичных лимфоидных органов. Proc. Natl Acad. Sci. США 97 , 13263–13268 (2000).

    CAS PubMed Google ученый

  • 87

    Neuzil, K. M. et al. Иммуногенность и реактогенность 1 против 2 доз трехвалентной инактивированной противогриппозной вакцины у детей в возрасте 5–8 лет, не получавших вакцину. J. Infect. Дис. 194 , 1032–1039 (2006).

    CAS PubMed Google ученый

  • 88

    Ренегар, К. Б., Смолл, П. А., Бойкинс, Л. Г. и Райт, П. Ф. Роль IgA по сравнению с IgG в контроле вирусной инфекции гриппа в дыхательных путях мышей. J. Immunol. 173 , 1978–1986 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • 89

    Стокса, К.Р., Сотилл, Дж. Ф. и Тернер, М. В. Иммунное исключение — это функция IgA. Природа 255 , 745–746 (1975).

    CAS PubMed Google ученый

  • 90

    Нахбагауэр Р. и Краммер Ф. Универсальные вакцины против вируса гриппа и терапевтические антитела. Clin Microbiol. Заразить. 23 , 222–228 (2017).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 91

    Враммерт, Дж.и другие. Антитела с широкой перекрестной реакцией доминируют в ответе В-клеток человека против инфекции, вызванной пандемическим вирусом гриппа h2N1 2009 года. J. Exp. Med. 208 , 181–193 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 92

    Давенпорт, Ф. М., Хеннесси, А. В. и Фрэнсис, Т. Эпидемиологическое и иммунологическое значение возрастного распределения антител к антигенным вариантам вируса гриппа. Дж.Exp. Med. 98 , 641–656 (1953).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 93

    Давенпорт, Ф. М., Хеннесси, А. В., Стюарт-Харрис, К. Х. и Фрэнсис, Т. Эпидемиология гриппа; сравнительные серологические наблюдения в Англии и США. Ланцет 269 , 469–474 (1955).

    CAS PubMed Google ученый

  • 94

    Миллер, М.S. et al. Нейтрализующие антитела против ранее встречавшихся штаммов вируса гриппа со временем увеличиваются: продольный анализ. Sci Transl Med 5 , 198ra107 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 95

    Lessler, J. et al. Доказательства антигенного старшинства в ответах антител против гриппа A (h4N2) в южном Китае. PLoS Pathog. 8 , e1002802 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 96

    Давенпорт, Ф.М. и Хеннесси, А. В. Серологический обзор прошлых опытов с гриппом A; антительный ответ на моновалентную вакцину. J. Exp. Med. 104 , 85–97 (1956).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 97

    Hobson, D., Curry, R.L., Beare, A. S. и Ward-Gardner, A. Роль сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию, в защите от контрольной инфекции вирусами гриппа A2 и B. J. Hyg. 70 , 767–777 (1972).

    CAS PubMed Google ученый

  • 98

    Swayne, D. E. et al. Титр антител имеет положительную прогностическую ценность для защиты вакцины от заражения естественными антигенными вариантами высокопатогенных вирусов птичьего гриппа H5N1 из Индонезии. J. Virol. 89 , 3746–3762 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 99

    Фокс, А.и другие. Антитела, ингибирующие гемагглютинацию, и защита от сезонного и пандемического гриппа. J. Infect. 70 , 187–196 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 100

    Ohmit, S. E., Petrie, J. G., Cross, R. T., Johnson, E. & Monto, A. S. Титр антител, ингибирующих гемагглютинацию гриппа, как коррелят защиты, индуцированной вакциной. J. Infect. Дис. 204 , 1879–1885 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • 101

    Хенсли, С. Е. Проблемы выбора штаммов вакцины против сезонного гриппа для людей с различной историей до контакта. Curr. Opin. Virol. 8 , 85–89 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 102

    Frize, R. et al. Контактная передача вируса гриппа между хорьками создает более слабое место, чем воздушно-капельная передача, что способствует распространению устойчивости к противовирусным препаратам. Sci. Отчет 6 , 29793 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 103

    Varble, A. et al. Узкие места передачи вируса гриппа А определяются маршрутом заражения и хозяином-реципиентом. Cell Host Microbe 16 , 691–700 (2014). Это элегантный экспериментальный документ, показывающий, как путь передачи является важным фактором в размере узкого места вирусной популяции.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 104

    Moncla, L.H. et al. Избирательные узкие места формируют эволюционные пути, используемые млекопитающими во время адаптации вируса птичьего гриппа, подобного 1918 году. Cell Host Microbe 19 , 169–180 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 105

    Пун, Л.L. M. et al. Количественная оценка разнообразия и передачи вируса гриппа у людей. Nat. Genet. 48 , 195–200 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 106

    Тамериус, Дж. Д. и др. Экологические предикторы сезонных эпидемий гриппа в умеренном и тропическом климате. PLoS Pathog. 9 , e1003194 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 107

    Вибоуд, К., Алонсо, В. Дж. И Симонсен, Л. Грипп в тропических регионах. PLoS Med. 3 , e89 (2006).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 108

    Hirve, S. et al. Сезонность гриппа в тропиках и субтропиках — когда проводить вакцинацию? PLoS ONE 11 , e0153003 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 109

    Лоуэн, А.C., Mubareka, S., Steel, J. & Palese, P. Передача вируса гриппа зависит от относительной влажности и температуры. PLoS Pathog. 3 , e151 (2007).

    PubMed Central Google ученый

  • 110

    Дейл, Э. Р., Махер, М. К., Эрнандес, Р. Д., Басу, С. и Сугихара, Г. Глобальные экологические факторы гриппа. Proc. Natl Acad. Sci. США 113 , 13081–13086 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 111

    Шаман Дж.И Кон, М. Абсолютная влажность влияет на выживаемость, передачу и сезонность гриппа. Proc. Natl Acad. Sci. США 106 , 3243–3248 (2009).

    CAS PubMed Google ученый

  • 112

    Young, L.C. et al. Летняя вспышка респираторного заболевания в австралийской тюрьме, вызванного вирусом, похожим на грипп A / Fujian / 411/2002 (h4N2). Epidemiol. Заразить. 133 , 107–112 (2005).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 113

    Финни, Т.Дж. Р., Копли, В. Р., Холл, И. М. и Лич, С. Анализ вспышек гриппа в учреждениях и закрытых обществах. Epidemiol. Заразить. 142 , 107–113 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 114

    Гайя, Дж., Деннетьер, Г., Раффин-Брю, Э., Валетт, М. и Блан, М. С. Летняя вспышка гриппа в доме престарелых: применение профилактических мер. J. Hosp. Заразить. 70 , 272–277 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 115

    Cauchemez, S., Valleron, A.-J., Boëlle, P.-Y., Flahault, A. & Ferguson, N.M. Оценка воздействия закрытия школ на передачу гриппа по данным Sentinel. Природа 452 , 750–754 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 116

    Dopico, X.C. et al. Широко распространенная сезонная экспрессия генов показывает ежегодные различия в иммунитете и физиологии человека. Nat. Commun. 6 , 7000 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 117

    Хирш А. и Крейтон К. Справочник по географической и исторической патологии . (Лондон: Новое общество Сиденхэма, 1883 г.).

    Google ученый

  • 118

    Хоуп-Симпсон, Р. Э. Роль сезона в эпидемиологии гриппа. J. Hyg. 86 , 35–47 (1981).

    CAS PubMed Google ученый

  • 119

    Шортридж, К. Ф., Пейрис, Дж. С. М. и Гуан, Ю. Следующая пандемия гриппа: уроки Гонконга. J. Appl. Microbiol. 94 (Дополнение), 70S – 79S (2003).

    PubMed Google ученый

  • 120

    Нельсон, М. И., Симонсен, Л., Вибуд, К., Миллер, М. А. и Холмс, Э. С. Филогенетический анализ показывает глобальную миграцию вирусов сезонного гриппа А. PLoS Pathog. 3 , e131 (2007).

    PubMed Central Google ученый

  • 121

    Russell, C.A. et al. Глобальная циркуляция вирусов сезонного гриппа A (h4N2). Наука 320 , 340–346 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 122

    Рамбаут, А.и другие. Геномная и эпидемиологическая динамика вируса гриппа человека А. Природа 453 , 615–619 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 123

    Чан, Дж., Холмс, А. и Рабадан, Р. Сетевой анализ глобального распространения гриппа. PLoS Comput. Биол. 6 , e1001005 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 124

    Лемей, П.и другие. Объединение данных о вирусной генетике и транспортировке людей для прогнозирования глобальной динамики передачи человеческого гриппа h4N2. PLoS Pathog. 10 , e1003932 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 125

    Билеек, Ф., Лемей, П., Бале, Г., Рамбаут, А. и Сушард, М. А. Вывод гетерогенных эволюционных процессов во времени: от замены последовательности до филогеографии. Syst.Биол. 63 , 493–504 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 126

    Бедфорд, Т., Коби, С., Берли, П. и Паскуаль, М. Динамика глобальной миграции лежит в основе эволюции и сохранения человеческого гриппа A (h4N2). PLoS Pathog. 6 , e1000918 (2010).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 127

    Бедфорд, Т.и другие. Интеграция антигенной динамики гриппа с молекулярной эволюцией. eLife 3 , e01914 (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 128

    Фергюсон, Н. М., Гальвани, А. П. и Буш, Р. М. Экологические и иммунологические детерминанты эволюции гриппа. Nature 422 , 428–433 (2003).

    CAS PubMed Google ученый

  • 129

    Партридж, Дж.И Киени, М. П. Глобальные производственные мощности вакцины против сезонного гриппа в 2011 г. Вакцина 31 , 728–731 (2013).

    PubMed Google ученый

  • 130

    Flannery, B. et al. Расширенная генетическая характеристика вирусов гриппа A (h4N2) и эффективность вакцины по генетическим группам, 2014–2015 гг. J. Infect. Дис. 214 , 1010–1019 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 131

    Сковронски, Д.M. et al. Идеальный шторм: влияние геномных вариаций и серийной вакцинации на низкую эффективность вакцины против гриппа в сезоне 2014–2015 гг. Clin. Заразить. Дис. 63 , 21–32 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 132

    Авторская группа ВОЗ и соавт. Улучшение выбора вируса для вакцины против гриппа: отчет неофициальной консультации ВОЗ, проведенной в штаб-квартире ВОЗ, Женева, Швейцария, 14–16 июня 2010 г. Influenza Other Respir. Вирусы 6 , 142–152 (2012).

  • 133

    de Jong, JC, Beyer, WEP, Palache, AM, Rimmelzwaan, GF & Osterhaus, ADME Несоответствие между вакциной против гриппа 1997/1998 г. и штаммом вируса A (h4N2) основной эпидемии как причина неадекватной вакцины -индуцированный антительный ответ на этот штамм у пожилых людей. J. Med. Virol. 61 , 94–99 (2000).

    CAS PubMed Google ученый

  • 134

    Сковронски, Д.M. et al. Низкая эффективность вакцины против гриппа 2012–2013 гг. Связана с мутацией в адаптированном к яйцам вакцинным штаммом h4N2, а не с дрейфом антигена в циркулирующих вирусах. PLoS ONE 9 , e (2014).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 135

    Wong, S.-S. И Уэбби, Р. Дж. Традиционные и новые вакцины против гриппа. Clin. Microbiol. Ред. 26 , 476–492 (2013). Это превосходный обзор процессов, проблем и будущих направлений производства вакцины против вируса гриппа.

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 136

    Краммер Ф. и Палезе П. Достижения в разработке вакцин против вируса гриппа. Nat. Rev. Drug Discov. 14 , 167–182 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • 137

    Brand, C. & Palese, P. Последовательный пассаж вируса гриппа в яйцах с зародышами или культуре ткани: появление мутантов. Вирусология 107 , 424–433 (1980).

    CAS PubMed Google ученый

  • 138

    McWhite, C.D., Meyer, A.G. и Wilke, C.O. Амплификация последовательности посредством клеточного пассирования создает ложные сигналы положительной адаптации в гемагглютинине h4N2 вируса гриппа. Virus Evol. 2 , vew026 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 139

    Лукша, М.И Лэссиг, М. Прогностическая фитнес-модель для гриппа. Природа 507 , 57–61 (2014).

    PubMed Google ученый

  • 140

    Нехер Р. А., Рассел К. А. и Шрайман Б. И. Прогнозирование эволюции по форме генеалогических деревьев. eLife 3 , e03568 (2014).

    PubMed Central Google ученый

  • 141

    Нехер, Р.А., Бедфорд, Т., Дэниелс, Р. С., Рассел, К. А. и Шрейман, Б. И. Прогнозирование, динамика и визуализация антигенных фенотипов вирусов сезонного гриппа. Proc. Natl Acad. Sci. США 113 , E1701 – E1709 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 142

    Нехер, Р. А. и Бедфорд, Т. nextflu: отслеживание в реальном времени эволюции сезонного вируса гриппа у людей. Биоинформатика 31 , 3546–3548 (2015).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 143

    Nolan, T. et al. Безопасность и иммуногенность прототипа адъювантной инактивированной вакцины против сплит-вируса гриппа A (H5N1) для младенцев и детей. Vaccine 26 , 6383–6391 (2008).

    CAS PubMed Google ученый

  • 144

    Van Damme, P. et al. Долгосрочное сохранение гуморальных и клеточных иммунных ответов, вызванных гриппозной вакциной h2N1 2009 с адъювантом AS03A: открытое рандомизированное исследование среди взрослых в возрасте 18–60 лет и старше. Hum. Вакцин. Immunother. 9 , 1512–1522 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 145

    Эндрюс, Н. Дж. И др. Предикторы иммунного ответа и реактогенности на вакцины против пандемического гриппа h2N1 с адъювантом AS03B и расщепленным вирионом. Vaccine 29 , 7913–7919 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • 146

    Huijskens, E.и другие. Иммуногенность, возможность повышения и устойчивость иммунного ответа после вакцинации против вируса гриппа A (h2N1) 2009 у здорового населения. Clin. Вакцина Иммунол. 18 , 1401–1405 (2011).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 147

    Смит Д. Дж., Форрест С., Экли Д. Х. и Перельсон А. С. Различная эффективность повторной ежегодной вакцинации против гриппа. Proc.Natl Acad. Sci. США 96 , 14001–14006 (1999).

    CAS PubMed Google ученый

  • 148

    Skowronski, D. M. et al. Серийная вакцинация и гипотеза антигенной дистанции: влияние на эффективность вакцины против гриппа во время эпидемии A (h4N2) в Канаде, с 2010–2011 по 2014–2015 годы. J. Infect. Дис. 215 , 1059–1099 (2017).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 149

    Корти, Д.и другие. Нейтрализующее антитело, выбранное из плазматических клеток, которое связывается с гемагглютининами гриппа A группы 1 и группы 2. Наука 333 , 850–856 (2011).

    CAS PubMed Google ученый

  • 150

    Tumpey, T. M., Renshaw, M., Clements, J. D. и Katz, J. M. Доставка инактивированной противогриппозной вакцины через слизистые оболочки индуцирует B-клеточно-зависимую гетероподтипную перекрестную защиту против летальной инфекции вируса гриппа A H5N1. J. Virol. 75 , 5141–5150 (2001).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 151

    Hoft, D. F. et al. Сравнение гуморальных и клеточных иммунных ответов, вызванных живой аттенуированной противогриппозной вакциной (LAIV) и инактивированной противогриппозной вакциной (IIV) у взрослых. Clin. Вакцина Иммунол. 24 , e00414-16 (2016).

    Google ученый

  • 152

    Ли, К.и другие. Селекция антигенно продвинутых вариантов вирусов сезонного гриппа. Nat. Microbiol. 1 , 16058 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 153

    Leroux-Roels, I. et al. Антигенсберегающий и перекрестно-реактивный иммунитет с прототипом вакцины против пандемического гриппа rH5N1 с адъювантом: рандомизированное контролируемое исследование. Lancet Lond. Англ. 370 , 580–589 (2007).

    CAS Google ученый

  • 154

    Хурана, С. и др. Вакцины с адъювантом MF59 расширяют репертуар антител на целевые защитные участки вируса пандемического птичьего гриппа H5N1. Sci. Пер. Med. 2 , 15ра5 (2010).

    PubMed Google ученый

  • 155

    Lee, J. et al. Анализ на молекулярном уровне репертуара сывороточных антител у молодых людей до и после вакцинации против сезонного гриппа. Nat. Med. 22 , 1456–1464 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 156

    Jiang, N. et al. Линейная структура репертуара человеческих антител в ответ на вакцинацию против гриппа. Sci. Пер. Med. 5 , 171ра19 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 157

    Накая, Х.I. et al. Системная биология иммунитета к вакцинам с адъювантом MF59 и неадъювантным трехвалентным вакцинам против сезонного гриппа в раннем детстве. Proc. Natl Acad. Sci. США 113 , 1853–1858 (2016).

    CAS PubMed Google ученый

  • 158

    Wang, C. et al. Репертуар B-клеток на вакцинацию против ветряной оспы у однояйцевых близнецов. Proc. Natl Acad. Sci. США 112 , 500–505 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • 159

    Бойд, С. Д. и Джексон, К. Дж. Л. Прогнозирование чувствительности к вакцинам. Cell Host Microbe 17 , 301–307 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • 160

    Монто, А. С. и Маассаб, Х. Ф. Обработка эфиром антигена вируса гриппа типа B для теста ингибирования гемагглютинации. Дж.Clin. Microbiol. 13 , 54–57 (1981).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 161

    Мостерин Хеппинг, А., Фонвилл, Дж. М., Рассел, К. А., Джеймс, С. и Смит, Д. Дж. Выбор линии вакцины против гриппа B — оптимизированная трехвалентная вакцина. Вакцина 34 , 1617–1622 (2016).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 162

    Хейккинен, Т., Иконен, Н. и Зиглер, Т. Влияние несоответствия на уровне линии гриппа B между трехвалентными вакцинами против сезонного гриппа и циркулирующими вирусами, 1999–2012 гг. Clin. Заразить. Дис. 59 , 1519–1524 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 163

    Сайто Т. и др. Антигенное изменение вируса гриппа B, связанное с потерей сайта гликозилирования из-за адаптации клетки-хозяина. J. Med. Virol. 74 , 336–343 (2004).

    CAS PubMed Google ученый

  • 164

    ВОЗ. FluNet. ВОЗ http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/flunet/en/ (2017).

  • 165

    Rogers, M. B. et al. Внутрихозяйственная динамика устойчивости к противовирусным препаратам у вируса гриппа А отражает сложные паттерны сцепления сегментов, перегруппировки и естественного отбора. мБио 6 , e02464-14 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 166

    Рассел, К.A. et al. Возможность эволюции вируса гриппа A / H5N1, передаваемого через дыхательные пути, в организме млекопитающего-хозяина. Наука 336 , 1541–1547 (2012).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 167

    Österlund, P. et al. Поступающий вирус гриппа А ускользает от раннего распознавания хозяином, в то время как вирус гриппа В индуцирует экспрессию интерферона непосредственно при попадании. J. Virol. 86 , 11183–11193 (2012).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 168

    Crotta, S. et al. Интерфероны типа I и типа III управляют избыточными петлями амплификации для индукции транскрипционной сигнатуры в инфицированном гриппом эпителии дыхательных путей. PLoS Pathog. 9 , e1003773 (2013).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 169

    Miao, H. et al. Количественная оценка раннего иммунного ответа и кинетики адаптивного иммунного ответа у мышей, инфицированных вирусом гриппа А. J. Virol. 84 , 6687–6698 (2010).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 170

    Тас, Дж. М. Дж. И др. Визуализация созревания аффинности антител в зародышевых центрах. Наука 351 , 1048–1054 (2016).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 171

    Чой, Ю. С. и Баумгарт, Н.Двойная роль клеток B-1a в иммунитете к инфекции вируса гриппа. J. Exp. Med. 205 , 3053–3064 (2008).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 172

    Deenick, E. K. et al. Наивные В-клетки человека и В-клетки памяти имеют разные потребности в активации STAT3, чтобы дифференцироваться в секретирующие антитела плазматические клетки. J. Exp. Med. 210 , 2739–2753 (2013).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 173

    Тиноко, Дж.C. et al. Иммуногенность, реактогенность и безопасность инактивированной четырехвалентной вакцины против гриппа по сравнению с инактивированной трехвалентной вакциной от гриппа у здоровых взрослых в возрасте ≥18 лет: рандомизированное исследование III фазы. Вакцина 32 , 1480–1487 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • 174

    Гердил К. Годовой цикл производства противогриппозной вакцины. Vaccine 21 , 1776–1779 (2003).

    PubMed Google ученый

  • 175

    Cox, R.J. et al. Фаза I клинических испытаний PER. C6 ® вакцина против вируса гриппа H7, выращенная на клетках. Вакцина 27 , 1889–1897 (2009).

    CAS PubMed Google ученый

  • 176

    Кистнер О. и др. Разработка вакцины-кандидата от вируса гриппа, полученной из клеток млекопитающих (Vero). Вакцина 16 , 960–968 (1998).

    CAS PubMed Google ученый

  • 177

    Дормитцер П. Р. Быстрое производство синтетических противогриппозных вакцин. Curr. Верхний. Microbiol. Иммунол. 386 , 237–273 (2015).

    CAS PubMed Google ученый

  • 178

    Кокс, М. М. Дж. Рекомбинантные белковые вакцины, полученные в клетках насекомых. Вакцина 30 , 1759–1766 (2012).

    CAS PubMed Google ученый

  • 179

    Кокс, М. М. Дж., Патриарка, П. А. и Треанор, Дж. ФлуБлок, рекомбинантная вакцина против гриппа с гемагглютинином. Influenza Other Respir. Вирусы 2 , 211–219 (2008).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 180

    Александрова Г.И. и др. Изучение живой рекомбинантной бивалентной вакцины против гриппа типа А, адаптированной к холоду, для использования у детей: эпидемиологическое контрольное испытание. Vaccine 4 , 114–118 (1986).

    CAS PubMed Google ученый

  • 181

    Руденко Л., Исакова-Сивак И. и Донина С. Живая аттенуированная вакцина против гриппа H7N3 обладает потенциалом защиты от нового вируса птичьего гриппа H7N9. Вакцина 31 , 4702–4705 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 182

    Рамезанпур, Б., Пронкер, Э. С., Крейц, Дж. Х. С. М., Остерхаус, А. Д. М. Э. и Клаассен, Э. Рыночная реализация платформы MVA для препандемических и пандемических вакцин против гриппа: количественный анализ ключевых мнений. Vaccine 33 , 4349–4358 (2015).

    PubMed PubMed Central Google ученый

  • 183

    Альтенбург, А. Ф. и др. Модифицированный вирус осповакцины анкара (MVA) в качестве платформы для производства вакцин против гриппа и других респираторных вирусных заболеваний. Вирусы 6 , 2735–2761 (2014).

    CAS PubMed PubMed Central Google ученый

  • 184

    Фрис, Л. Ф., Смит, Г. Э. и Гленн, Г. М. А. Рекомбинантная вирусоподобная вакцина против гриппа A (H7N9) с частицами. N. Engl. J. Med. 369 , 2564–2566 (2013).

    CAS PubMed Google ученый

  • 185

    Fiers, W. et al.Универсальная вакцина против гриппа на основе M2e. Vaccine 27 , 6280–6283 (2009).

    CAS PubMed Google ученый

  • 186

    Маллайосюла, В. В. А. и др. Иммуноген стеблевого фрагмента гемагглютинина гриппа вырабатывает широко нейтрализующие антитела и обеспечивает гетерологичную защиту. Proc. Natl Acad. Sci. США 111 , E2514 – E2523 (2014).

    CAS PubMed Google ученый

  • Выявление отбора при развитии гриппа внутри хозяина с использованием данных вирусных последовательностей

    Abstract

    Эволюция гриппа внутри хозяина является жизненно важным компонентом его эпидемиологии.Особый интерес вызывает вопрос о том, какую роль играет отбор в формировании вирусной популяции в течение одной инфекции. Здесь мы описываем метод измерения отбора, действующего на вирус гриппа в пределах отдельного хозяина, на основе данных последовательности генома с временным разрешением от инфекции. Анализируя данные о последовательности из исследования передачи, проведенного на свиньях, описывающих часть гена гемагглютинина (HA1) вируса гриппа, мы обнаруживаем признаки ненейтральности в шести из шестнадцати инфекций.Мы находим доказательства как положительного, так и отрицательного отбора, действующего на определенные аллели, в то время как в трех случаях данные свидетельствуют о наличии зависящего от времени отбора. При одной инфекции мы наблюдаем, что потенциально является специфическим иммунным ответом против вируса; обнаружено, что несинонимичная мутация в эпитопной области вируса находится в условиях сначала положительного, а затем резко отрицательного отбора. Что особенно важно, учитывая отсутствие гомологичной рекомбинации при гриппе, наш метод учитывает неравновесие по сцеплению между нуклеотидами в разных положениях в гене гемагглютинина, что позволяет анализировать популяции, в которых в любой момент времени присутствуют множественные мутации.Наш подход предлагает новое понимание динамики инфекции гриппа, обеспечивая подробную характеристику сил, лежащих в основе вирусной эволюции.

    Сведения об авторе

    Эволюция вируса гриппа имеет большое значение для здоровья человека. В процессе эволюции современные вирусы гриппа развивают способность заражать людей, вакцинированных против более ранних штаммов. Новые штаммы гриппа, поражающие птиц и свиней, могут эволюционировать, чтобы инфицировать и распространяться между людьми, вызывая глобальную пандемию.Вирус гриппа обитает в организме человека или животного-хозяина, поэтому вирусная эволюция происходит внутри отдельных людей или распространяется между ними. Поэтому вопрос о том, что происходит с вирусом во время заражения, вызывает большой интерес. Здесь мы описываем статистический метод, который использует данные последовательности вирусного генома для измерения того, как эволюция влияет на вирус гриппа в пределах одного хозяина. Изучая данные об инфекциях, передаваемых между свиньями, мы находим доказательства эволюционной адаптации у шести из шестнадцати животных, по которым были доступны данные.В одном случае очевиден иммунный ответ свиньи против вируса. Наш метод обеспечивает статистическую основу для использования данных о последовательностях для изучения эволюции вирусов в очень короткие сроки, что позволяет проводить новые исследования эволюции вирусов внутри хозяина.

    Образец цитирования: Иллингворт CJR, Фишер А., Мустонен В. (2014) Идентификация отбора в эволюции гриппа внутри хозяина с использованием данных вирусных последовательностей. PLoS Comput Biol 10 (7): e1003755. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1003755

    Редактор: Клаус О. Уилке, Техасский университет в Остине, Соединенные Штаты Америки

    Поступила: 9 декабря 2013 г .; Принята к печати: 13 июня 2014 г .; Опубликовано: 31 июля 2014 г.

    Авторские права: © 2014 Illingworth et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: CJRI был поддержан стипендией сэра Генри Дейла, совместно финансируемой Wellcome Trust и Королевским обществом (номер гранта 101239 / Z / 13 / Z). AF поддерживается Немецким исследовательским фондом (DFG) под номером гранта FI 1882 / 1-1. Мы также хотели бы поблагодарить Wellcome Trust за поддержку в соответствии с номером гранта 098051. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Общий риск для здоровья человека, связанный с новым вирусом гриппа H7N9 [1], хотя и потенциально серьезен, пока неизвестен [2], [3]. Пандемический грипп — это зооноз [4], и поэтому можно ожидать, что любая новая пандемия возникнет в результате двухэтапного процесса [5], [6], при этом вирус сначала приобретает способность вызывать спорадические локализованные инфекции у людей до тех пор, пока после второго перехода перерастает в глобальную пандемию. Каждый из этих этапов носит эволюционный характер и характеризуется, в свою очередь, адаптацией вируса к заражению человека-хозяина и развитием повышенной трансмиссивности между хозяевами.В штамме nH7N9 первый из этих шагов уже произошел, включая приобретение мутаций, ответственных за связывание специфических рецепторов человека [7]. Таким образом, развитие глобальной эпидемии зависит от эволюции увеличения трансмиссивности вируса, фенотипического изменения, которое может происходить только во время роста вируса в среде хозяина. Как и в случае с другими вирусными видами [8], понимание эволюции гриппа внутри хозяина является важной задачей.

    Широкий спектр подходов к математическому моделированию был направлен на вопросы инфекции, передачи и эволюции гриппа [9].Особое значение для данного исследования имеют модели, отслеживающие динамику отдельной инфекции. Основываясь на наблюдаемых изменениях вирусного титра с течением времени, были сделаны выводы о многих важных свойствах инфекции, включая репродуктивное число для клеточной инфекции, временные рамки и количество вирусов, продуцируемых во время инфицирования клетки, а также влияние на вирусную популяцию. как врожденного, так и адаптивного иммунных ответов [10] — [14]. Учитывая данные об уровнях внутриклеточной РНК, были описаны тонкие детали репликации вируса в клетке [15].Эволюционные модели конкуренции между вирусными штаммами прояснили взаимосвязь между отбором по росту и эффектами передачи, а также динамикой иммунного ускользания [16] — [18].

    В приведенных выше случаях вирусная популяция моделировалась либо как популяция идентичных людей, либо как набор отдельных классов вирусов, характеризующихся различными свойствами иммунного ускользания или передачи. Основываясь на этих подходах, для моделирования эволюции гриппа H5N1 была использована генетическая классификация вирусов [19]; Пригодность вируса определялась по наличию или отсутствию набора мутаций.Здесь мы делим вирусную популяцию аналогичным образом, выражая приспособленность вируса как функцию его генетического состава. Однако вместо того, чтобы анализировать последствия предлагаемого ландшафта приспособленности, мы делаем вывод о том, как на самом деле действовал отбор, основываясь на наблюдаемых данных генетической последовательности.

    При хронических инфекциях, таких как ВИЧ, легко доступны данные о последовательностях с временным разрешением от отдельных хозяев [20]. Однако течение инфекции гриппа даже у хозяина с ослабленным иммунитетом [21] относительно короткое.Таким образом, генетические данные с временным разрешением редки, основные примеры были собраны из экспериментально инфицированных популяций животных [22], [23]. В этой работе мы рассматриваем данные одного такого исследования, посвященного изучению эволюции гриппа h2N1 у людей в популяции свиней [24], [25].

    Основной принцип нашего метода — изучить роль отбора, действующего на вирусную популяцию, с помощью метода максимального правдоподобия. Мы принимаем крупнозернистую модель квазивидов (см. [26]) для описания эволюции вирусной популяции, в которой вирусы классифицируются в соответствии с нуклеотидами (здесь обозначены аллелями), присутствующими в ограниченном количестве позиций (или локусов) в их геномная последовательность.В этой модели эволюция протекает детерминированно, в зависимости только от начального состояния популяции и роли отбора за или против определенных аллелей. Рассматривая последствия для динамики популяции различных предложенных моделей отбора и сравнивая их с наблюдаемой эволюцией системы, мы оцениваем, как отбор работал.

    Низкая скорость рекомбинации в сегментах РНК вируса гриппа [27], [28] в сочетании с высокой частотой вирусных мутаций приводит к сложной эволюционной динамике, причем судьба мутаций сильно зависит от генетического автостопа и клональной интерференции [29]. — [31].Таким образом, различение эффектов отбора требует учета взаимодействий между аллелями в разных локусах [32]. Здесь это достигается путем рассмотрения частот гаплотипов, наборов последовательностей с конкретными аллелями в определенных локусах (например, аллель C в локусе i и аллель T в локусе j ).

    В нашей модели вирусная популяция может быть описана с потенциально любым геномным разрешением, отслеживая популяцию с точки зрения гаплотий, охватывающих произвольное количество локусов.Однако модели с более высоким локусом требуют больше вычислений. Таким образом, мы сначала применяем процесс фильтрации, чтобы вырезать локусы, в которых аллели не показывают статистических свидетельств эволюции в результате отбора. Для каждого полиморфного локуса мы используем модель эволюции с одним локусом, чтобы найти аллели, которые, по-видимому, эволюционируют с ненейтральным поведением, меняя частоту с течением времени. Изменение частоты аллеля может происходить как прямой результат отбора или из-за неравновесия по сцеплению с выбранным аллелем или аллелями в других локусах.Таким образом, чтобы различать эти случаи, когда очевидная ненейтральность наблюдается более чем в одном локусе, мы применяем к данным мультилокусную модель изменения частоты гаплотипов. Эта модель явно учитывает взаимодействия между аллелями в разных локусах и используется для определения максимального правдоподобия объяснения изменений, наблюдаемых в данных последовательности.

    Как уже отмечалось в другом месте, использование данных вирусных последовательностей для понимания популяционных структур требует серьезной осторожности (например,грамм. [33], [34]). Селективная амплификация последовательностей или общая систематическая ошибка при секвенировании может создать неверную картину популяции в целом. Рекомбинация, индуцированная ПЦР, может привести к ложным измерениям неравновесия по сцеплению между аллелями в разных локусах. Мы обсуждаем возможное влияние каждого из этих факторов на наши результаты.

    Результаты

    Были проанализированы данные о вирусных последовательностях, собранные в предыдущем эксперименте по передаче [25]. Обзор структуры этого эксперимента показан на рисунке 1.Цепь инфекции была распространена путем содержания пар неинфицированных свиней с парами инфицированных свиней, причем ранее инфицированные свиньи удалялись после того, как произошла передача. На протяжении всего эксперимента у свиней собирали образцы с помощью мазков из носа, при этом вирусные последовательности амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР и секвенировали по Сэнгеру. Вирусные последовательности были собраны у большинства свиней; для 16 из 24 свиней, участвовавших в эксперименте, данные были собраны в более чем один момент времени, что является важным предварительным условием для нашего метода.Для образцов, собранных у этих животных, глубина секвенирования варьировалась от 6 до 81 последовательности (в среднем 51) от свиньи в заданный момент времени, при этом данные собирались до пяти временных точек в течение инфекции. Между отдельными инфекциями наблюдалась ограниченная передача вариантов.

    Рис. 1. Доказательства отбора были обнаружены у вирусов от шести животных в двух экспериментах.

    Каждая свинья представлена ​​кружком, пронумерованным индексом. Стрелки между свиньями обозначают потенциальные случаи передачи.Свиньи, вакцинированные до заражения, обведены красным; невакцинированные свиньи обведены черным контуром. Подчеркнуто количество свиней, по которым данные о вирусной популяции были доступны для более чем одной временной точки. Свиньи, у которых был произведен отбор, выделены оранжевым цветом.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g001

    В нашем анализе ненейтральное поведение было выявлено в шести популяциях. В целом признаки отбора были относительно редкими.Хотя в популяции в целом наблюдалось очень много отдельных мутаций, большинство существенных изменений частоты аллелей происходило в небольшом количестве участков (например, рисунок 2). Таким образом, восемнадцать аллелей в наборе данных были идентифицированы как потенциально не нейтральные. Было обнаружено, что эффекты интерференции между аллелями важны; из этих восемнадцати аллелей в общей сложности девять были идентифицированы как действительно находящиеся в процессе отбора, изменения частоты у остальных девяти можно объяснить неравновесием сцепления с другими выбранными аллелями.В популяциях, идентифицированных как ненейтральные, были обнаружены различные формы отбора, в том числе свидетельства в пользу выбора, зависящего от времени, и отбора, действующего одновременно в более чем одном локусе (выборка предполагаемых траекторий показана на Рисунке 3; далее выводы представлены на вспомогательном рисунке S1). Наша модель с множеством локусов различает случаи, когда несколько аллелей меняют частоту при независимом отборе, и случаи, когда отбор, действующий на один аллель, приводит к существенным изменениям частоты других (таблица 1).

    Рисунок 2. Наблюдения за вирусной популяцией у свиньи 405.

    (A) Частоты минорных аллелей больше нуля, зарегистрированные в каждом локусе с течением времени. Вертикальные черные линии указывают локусы, в которых было обнаружено явное ненейтральное поведение в частоте минорного аллеля; индексы для этих локусов отображаются над рисунком. В локусе 844 можно увидеть постоянное увеличение частоты минорных аллелей с течением времени; в локусе 553 частота минорного аллеля увеличивается между 2 и 3 днями, а затем уменьшается до нуля.В локусе 447 частота аллеля меньшинства достигает значения, близкого к 0,4 в конечный момент времени; более низкая частота аллелей наблюдается в соседнем локусе 446. (B) Частоты гаплотипов для аллелей в трех локусах, которые демонстрируют ненейтральное поведение.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g002

    Рис. 3. Графики частот репрезентативных гаплотипов для различных моделей отбора.

    Сравнительная модель подходит для Pig104: Модель постоянного отбора против мутации G → A в локусе 113 превосходит нейтральную модель, Pig109: Модель, в которой две из трех мутаций в локусах 553, 696 и 914 превосходят результаты модели, в которых одна или ни одна из этих мутаций находится в процессе отбора. Pig405: Модель отбора с двумя локусами постоянного отбора для мутации G → A в локусе 844 с переменным, убывающим отбором для мутации A → G в локусе 553 дала наилучшее соответствие данным. Pig412: Модель зависящего от времени отбора в локусе 696 с постоянным отрицательным отбором в локусе 48 была оптимальной. Цветные полосы погрешностей показывают 95% доверительные интервалы для предельной частоты каждого гаплотипа с учетом наблюдения; планки погрешностей смещены относительно соответствующих временных точек, чтобы их можно было идентифицировать.Выводы показаны только для гаплотипов, которые наблюдались в данных последовательности. В Pig405 частота гаплотипа CAA скрыта под частотой TAA.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g003

    У Pig104 были обнаружены убедительные доказательства [35] отрицательного отбора, действующего против мутации G → A в локусе 114, с предполагаемым коэффициентом отбора — 1,6 за 12 часов (ч). Такая величина отбора относительно велика; для сравнения, аллель с частотой 50% с коэффициентом отбора -1 за 12 часов снизился бы до 12% частоты через один день и до менее 2% через 2 дня.Отборная мутация в этом случае синонимична, так что наблюдение сильно вредного отбора, возможно, вызывает удивление. Хотя с использованием нашего метода не было выявлено никаких статистических доказательств отбора по этому аллелю у других свиней, такой же полиморфизм был обнаружен в данных, собранных в самый ранний момент времени для свиней 115 и 116, но не в последующие моменты времени, что согласуется с гипотеза об отрицательном отборе по этому нуклеотиду во всех вирусных популяциях.

    У Pig109 были обнаружены убедительные доказательства положительного отбора по крайней мере по двум из трех аллелей; в пользу полиморфизма G → A в локусе 553, полиморфизма A → G в локусе 696 или полиморфизма G → A в локусе 914.Фиксация всех трех из этих мутаций произошла между двумя образцами, и модели с любой одной из этих мутаций в качестве выбранного аллеля работали одинаково хорошо, давая оценочные коэффициенты отбора от 3,0 до 3,1 за 12 часов для выбранного аллеля. Совместное рассмотрение частот гаплотипов с четырьмя локусами предоставило доказательства того, что по крайней мере две из этих мутаций независимо подвергались отбору. Наиболее вероятная модель имела коэффициенты 2,8 на 12 часов в каждом из локусов 696 и 914. Однако разница между аддитивными моделями с двумя локусами была небольшой, и модели, в которых любые два из трех полиморфизмов находились в стадии отбора, работали одинаково хорошо ( Вспомогательная таблица S1).Интересной особенностью этого результата является то, что пары мутантных аллелей, которые, как предполагается, находятся в процессе отбора, сильно сцеплены, мутантные аллели в локусах 696 и 914 появляются только вместе в последовательности, а не изолированно. Вывод о том, что отбор действует в двух локусах, а не только в одном локусе, возникает из эффекта мутации в модели; этот результат более подробно рассматривается во вспомогательной информации. Мы отмечаем, что в то время как полиморфизм в локусе 696 является синонимом, полиморфизм в локусе 696 не является синонимичным по характеру, что соответствует мутациям D185N и S305N (первый содержится в области эпитопа Ca2 [36]).

    У свиньи 115 были обнаружены слабые доказательства положительного отбора в пользу полиморфизма G → A в локусе 188 с предполагаемым коэффициентом отбора 1,2 за 12 часов. Этот полиморфизм не является синонимом и представляет собой аминокислотную замену G63E. Использование этого результата против выводов из данных последовательности, которые были рандомизированы во времени, в значительной степени поддержало этот вывод; из всего 200 наборов данных рандомизированной последовательности более сильный сигнал в пользу модели постоянного отбора был выявлен только в восьми случаях.Подробности начальной загрузки всех результатов приведены в вспомогательном тексте S1 и на вспомогательном рисунке S2.

    У Pig405 были обнаружены убедительные доказательства положительного отбора, действующего на полиморфизм G → A в локусе 844, с коэффициентом отбора 0,4 за 12 ч, наряду с одновременным, зависящим от времени отбором, действующим на полиморфизм A → G в локусе 553. Отбор в этом втором локусе был первоначально положительным, со средней силой 0,9 за 12 ч в течение первого временного интервала, слабо отрицательной в течение второго временного интервала, со средней силой -0.1 за 12 часов, затем, наконец, сильно отрицательный, со средней величиной более -2 за 12 часов для последнего временного интервала. Каждый из этих полиморфизмов несинонимичен (соответствует мутациям V282I и N185D соответственно; мутация в локусе 553 идентична мутации, наблюдаемой в Pig109, хотя и в обратном направлении). Выявление зависимого от времени отбора, действующего на последнюю, мутацию эпитопа, представляет особый интерес, что повышает вероятность того, что это соответствует адаптивному иммунному ответу хозяина на вирус.В этой популяции величина зависящего от времени выбора, сделанная для последней временной точки, была большой и отрицательной, но ее трудно было идентифицировать с точностью. Это происходит из-за зависящей от времени модели отбора, сочетающейся с наблюдаемой частотой аллеля, равной нулю в конечный момент времени. Исключая влияние частот аллелей в других локусах, данные в таком случае могут привести к выводу о произвольно сильном отрицательном отборе; временное разрешение, при котором собираются данные, накладывает ограничение на величину выбора, которая может быть правильно сделана [37].

    У Pig410 мы выявили слабые доказательства зависящего от времени отбора, действующего на синонимичную мутацию C → T в локусе 447; в этом случае расчет начальной загрузки дал более сильный сигнал выбора, чем для реальных данных, только в трех из 200 случаев (подтверждающий рисунок S2). Зависящий от времени отбор был также идентифицирован у Pig412, где были найдены убедительные доказательства того, что зависящий от времени отбор, действующий на синонимичную мутацию G → A в локусе 696, с дополнительными слабыми доказательствами отрицательного отбора, действующего на синонимичную мутацию A → G в локусе 48. .В рамках модели с несколькими локусами коэффициент отбора 1,8 был идентифицирован в локусе 696 для первого временного интервала. Предполагаемая сила отбора в этом локусе для второго, последнего временного интервала была неточной, но очень большой и отрицательной; значение -22,8 за 12 ч, указанное в таблице 1, снова вызвано наблюдаемой нулевой частотой в конечный момент времени.

    аллелей, по которым был сделан вывод, были распределены по белку НА (вспомогательная фигура S3). Значительные изменения частоты аллелей были выявлены более чем в одной инфекции в пяти разных локусах (447, 553, 696, 824 и 844).Из них предполагалось, что отбор воздействует на локусы 696 и 844 более чем в одной инфекции. Такое повторение мутаций можно объяснить планом эксперимента; отбор, скорее всего, будет наблюдаться, когда полиморфизмы существуют в популяции с незначительной частотой, в то время как полиморфизмы с более высокой частотой с большей вероятностью будут передаваться между инфекциями.

    При первоначальном сканировании потенциально ненейтральных аллелей в данных от Pig113 по трем локусам 447, 824 и 844 были идентифицированы очень слабые доказательства отбора.Однако в рамках полной модели с множеством локусов в конечном итоге предпочтение было отдано нейтральной модели эволюции. Как мы обсудим далее в Вспомогательном тексте S1, наша эволюционная модель более консервативна в определении отбора в случаях, когда несколько локусов рассматриваются одновременно.

    Обсуждение

    Здесь мы описали новый подход к пониманию эволюции вируса гриппа внутри хозяина, основанный на последовательностях, собранных в последующие моменты времени в рамках одной инфекции. Наш метод сочетает в себе квазивидовую модель вирусной эволюции с иерархическим набором потенциальных моделей отбора, определяя эволюционный сценарий, который лучше всего объясняет наблюдаемые данные о последовательности.Важнейшим компонентом нашей модели является учет неравновесия по сцеплению между аллелями в разных локусах; в то время как модели с одним локусом достаточно для случаев, когда только одна мутация в гене изменяется по частоте [38], наблюдение более чем одного одновременного изменения частоты аллелей в нерекомбинантном гене требует более сложного анализа.

    Наш подход к выводу о выборе существенно отличается от вычисления dN / dS [25], не в последнюю очередь в рассмотрении данных на уровне частоты гаплотипа.Хотя в более ранней работе dN / dS применялся к последовательностям, собранным в вирусных популяциях от всех наблюдаемых инфекций, мы допускаем, что ландшафт отбора, действующий на вирус, может варьироваться между животными или, возможно, изменяться в пределах одного животного с течением времени. Результаты нашего анализа также различаются; в то время как значимые отношения dN / dS были идентифицированы в положениях кодонов 204 и 257, мы не нашли доказательств отбора аллелей ни в одном из этих локусов. Мы отмечаем, что в короткие сроки могут возникнуть трудности с использованием количества синонимичных и несинонимичных мутаций для вывода о выборе.Хотя этот подход имеет большую ценность при применении к расходящимся последовательностям, таким как те, которые собраны из гомологичных генов у разных видов [39], его применение к последовательностям из одной популяции дает результаты, которые может быть труднее интерпретировать [40], [41] .

    Наш подход к эволюции вируса внутри хозяина основан на интерпретации данных вирусной последовательности, многократно собранных от отдельных инфекций. Моделируя эволюцию, можно оценить последствия для вирусной популяции гипотетических ландшафтов приспособленности (например,грамм. [16]). Если известно, что мутация фиксируется с заданной вероятностью в заданном временном масштабе, можно узнать необходимое преимущество приспособляемости, обеспечиваемое этой мутацией [42], [43]. Однако для получения подробной картины эволюции вируса внутри хозяина необходимо использовать секвенирование с временным разрешением, описывающее популяцию в нескольких временных точках. Наш метод обеспечивает систематический подход к умозаключению отбора; в то время как набор потенциальных моделей пригодности очень велик [44], мы строим вверх от нейтральной модели к возрастающей сложности, руководствуясь данными.Хранение данных в центре нашего подхода означает, что мы можем упустить влияние определенных эффектов фитнеса; может быть недостаточно данных, чтобы составить полную картину того, как работает эволюция. Однако наш иерархический подход означает, что при наличии точных данных, описывающих совокупность, мы не должны делать ложных выводов о наличии отбора.

    Анализируя данные, мы определили отбор, действующий как на синонимичные, так и на несинонимичные мутации. Слабый отбор, действующий на синонимичные мутации, был идентифицирован для использования кодонов при гриппе [45] и против мутаций, нарушающих структуру РНК в ВИЧ [46], хотя величина предполагаемого здесь отбора значительно выше, чем в любом случае.Предполагая наличие отбора, наш метод не может сопоставить случаи отбора с конкретными биологическими механизмами; для этого обычно требуются дополнительные данные.

    Одним из результатов, для которого может быть предложен биологический механизм, является вирусная популяция Pig405, где мы определили переменную и снижение отбора, действующее на несинонимичную мутацию в области эпитопа Са2, возможно, в результате специфического иммунного ответа. Для этой мутации время начала сильного отрицательного отбора на четвертый день после контакта с вирусом раньше, чем за пять дней до обнаружения адаптивного ответа, сообщенного для инфекции гриппа h4N2 у мышей [47].Кроме того, исследования по моделированию связали врожденный иммунный ответ с начальным снижением вирусной нагрузки, адаптивный ответ, ведущий к окончательному избавлению от вируса [13]. Здесь не наблюдалось снижения титра вируса во время предполагаемого отрицательного отбора, и выведение происходило через восемь дней после заражения [24]. Опять же, потребуются дополнительные данные, чтобы сделать более конкретный вывод; объединение данных о вирусной последовательности и иммунном ответе приведет к лучшему пониманию таких систем.

    Допущения при моделировании

    Наша эволюционная модель предполагает, что вирусная популяция генетически хорошо перемешана с хозяином и что она развивается детерминированным образом, как в отношении мутации, так и в отношении отбора. Первое из этих предположений утверждает, что каждый образец вирусов, собранный у свиньи, является репрезентативным для вирусной популяции животного в то время. Это было бы неверно, если бы, например, вирусная популяция была разделена на различные подмножества, причем отбор в каждом из них действовал по-разному.Изучение этих эффектов было невозможно с учетом изученных здесь данных.

    Наше предположение о детерминированной эволюции основано на том, что основная вирусная популяция является большой по численности, то есть достаточно большой, что значительно превышает 1, где N — количество вирусов в животном, μ — мутация частота на локус, а σ — величина отбора [48]. Учитывая выбор, самое низкое разрешение, при котором мы сообщаем о выборе, 0.1 за 12 часов, что составляет два цикла репликации за время жизни инфицированной клетки [10], [15], что эквивалентно разнице в приспособленности 0,05 на поколение. Таким образом, эта часть предположения верна, если N существенно больше, чем 20 вирусов. Принимая во внимание мутацию, критерий, который является более строгим, чем критерий отбора (где μ имеет порядок 10 -5 [49], [50]), требуя, чтобы N было существенно больше, чем 10 5 . При гриппе модели репликации в одной клетке предполагают, что в каждой клетке продуцируется порядка 10 4 вирионов [51], в то время как в образцах, из которых были секвенированы вирусы, вирусная нагрузка составляет от 30 до 5500 частиц на µ л [24] было измерено; как только инфекция прогрессирует до точки, когда становится возможным вирусное секвенирование, популяция, скорее всего, достаточно велика для этого.На самых ранних стадиях инфекции стохастическое мутационное поведение может потенциально привести к неправильному выводу о частотах исходных вариантов в популяции; однако эти значения не используются для каких-либо биологических выводов о системе.

    Горизонтальная передача между животными, находящимися в одном помещении, не была включена в модель; мы считаем, что это вряд ли сильно повлияло на собранные данные. Если вирусные популяции у двух одновременно инфицированных свиней существенно различались по составу, передача вирусов от одного животного к другому могла бы изменить состав вирусной популяции у второго животного.Однако вирусные популяции в этом эксперименте не различались в достаточной степени по последовательности, чтобы можно было отличить суперинфекцию от роста de novo мутаций . Кроме того, хотя титр вируса, участвующий в передаче, неизвестен, мы полагаем, что входящий титр, вероятно, будет значительно меньше, чем ранее существовавшее количество вирусов у второго инфицированного животного.

    Точность данных

    Второе предположение в нашем исследовании состоит в том, что собранные данные о последовательностях относительно точны.То есть мы утверждаем, что последовательности, полученные из выборки, являются репрезентативными для самой выборки. Основание нашего вывода на основе данных означает, что точность данных жизненно важна для получения полезных результатов. Например, в дополнение к необработанному количеству аллелей наш подход явно использует связи между мутациями. Наш метод учитывает возможность общей ошибки в процессе секвенирования и полностью учитывает статистический шум, присущий выборке конечных данных. Однако существуют систематические ошибки в данных, которые также могут повлиять на полученные результаты.Например, рекомбинация, индуцированная ПЦР, может изменить наблюдаемые частоты мультилокусных гаплотипов [52], [53]. Тестируя такой эффект, подгоняя экспоненциальную модель к наблюдаемому абсолютному неравновесию по сцеплению между парами аллелей, мы не нашли доказательств такой рекомбинации, не наблюдается ухудшения этой статистики с увеличением расстояния между аллелями (подтверждающий рисунок S4).

    Ошибка при секвенировании также влияет на то, распознается ли мутация как находящаяся в процессе отбора.Мутации, которые предпочтительно идентифицируются методом секвенирования, будут появляться в образце с более высокими частотами, так что изменения в их частотах будут усилены, что приведет к большей вероятности того, что такие мутации были обнаружены в процессе отбора. Для этого набора данных использовался последовательный метод секвенирования для обработки всех образцов; Таким образом, мы предположили, что систематическая ошибка секвенирования является постоянной между выборками, так что наблюдаемые изменения частоты аллелей были вызваны либо конечным процессом выборки, либо процессом мутации и отбора.Оценить степень систематической ошибки в наблюдаемых последовательностях сложно, сами последовательности представляют собой единственную информацию о реальной вирусной популяции. Подсчет мутаций, наблюдаемых в данных, показал высокий коэффициент перехода: трансверсия, равный 9,7 (подтверждающий рисунок S5). Это в целом согласуется со значениями, наблюдаемыми для других популяций РНК-вирусов [54], [55], хотя измерения этого соотношения при гриппе ранее основывались на глобальных популяциях, а не внутри хозяина [56].Предвзятый отбор образцов, будь то сбор биологического образца, который не является репрезентативным для всей популяции, или в результате последующей амплификации ПЦР, также может повлиять на наши выводы. Здесь мы предположили, что данные представляют собой беспристрастную выборку реальной совокупности.

    Наши выводы частично ограничены использованием последовательностей, описывающих только область HA1 вируса гриппа. Хотя наши выводы об отклонении от нейтральности в популяции не зависят от аллелей в других частях вируса, на отнесение отбора к данным аллелям могут влиять ненаблюдаемые полиморфизмы в области HA2 гриппа или если повторная сортировка была ограничена (хотя см. [57] ]) с аллелями в других вирусных сегментах.Потенциальное влияние отбора, действующего на полиморфизмы, которые не наблюдались, имеет наибольшее значение для случаев явно зависящего от времени отбора; постоянный отбор, действующий на мешающие мутации, вызывает зависящие от времени эффекты отбора [32]. Одним из примеров является случай Pig412, где сначала подразумевается положительный, затем отрицательный выбор. При этой инфекции многие гаплотипы, которые наблюдаются в промежуточный момент времени, больше не видны в конечный момент времени; этот паттерн согласуется либо с переключением в направлении отбора, действующим на синонимичную мутацию в локусе 696, как предполагалось, либо с очень сильным положительным отбором, действующим на ненаблюдаемую мутацию в консенсусном гаплотипе, вызывая избирательное сканирование позже в наблюдении.Такой сценарий гораздо менее вероятен в случае Pig405, где гаплотип, содержащий аллель, предположительно находящийся под отрицательным отбором, вытесняется в конечном временном интервале четырьмя другими гаплотипами, включая гаплотип первоначального консенсуса.

    Выводы

    Здесь мы описали структуру для вывода о выборе, действующем на вирусную популяцию в пределах отдельного хозяина, на основе данных последовательности с временным разрешением. Отбор внутри хозяина важен для будущей эволюции вируса гриппа H7N9 и для понимания эпидемиологии других штаммов гриппа.Во время эпидемии как рост внутри хозяина, так и передача вирусов являются важными и потенциально конкурирующими факторами; мутация, полезная для роста внутри хозяина, может оказаться вредной для передачи и наоборот. Хотя здесь мы рассмотрели только первый из этих факторов, наш метод можно легко использовать для вывода о роли отбора для передачи при определенных условиях. Прежде всего, потребуется существенная преемственность между нативной и передаваемой популяциями, так чтобы изменения частот аллелей до и после передачи были в первую очередь результатом отбора; серьезное узкое место исказит структуру населения.Во-вторых, потребуется ясность в отношении источника каждой инфекции; в рассмотренных экспериментах, где инфекция начинается с неизвестной смеси вирусов от двух других людей, невозможно оценить роль отбора в передаче. События передачи в анализируемых здесь данных обсуждались в другом месте [58]. В более простых случаях, когда передача происходит между известными индивидуумами и когда преемственность между вирусными популяциями более очевидна (например, [59]), использование нашего метода для вывода результатов отбора, воздействующего на события передачи, вероятно, будет достижимым.

    Сбор данных о последовательностях, описывающих эволюцию гриппа внутри хозяина, в настоящее время относительно редок, хотя мы ожидаем, что улучшения в технологии секвенирования сделают такие данные все более доступными. Расширенный сбор данных о последовательностях от пациентов и из эволюционных экспериментов значительно расширит наше понимание вирусной инфекции. Наш подход увеличивает ценность такой работы, подробно описывая силы, лежащие в основе вирусной эволюции внутри хозяина.

    Методы

    Описание вирусной динамики

    Теория квазивидов [26] обеспечивает детерминированное описание эволюции подверженных мутациям самовоспроизводящихся организмов; эта структура оказала глубокое влияние на исследования вирусной эволюции РНК [60] — [63]. Чтобы описать эволюционную динамику вируса гриппа в пределах отдельного хозяина, мы применяем грубозернистую модель квазивидов, в которой вирусная популяция описывается как гаплотипы, охватывающие ограниченный набор локусов, а не как полные вирусные последовательности.В частности, мы представляем вирусную популяцию как частотный вектор, определенный в дискретные моменты времени и состоящий из элементов, где — доля последовательностей в популяции с гаплотипом; то есть с нуклеотидами в подмножестве локусов вирусного генома.

    Для моделирования мутации между гаплотипами мы предположили постоянную скорость мутации, μ , между любыми двумя конкретными нуклеотидами в данном локусе, вероятность мутации от гаплотипа к гаплотипу в одном поколении дается формулой (1) где — Расстояние Хэмминга между двумя последовательностями гаплотипов.

    Отбор учитывали путем приписывания каждому гаплотипу (потенциально зависящего от времени) коэффициента отбора. Влияние отбора на частоту гаплотипов между временами и, таким образом, определялось функцией: (2) где. Принимая во внимание эволюцию гриппа, мы предположили, что точки времени должны быть расположены с 12-часовыми интервалами, что примерно соответствует времени, необходимому для цикла внутриклеточного роста внутри клетки [10]. В рамках такого раунда роста каждый вирус проходит два раунда репликации, моделируемых как имеющие равные скорости мутаций, с параметром, представляющим общую скорость мутации на нуклеотид на поколение, равное 10 -5 [49], [50].Предполагалось, что отбор воздействует на вирусную популяцию после того, как она покинет клетку, давая соотношение (3) где — матрица, состоящая из элементов, моделирующая один раунд репликации. Таким образом, поведение системы детерминированно определяется параметрами выбора и начальным состоянием системы, заданным элементами вектора.

    Отметим, что, хотя данные о последовательностях собирались в известное время на протяжении каждого заражения, точный момент начала каждого заражения неизвестен.Здесь мы предположили, что прошло ровно 24 часа до первого наблюдаемого набора данных о последовательности заражения. Хотя неопределенность в этом значении имеет последствия для точности элементов предполагаемого вектора, окончательных выводов из этих значений сделано не было.

    Определение ненейтрального поведения и выбор

    Вывод о выборе был выполнен путем сравнения значений максимального правдоподобия, полученных в рамках иерархической серии моделей, каждая из которых определяет параметры и.Модель крупных квазивидов может быть выражена в терминах гаплотипов произвольной длины. Опишем общую модель ниже.

    Эволюционная модель.

    Мы рассматриваем популяцию с произвольным числом полиморфных локусов, каждый из которых содержит аллели, которые могут или не могут находиться в процессе отбора. Каждый локус может содержать один из четырех нуклеотидов, так что вектор, описывающий начальное состояние популяции, имеет элементы, потенциально большое количество. Поэтому, чтобы уменьшить сложность модели, мы рассматривали только согласованные и наибольшие миноритарные аллели в каждом локусе.В каждом локусе консенсусный аллель, обозначенный 0, был определен как мажоритарный аллель в выборке, взятой из популяции при первом наблюдении. Затем определяли самый большой миноритарный аллель, обозначенный 1, чтобы максимизировать общее количество наблюдаемых последовательностей, которые имели один из гаплотипов в локусах. Если в данном локусе присутствовало более двух аллелей, это упрощение искажает правдоподобие полученной модели. Однако в рассматриваемом наборе данных такие случаи были крайне редкими; мы обсуждаем это далее в вспомогательном тексте S1.

    Параметры описывающие и определялись независимо. Начальная частота гаплотипа включалась в качестве переменной в модель, если этот гаплотип наблюдался хотя бы один раз в данных последовательности, другие начальные частоты были установлены на ноль. Параметры отбора были включены в соответствии с применяемой моделью отбора. В базовой нейтральной модели мы устанавливаем величину отбора для каждого гаплотипа и момент времени равными нулю. В других моделях отбора вариантный аллель может быть либо нейтральным, либо находиться в условиях постоянного или зависящего от времени отбора в каждом локусе.Если аллель подвергался отбору более чем в одном локусе, взаимодействие между этими аллелями могло быть аддитивным или эпистатическим по своей природе. Таким образом, можно рассматривать произвольные модели отбора.

    В модели отбор применялся ко всем релевантным гаплотипам. В случае постоянного отбора в одном локусе, в котором аллель 1 в локусе подвергался отбору с величиной, значения будут равны для всех гаплотипов, в которых локус имел аллель 1, и для всех времен.

    Был включен последний параметр ошибки, определяющий вероятность того, что секвенирование вернет ошибочный гаплотип для данной последовательности. Предполагая, что при чтении любого данного гаплотипа возникает не более одной ошибки (т. Е. Частота ошибок низкая), мы определяем частоту гаплотипа, описывая частоту гаплотипа в модели во время, как (4) где рассчитывается, как описано выше .

    Учитывая набор параметров, описывающих начальное состояние популяции, и коэффициенты отбора, действующие на совокупность, мы можем записать вероятность этих параметров как (5) где — общее количество выборок, собранных в точке, — количество выборки с гаплотипом в момент времени, — это прогнозируемая частота гаплотипа во время и представляет собой набор всех гаплотипов по локусам в.

    Байесовский информационный критерий (BIC) [64] был использован для сравнения моделей с разными уровнями сложности. Учитывая оптимизированные значения логарифмического правдоподобия для разных моделей, описывающих один и тот же набор данных, лучшая модель была определена как модель, дающая наименьшее значение BIC (6), где — количество параметров, включенных в модель, а — общее количество последовательностей в наборе данных. , суммированные по временным точкам. Мы отмечаем, что количество начальных частот, полученных при вычислении, определяется свойствами данных; Различия между моделями системы полностью связаны с количеством параметров, описывающих выбор.

    Начиная с нейтральной модели, были протестированы модели отбора возрастающей сложности с добавлением локусов при выборе. Этот процесс продолжался либо до тех пор, пока добавление отбора к аллелю в другом локусе не улучшило значение BIC, либо пока вероятность модели не стала достаточно близкой к максимальной теоретически достижимой вероятности (полученной, когда предполагаемые частоты гаплотипов были идентичны наблюдаемым частотам), что добавление дополнительного параметра неизбежно приведет к увеличению BIC.

    Идентификация аллелей, потенциально находящихся в процессе отбора.

    Вышеупомянутый метод основан на предварительном выборе локусов, содержащих аллели, которые потенциально находятся в процессе отбора. В проведенном здесь анализе эти локусы были идентифицированы с использованием версии описанной выше модели с одним локусом. Для каждого полиморфного локуса наблюдаемые частоты аллелей с течением времени использовались для расчета вероятности того, что самый большой аллель меньшинства находился под постоянным или зависящим от времени отбором, эти значения сравнивали с вероятностью наблюдения в нейтральной модели.Вероятность рассчитывалась с использованием биномиальной модели (7), где — количество последовательностей, наблюдаемых в данный момент с аллелем 1 в локусе, и — предполагаемая частота последовательностей с аллелем 1 в локусе в данный момент. Это оценивает, проявляет ли аллель явно ненейтральное поведение, изменяя частоту либо из-за присущего отбора, либо из-за неравновесия по сцеплению с другими ненейтральными аллелями. Все локусы, для которых модель ненулевого отбора давала большую вероятность, чем модель нейтральности, были включены в набор.Наглядное представление нашего метода приведено на рисунке 4.

    Рисунок 4. Модели выбора.

    (A) Пример модели с одним локусом. Одиночный аллель, обозначенный 1 (красный) в локусе драйвера, считается потенциально находящимся в процессе отбора; исходный согласованный аллель обозначен 0. На изменения частот аллелей в локусе со временем влияют мутации и отбор; аллели, обозначенные 2 и 3, относятся к оставшимся двум нуклеотидам в этом локусе. Изменения частоты аллелей сравниваются с изменениями, полученными в моделях, в которых аллель 1 является либо нейтральным, либо при постоянном или зависящем от времени отборе; соответствующие параметры для выбора и для начального состояния системы изучаются. (B) Пример модели с двумя локусами. Мы предполагаем, что аллели в локусах и, как было обнаружено, демонстрируют очевидное ненейтральное поведение, а другие аллели неотличимы от нейтральности. Мы делим популяцию на гаплотипы на основе аллелей, присутствующих в этих локусах, давая частоты гаплотипов,, и. Затем наблюдаемые частоты сравниваются с частотами, полученными с помощью различных моделей отбора в одном или двух из этих локусов. На этом рисунке показаны примеры последовательностей для одного момента времени.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g004

    Описание степени поддержки модели.

    В тексте мы описываем разницу в BIC более чем на 2 единицы как свидетельство в пользу модели, с разницей более чем в 6 единиц как убедительное свидетельство в пользу модели (см. [35]). Мы описываем разницу BIC менее 2 единиц как слабое свидетельство в пользу модели. В качестве дополнительного теста на достоверность выводов из модели с одним локусом мы провели оценки бутстрэппинга против различий BIC, полученных из данных рандомизированной последовательности; во всех случаях, когда мы выявили более чем слабые доказательства для выбора, эти тесты подтвердили наш результат (см. вспомогательный текст S1).

    Валидация метода

    Тест способности метода различать выбранные и невыбранные аллели и правильно делать выводы о величине отбора, действующего на локус, был выполнен путем выполнения анализа смоделированных данных. Для смоделированных популяций с одним отобранным аллелем коэффициент корреляции более 0,95 был обнаружен между реальными и предполагаемыми коэффициентами отбора с эквивалентной корреляцией 0,91 для смоделированных систем с двумя отобранными аллелями.Дополнительные подробности приведены в вспомогательном тексте S1 и вспомогательных рисунках S6 и S7.

    Дополнительная информация

    Рисунок S1.

    Выводы, сделанные методом единого локуса. Подбор модели и соответствующие логарифмические вероятности показаны для нейтральной, постоянной выборки ( σ ) и зависящей от времени ( σ ( t )) моделей выбора для выбранных локусов в данных. Модель постоянного отбора дает оптимальную оценку BIC для локуса Pig115 188 и локуса Pig405 844.Модель зависящего от времени отбора дает оптимальную оценку BIC для локуса Pig410 447; нейтральная модель предпочтительна для локуса 114 Pig115. Планки ошибок дают 95% -ные интервалы апостериорной вероятности для каждой частоты аллеля в каждый момент времени с учетом наблюдаемых последовательностей. Оптимальный балл BIC, определенный для каждого набора данных, выделен жирным шрифтом.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s001

    (TIF)

    Рисунок S2.

    Загрузка выводов BIC. Разница в BIC между отобранными и нейтральными моделями для единственного аллеля, дающая наиболее убедительные доказательства выбора у каждого животного, измеренная с помощью BIC. Здесь положительная разница BIC свидетельствует в пользу выбранной модели. Здесь значения реальных данных последовательностей сравниваются с эквивалентной статистикой для случайных перестановок последовательностей, собранных от каждого животного. Каждая гистограмма показывает реальную и случайную статистику; красная стрелка показывает положение в распределении реального вывода.В Pig104, Pig109 и Pig412 реальные данные давали более сильный сигнал выбора, чем все 200 случайных наборов данных. В Pig405, Pig410 и Pig115 количество случайных наборов данных, дающих более сильные сигналы выбора, составляло один, три и восемь соответственно.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s002

    (PDF)

    Рисунок S3.

    Примерные местоположения остатков, затронутых нуклеотидными мутациями в системах, для которых было идентифицировано ненейтральное поведение. Остатки, соответствующие полиморфизму нуклеотидов, показаны как для синонимичных (оранжевый), так и для несинонимичных (красный) мутаций. Участок HA1 для одной единицы тримерного белка показан желтым; область HA2, которая не была включена в данные последовательности, показана синим цветом. Две другие части тримера показаны серым цветом. Остаток, соответствующий положению нуклеотида 553, находится в сайте эпитопа Са2.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s003

    (PDF)

    Рисунок S4.

    Доказательств рекомбинации, индуцированной ПЦР, не обнаружено. Серые точки показывают значения нормализованной статистики неравновесия по сцеплению D для аллелей, находящихся на разном расстоянии друг от друга. Сплошная красная линия показывает среднее значение скользящего окна D при ширине 100 баз. Пунктирная серая линия показывает оптимальное соответствие данным экспоненциальной линии регрессии. Сравнение BIC экспоненциальной регрессии с линейной моделью отдавало предпочтение последней, давая оценку для рекомбинации, индуцированной ПЦР, равной нулю.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s004

    (TIF)

    Рисунок S5.

    Спектр мутаций, наблюдаемых в популяции. (A) Число появлений мутаций, наблюдаемых в данных последовательности. Мутации подсчитывали относительно согласованной последовательности, считая несколько наблюдений одной и той же мутации у одного и того же животного за одно событие. (B) Доля мутаций, наблюдаемых в данных последовательности, масштабированная по содержанию нуклеотидов в консенсусной последовательности.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s005

    (PDF)

    Рисунок S6.

    Результаты получены из смоделированных популяций, в которых отбирался единственный локус. (A) Показатели истинно положительных (красный) и ложноположительных (черный) для идентификации выбора в выбранном локусе после использования модели вывода с несколькими локусами, описанной в основном тексте. Синяя линия показывает частоту ложных срабатываний для идентификации отбора с использованием модели с одним локусом; учет интерференции между аллелями дает существенно лучший результат. (B) Предполагаемые коэффициенты отбора, полученные из модели с несколькими локусами. Индивидуальные выводы показаны маленькими красными кружками; случаи, для которых отбор не отличался от нейтральности, представлены как имеющие нулевой предполагаемый отбор. Черная линия показывает полное соответствие между реальными и предполагаемыми коэффициентами отбора.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s006

    (TIF)

    Рисунок S7.

    Результаты получены из смоделированных популяций, в которых аллели в двух локусах эволюционировали в результате аддитивного отбора. (A) Показаны комбинированные ошибки вывода пар коэффициентов выбора. Ошибка E в каждом случае вычисляется как евклидово расстояние между реальным и предполагаемым коэффициентами выбора. (B) Предполагаемые коэффициенты отбора, полученные из модели с несколькими локусами для отдельных аллелей. Выводы показаны в виде маленьких красных кружков; случаи, для которых отбор не отличался от нейтральности, представлены как имеющие нулевой предполагаемый отбор.Черная линия показывает полное соответствие между реальными и предполагаемыми коэффициентами отбора.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s007

    (TIF)

    Таблица S1.

    Дальнейшие выводы для Pig109. В каждом конкретном случае приводится оптимальная модель каждого типа. Небольшие различия BIC были выявлены между случаями отбора различных аллелей или комбинаций аллелей. Коды моделей: σ : Постоянный выбор в одном локусе; 2 σ : Аддитивный отбор по двум локусам.Значение BIC для оптимальной модели выделено жирным шрифтом.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s008

    (PDF)

    Текст S1.

    Подробная информация об оптимизации правдоподобия журнала. Рассмотрение случаев множественных аллелей в одном локусе. Важность мутации для выводов, сделанных для Pig109 и Pig113. Методы построения фигур. Вывод о выборе из смоделированных популяций. Начальная загрузка посредством вывода выбора из данных рандомизированной последовательности.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s009

    (PDF)

    Благодарности

    Мы хотим поблагодарить Элеонору Грей и Саймона Уотсона за обсуждение вирусного секвенирования.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: CJRI AF VM. Проведены эксперименты: CJRI. Проанализированы данные: CJRI. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: CJRI. Написал статью: CJRI AF VM. Интерпретировал результаты: CJRI AF VM.

    Ссылки

    1. 1.Гао Р., Цао Б., Ху Й., Фэн З., Ван Д. и др. (2013) Инфицирование человека новым вирусом птичьего гриппа A (H7N9). N Engl J Med 368: 1888–97.
    2. 2. Lai KY, Ng GWY, Wong KF, Hung IFN, Hong JKF и др. (2013) Инфекция вируса птичьего гриппа человека H7N9: обзор и оценка риска пандемии. Новые микробы и инфекции 2: e48.
    3. 3. Моренс Д.М., Таубенбергер Дж.К., Фаучи А.С. (2013) Пандемические вирусы гриппа — надежды на то, что дорога не взята. N Engl J Med 368: 2345–8.
    4. 4. Шортридж К.Ф. (1992) Пандемический грипп: зооноз? Семинары по респираторным инфекциям 7: 11–25.
    5. 5. Вулф Н.Д. (2005) Охота на диких животных, вырубка лесов и прогноз возникновения зоонозных заболеваний. Emerging Infect Dis 11: 1822–1827.
    6. 6. Morse PSS, Mazet PJA, Woolhouse PM, Parrish PCR, Carroll D, et al. (2012) Прогнозирование и предотвращение следующей пандемии зоонозов. Ланцет 380: 1956–1965.
    7. 7. Лю Д., Ши В., Ши И, Ван Д., Сяо Х и др.(2013) Происхождение и разнообразие новых вирусов птичьего гриппа A H7N9, вызывающих инфицирование человека: филогенетический, структурный и коалесцентный анализ. Ланцет 381: 1926–32.
    8. 8. Pepin KM, Lass S, Pulliam JRC, Read AF, Lloyd-Smith JO (2010) Идентификация генетических маркеров адаптации для наблюдения за вирусными скачками хозяина. Nat Rev Microbiol 8: 802–13.
    9. 9. Мурильо Л.Н., Мурильо М.С., Перельсон А.С. (2013) К многомасштабному моделированию инфекции гриппа. Дж. Теор Биол. 332: 267–290.
    10. 10. Baccam P, Beauchemin C, Macken CA, Hayden FG, Perelson AS (2006) Кинетика вирусной инфекции гриппа A у людей. Журнал вирусологии 80: 7590–7599.
    11. 11. Саенс Р.А., Куинливан М., Элтон Д., Макрэ С., Бланден А.С. и др. (2010) Динамика вирусной инфекции и патологии гриппа. Журнал вирусологии 84: 3974–83.
    12. 12. Митчелл Х., Левин Д., Форрест С., Бошемин САА, Типпер Дж. И др. (2011) Более высокий уровень эффективности репликации вируса пандемического гриппа 2009 (h2N1), чем у сезонных и птичьих штаммов: кинетика из культуры эпителиальных клеток и компьютерное моделирование.Журнал вирусологии 85: 1125–35.
    13. 13. Pawelek KA, Huynh GT, Quinlivan M, Cullinane A, Rong L, et al. (2012) Моделирование динамики вирусной инфекции гриппа внутри хозяина, включая иммунные ответы. PLoS Computational Biology 8: e1002588.
    14. 14. Luo S, Reed M, Mattingly JC, Koelle K (2012) Влияние иммунного статуса хозяина на внутреннюю и популяционную динамику антигенного иммунного бегства. Журнал Королевского общества Интерфейс 9: 2603–13.
    15. 15.Heldt FS, Frensing T, Reichl U (2012) Моделирование внутриклеточной динамики репликации вируса гриппа для понимания контроля синтеза вирусной РНК. Журнал вирусологии 86: 7806–17.
    16. 16. Кумбс Д., Гилкрист М.А., Болл С.Л. (2007) Оценка важности давления отбора внутри и между хозяевами на эволюцию хронических патогенов. Theor Popul Biol 72: 576–91.
    17. 17. Волков И., Пепин К.М., Ллойд-Смит Дж.О., Банавар Дж. Р., Гренфелл Б.Т. (2010) Синтез селективного давления внутри хозяина и на уровне популяции на вирусные популяции: влияние адаптивного иммунитета на ускользание от вирусного иммунитета.Журнал Королевского общества Интерфейс 7: 1311–8.
    18. 18. Park M, Loverdo C, Schreiber SJ, Lloyd-Smith JO (2013) Множественные шкалы отбора влияют на эволюционное появление новых патогенов. Philos Trans R Soc Lond, B, Biol Sci, 368: 20120333.
    19. 19. Russell CA, Fonville JM, Brown AEX, Burke DF, Smith DL, et al. (2012) Возможность эволюции вируса гриппа A / H5N1, передаваемого через дыхательные пути, в организме млекопитающего-хозяина. Наука 336: 1541–7.
    20. 20.Ри С.Ю., Гонсалес М.Дж., Кантор Р., Беттс Б.Дж., Равела Дж. И др. (2003) База данных обратной транскриптазы и протеазных последовательностей вируса иммунодефицита человека. Исследование нуклеиновых кислот 31: 298–303.
    21. 21. Гедин Э., Холмс Э.С., ДеПасс СП, Пинилла Л.Т., Fitch A и др. (2012) Наличие устойчивых к осельтамивиру пандемических минорных вариантов A / h2N1 до медикаментозной терапии с последующим отбором и передачей. Журнал инфекционных болезней 206: 1504–11.
    22. 22. PR Мерсии, Бэйли Дж.Дж., Дэйли Дж., Элтон Д., Джервис К. и др.(2010) Эволюционная динамика вируса гриппа лошадей внутри и между хозяевами. Журнал вирусологии 84: 6943–54.
    23. 23. Murcia PR, Baillie GJ, Stack JC, Jervis C, Elton D, et al .. (2013) Эволюция вируса гриппа лошадей у ​​вакцинированных лошадей. Журнал вирусологии: 1–5.
    24. 24. Ллойд LE, Jonczyk M, Jervis CM, Flack DJ, Lyall J и др. (2011) Экспериментальная передача вируса птичьего гриппа h2N1 свиней между иммунологически неопытными и вакцинированными свиньями.Грипп и другие респираторные вирусы 5: 357–64.
    25. 25. PR Мерсии, Хьюз Дж., Баттиста П., Ллойд Л., Бэйли Дж. Дж. И др. (2012) Эволюция евразийского вируса птичьего гриппа у наивных и вакцинированных свиней. Патогены PLoS 8: e1002730.
    26. 26. Эйген М., Шустер П. (1977) Гиперцикл. Принцип естественной самоорганизации. Часть A: Возникновение гиперцикла. Naturwissenschaften 64: 541–65.
    27. 27. Boni MF, Zhou Y, Taubenberger JK, Holmes EC (2008) Гомологичная рекомбинация очень редка или отсутствует в вирусе гриппа человека А.Журнал вирусологии 82: 4807–11.
    28. 28. Lam TTY, Chong YL, Shi M, Hon CC, Li J и др. (2013) Систематический филогенетический анализ вируса гриппа А позволяет выявить множество новых мозаичных сегментов генома. Инфекция, генетика и эволюция: журнал молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики инфекционных болезней 18: 367–378.
    29. 29. Miralles R, Gerrish PJ, Moya A, Elena SF (1999) Клональная интерференция и эволюция РНК-вирусов. Наука 285: 1745–7.
    30. 30.Strelkowa N, Lässig M (2012) Клональное вмешательство в эволюцию гриппа. Генетика 192: 671–82.
    31. 31. Иллингворт CJR, Мустонен В. (2012) Компоненты отбора в эволюции вируса гриппа: эффекты сцепления превосходят неотъемлемый отбор. Патогены PLoS 8: e1003091.
    32. 32. Иллингворт CJR, Мустонен В. (2011) Различение мутаций водителя и пассажира в эволюционной истории, классифицированных по интерференции. Генетика 189: 989–1000.
    33. 33. Depledge DP, Palser AL, Watson SJ, Lai IYC, Gray ER и др. (2011) Специфический захват и полногеномное секвенирование вирусов из клинических образцов. PLoS ONE 6: e27805.
    34. 34. Скумс П., Манкузо Н., Артеменко А., Торк Б., Мандою И. и др. (2013) Реконструкция структуры вирусной популяции на основе данных секвенирования следующего поколения с использованием мульти-товарных потоков. BMC Bioinformatics 14 Приложение 9: S2.
    35. 35. Kass RE, Raftery AE (1995) Байесовские факторы.Журнал Американской статистической ассоциации 90: 773–795.
    36. 36. Brownlee GG, Fodor E (2001) Прогнозируемая антигенность гемагглютинина пандемии испанского гриппа 1918 года предполагает птичье происхождение. Philos Trans R Soc Lond, B, Biol Sci 356: 1871–6.
    37. 37. Illingworth CJR, Mustonen V (2012) Метод вывода положительного отбора по динамике маркеров в бесполой популяции. Биоинформатика (Оксфорд, Англия) 28: 831–7.
    38. 38. Фолл М., По Ю.П., Рензетт Н., Феррер-Адметлла А., Банк С и др.(2014) Устойчивость к лекарственным препаратам вируса гриппа: популяционная генетическая перспектива с выборкой во времени. PLoS Genetics 10: e1004185.
    39. 39. Hurst LD (2002) Отношение Ka / Ks: диагностика формы эволюции последовательности. Тенденции Genet 18: 486.
    40. 40. Кряжимский С.А., Плоткин Ю.В. (2008) Популяционная генетика dN / dS. PLoS Genetics 4: e1000304.
    41. 41. Mugal CF, Wolf JBW, Kaj I (2013) Почему время имеет значение: эволюция кодонов и временная динамика dN / dS.Mol Biol Evol 31: 212–31.
    42. 42. Fonville JM, Burke DF, Lewis NS, Katzelnick LC, Russell CA (2013) Количественная оценка преимущества пригодности замен полимеразы в вирусах гриппа A / H7N9 во время адаптации к человеку. PLoS ONE 8: e76047.
    43. 43. Кимура М. (1962) О вероятности фиксации мутантных генов в популяции. Генетика 47: 713–719.
    44. 44. Franke J, Klözer A, de Visser JAGM, Krug J (2011) Эволюционная доступность мутационных путей.PLoS Computational Biology 7: e1002134.
    45. 45. Кряжимский С.А., Базыкин Г.А., Душофф Дж. (2008) Естественный отбор для использования нуклеотидов в синонимичных и несинонимичных сайтах в генах вируса гриппа А. Журнал вирусологии 82: 4938–45.
    46. 46. Zanini F, Neher RA (2013) Количественная оценка отбора против синонимичных мутаций в эволюции env ВИЧ-1. Журнал вирусологии 87: 11843–11850.
    47. 47. Miao H, Hollenbaugh JA, Zand MS, Holden-Wiltse J, Mosmann TR и др.(2010) Количественная оценка раннего иммунного ответа и кинетики адаптивного иммунного ответа у мышей, инфицированных вирусом гриппа А. Журнал вирусологии 84: 6687–98.
    48. 48. Рузин И.М., Родриго А., Коффин Дж. М. (2001) Переход между стохастической эволюцией и детерминированной эволюцией в присутствии отбора: общая теория и приложение к вирусологии. Обзоры микробиологии и молекулярной биологии 65: 151–185.
    49. 49. Парвин Дж. Д., Москона А., Пан В. Т., Лейдер Дж. М., Палезе П. (1986) Измерение скорости мутаций вирусов животных: вируса гриппа А и полиовируса типа 1.Журнал вирусологии 59: 377–83.
    50. 50. Санхуан Р., Небот М.Р., Кирико Н., Мански Л.М., Белшоу Р. (2010) Частота вирусных мутаций. Журнал вирусологии 84: 9733–9748.
    51. 51. Сидоренко Ю., Райхл Ю. (2004) Структурированная модель репликации вируса гриппа в клетках MDCK. Biotechnol Bioeng 88: 1–14.
    52. 52. Meyerhans A, Vartanian JP, Wain-Hobson S (1990) Рекомбинация ДНК во время ПЦР. Nucleic Acids Res 18: 1687–91.
    53. 53. Шао В., Больц В.Ф., Шпиндлер Дж. Э., Кирни М. Ф., Мальдарелли Ф. и др.(2013) Анализ 454 ошибок секвенирования, источников ошибок и рекомбинации артефактов для обнаружения низкочастотных мутаций лекарственной устойчивости в ДНК ВИЧ-1. Ретровирология 10: 18.
    54. 54. Sharp PM, Bailes E, Gao F, Beer BE, Hirsch VM и др. (2000) Происхождение и эволюция вирусов СПИДа: оценка временного масштаба. Труды Биохимического общества 28: 275–282.
    55. 55. Асеведо А., Бродский Л., Андино Р. (2014) Мутационные и фитнес-ландшафты РНК-вируса, выявленные с помощью популяционного секвенирования.Nature 505: 686–690.
    56. 56. Таубенбергер Дж. К., Рид А. Х., Лоуренс Р. М., Ван Р., Джин Дж. И др. (2005) Характеристика генов полимеразы вируса гриппа 1918 г. Природа 437: 889–893.
    57. 57. Marshall N, Priyamvada L, Ende Z, Steel J, Lowen AC (2013) перегруппировка вируса гриппа происходит с высокой частотой при отсутствии несоответствия сегментов. Патогены PLoS 9: e1003421.
    58. 58. Stack JC, Murcia PR, Grenfell BT, Wood JLN, Holmes EC (2013) Определение передачи вируса гриппа A между хозяевами с использованием моделей генетической изменчивости внутри хозяина.Proc Biol Sci 280: 20122173.
    59. 59. Ричард М., Шраувен Э.Дж., де Грааф М., Бестеброер Т.М., Спронкен М.И.Дж. и др. (2013) Ограниченная воздушно-капельная передача вируса гриппа A H7N9 между хорьками. Nature 501: 560–3.
    60. 60. Holmes EC, Moya A (2002) Применима ли концепция квазивидов к РНК-вирусам? Журнал вирусологии 76: 460–462.
    61. 61. Wilke CO (2005) Теория квазивидов в контексте популяционной генетики. BMC Evol Biol 5: 44
    62. 62.Más A, López-Galíndez C, Cacho I, Gómez J, Martínez MA (2010) Неоконченные истории о вирусных квазивидах и дарвиновских взглядах на эволюцию. Журнал молекулярной биологии 397: 865–77.
    63. 63. Лауринг А.С., Андино Р. (2010) Теория квазивидов и поведение РНК-вирусов. Патогены PLoS 6: e1001005.
    64. 64. Шварц G (1978) Оценка размерности модели. Анналы статистики 6: 461–464.

    Универсальная геномная амплификация вируса гриппа B упрощает секвенирование, диагностику и обратную генетику

    ВВЕДЕНИЕ

    Вирусы гриппа принадлежат к семейству Orthomyxoviridae и содержат геном с одноцепочечной и сегментированной РНК с отрицательным смыслом.Они делятся на три типа (вирусы гриппа A, B и C), изначально основанные на антигенной специфичности нуклеопротеина (NP) и матричного белка (M) (1, 2). Природа их сегментированного генома обеспечивает основу для частой генетической перегруппировки между различными вирусами одного и того же типа, что играет важную роль в эволюции новых штаммов. Вирус гриппа B (IBV) является важным патогеном человека, связанным с избыточной госпитализацией и смертностью. (3). Вирус ИБК и гриппа А являются причиной эпидемий, которыми ежегодно заражаются от 250 до 500 миллионов человек, что приводит к смерти от 250 000 до 500 000 человек и значительным социально-экономическим потерям (4–7).В среднем на ИБК приходится> 20% ежегодных инфекций гриппа, а в некоторые сезоны этот показатель возрос до ~ 60% (8). В течение сезона гриппа 2012-2013 гг. В Соединенных Штатах ИБК стали причиной 60% случаев смерти детей, связанных с гриппом, несмотря на то, что на их долю приходилось только 29% лабораторно подтвержденных инфекций (9). Две антигенно и генетически разные линии ИБК (B / Victoria) / 2/87-like и B / Yamagata / 16/88-like), коциркулирующие с 1980-х годов (10, 11), и их геномы постоянно меняются, чтобы избежать иммунного ответа человека (явление, известное как антигенный дрейф).Компоненты современной вакцины против сезонного гриппа обычно содержат антигены гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) вируса h2N1, вируса h4N2 и вируса линии B / Victoria или B / Yamagata. Ключевым фактором, влияющим на тяжесть болезни ИБК в развитых странах, является появление новых штаммов / линий ИБК, что приводит к существенному несоответствию между появляющимся штаммом (ами) и штаммом, выбранным в качестве посевного материала вакцины (например, несовпадение в пяти из 10 сезонов гриппа с 2001 по 2011 год), что снижает эффективность вакцины (8).Это затруднительное положение привело к недавней разработке четырехвалентных вакцин некоторыми производителями, в которые включены два штамма IBV, представляющие линии как Yamagata, так и Victoria. Однако даже в пределах определенной линии антигенный дрейф генов HA / NA продолжает генерировать новые варианты, которые избегают нейтрализации иммунным ответом человека, и трудно выбрать / предсказать лучший штамм (ы) для включения в вирус гриппа. вакцина (ы) для обеспечения антигенной перекрестной реактивности против всех одновременно циркулирующих штаммов Yamagata и / или Victoria.Крайне важно проводить геномные исследования для улучшения вакцин, диагностики и лечения, а также для лучшего понимания репликации и патогенеза IBV. Полное секвенирование генома и анализ тысяч IBV необходимы, чтобы понять эволюцию IBV и лучше предсказать родословную и репрезентативные штаммы IBV, которые будут преобладать в предстоящие сезоны гриппа. Эта информация используется различными вычислительными подходами, которые помогают при выборе вакцины. Например, анализ геномной последовательности выявляет изменения последовательности, ответственные за ускользание от иммунной системы, с помощью вариантов антигенного дрейфа, которые демонстрируют повышенную приспособленность в человеческой популяции и определяют геопространственный / временной поток генов в эволюционно успешных генных сегментах.Быстрое секвенирование большого количества циркулирующих вирусов перед проводимыми раз в два года совещаниями ВОЗ по составу вакцин против вируса гриппа предоставит должностным лицам общественного здравоохранения и ученым более качественные наборы данных, необходимые для выбора лучших штаммов для двухгодичных вакцин. Крупномасштабное геномное секвенирование IBV играет центральную роль в разработке будущей геномной диагностики, которая одновременно идентифицирует генотипические маркеры антигенного ускользания, противовирусной устойчивости и / или вирулентности, и помогает фундаментальным исследованиям во многих критических изучаемых областях.К сожалению, по сравнению с более чем 10 000 полных геномов (полных кодирующих областей для всех восьми сегментов) вирусов гриппа A (IAV), доступных в GenBank, по состоянию на февраль 2013 г. депонировано всего несколько сотен геномов IBV. Нехватка геномных последовательностей IBV препятствует исследованиям и разработке новых вакцин против ИБК, что побудило нас к созданию крупномасштабного проекта по секвенированию ИБК в рамках проекта секвенирования генома вируса гриппа, спонсируемого Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) (http: // gsc.jcvi.org/projects/msc/influenza/). Основная трудность высокопроизводительного секвенирования для генетически разнообразных IBV, которые постоянно развиваются (т.е. для которых необходимо постоянно модифицировать олигонуклеотидные праймеры), заключается в отсутствии универсального, эффективного, надежного и экономичного метода преобразования восьми сегментов геномной РНК в двухцепочечная ДНК (дцДНК) в одном реакционном сосуде. Чтобы решить эту проблему, мы разработали новые стратегии геномной амплификации IBV (IBV-GA) (IBV-GA / GA1 / GA2), которые позволяют секвенировать с помощью всех платформ секвенирования следующего поколения (NGS).Разработанные подходы IBV-GA также идеально подходят для расширенной диагностики на основе генома (например, пиросеквенирования для выявления устойчивости к Тамифлю), которые разрабатываются для использования в персонализированной медицине и для быстрого создания рекомбинантных вирусов для вакцин или исследований.

    Это исследование демонстрирует универсальные подходы к амплификации полных сегментированных геномов прошлых, настоящих и будущих IBV в одном реакционном сосуде, независимо от штамма вируса. Оптимизированная методика (IBV-GA2) достаточно надежна для использования с материалом клинических мазков, и ее можно масштабировать для использования в высокопроизводительной обработке.Наконец, праймеры IBV-GA / GA2 были также разработаны для облегчения клонирования геномных сегментов IBV в наши индивидуализированные плазмиды обратной генетики для спасения вирусов, что ускорит создание посевного материала вакцины и фундаментальные исследования.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Клетки.

    Клетки 293T почек эмбриона человека (HEK-293T) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки собачьей почки Madin-Darby (MDCK) поддерживали в минимальной эссенциальной среде (MEM) с добавлением 5% FBS.

    Вирусы и клинические образцы.

    образцов IBV было получено из разных лабораторий в США и других странах для секвенирования в Институте Дж. Крейга Вентера (JCVI) в рамках проекта по секвенированию генома гриппа, спонсируемого NIH / NIAID (http: //www.niaid.nih .gov / labsandresources / resources / dmid / gsc / influenza /). Перед отправкой в ​​JCVI образцы были подтверждены на наличие IBV с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-PCR) или других методов в сотрудничающих лабораториях.Образцы были получены в различных форматах, включая (i) образцы мазков из носоглотки или ротоглотки, взятые у пациентов, (ii) вирусы, размноженные в клетках MDCK или других клетках, (iii) вирусы, размноженные в куриных яйцах с эмбрионами, и (iv) РНК, выделенные из вируса. -содержащие образцы.

    Анализ концов IBV и дизайн праймера.

    Все последовательности IBV, доступные в основных вирусных базах данных (Influenza Research Database [12], Influenza Virus Resource [13] и EpiFlu database [14]), были загружены и выровнены с помощью программы MUSCLE (15).Было произведено восемь выравниваний последовательностей для каждого из сегментов геномной РНК. Логотипы последовательностей, основанные на частотах нуклеотидов в каждом положении, были нанесены на график для 20 положений нуклеотидов на 5′-конце и 20 положений нуклеотидов на 3′-конце каждого выравнивания с помощью приложения WebLogo (рис. 1) (16). разработан на основе согласованных последовательностей концов с учетом естественных вариаций. Было протестировано множество различных версий праймеров, включая различные 5′-хвосты, разную длину комплементарности и различные соотношения каждой пары праймеров.Текущие оптимизированные версии праймеров IBV-GA и их концентрации показаны в Таблице 1.

    ТАБЛИЦА 1

    ТАБЛИЦА 1 Универсальный набор праймеров IBV-GA2 -94 9233 923AGCACTT-3 ‘ 923AGUn 923 923 995 923 923G 995 995G 995 995G 995 995 995 995 995 923 995 03 795 940110005 a

    Подчеркнутые нуклеотиды соответствуют геному IBV.

    b

    Повторное замораживание и оттаивание рабочего материала снижает эффективность ОТ-ПЦР.

    Амплификация и оптимизация генома IBV.

    Большинство образцов требовали выделения РНК в JCVI. РНК выделяли из 100–200 мкл культурального супернатанта, аллантоисной жидкости или образцов клинических мазков с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, Валенсия, Калифорния) или набора вирусной РНК ZR-96 (Zymo Research, Ирвин, Калифорния). РНК элюировали 30 мкл воды, свободной от РНКазы, и служили матрицей для одностадийной RT-PCR-амплификации всего генома IBV в одной реакции.

    В процессе оптимизации несколько наборов праймеров были протестированы на их способность амплифицировать весь геном на основе консервативных концов вирусной РНК IBV (вРНК), которые образуют промотор для вирусной РНК-полимеразы. Первоначальный набор праймеров IBV-GA включал три праймера с хвостами, которые были комплементарны или идентичны универсально консервативным 9 и 10 нуклеотидам (Uni9 и Uni10) на концах всех сегментов геномной РНК IBV. Праймеры (Uni9 / FluB1 [5′-TTGGGGGGGAGCAGAAGC-3 ′], Uni10 / FluB1T [5′-CGCCGGGTTATTAGTAGTAACA-3 ′] и Uni10 / FluB1A [5′-CGCCGGTTATTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGAARMM) имели молярное соотношение a 2: 1: 1.В модифицированном наборе праймеров IBV-GA1 используются праймеры с четырьмя хвостами (Uni9 / FluB1G [5′-GTCAGACTCAGTCAGCAGAAGCG-3 ′], Uni9 / FluB1A [5′-GTCAGACTCAGTCAGCAGAAGCA-3 ′], Uni10 / FluB1T и Uni10 / смешанные), которые были смешанными. при мольном соотношении 4: 6: 5: 5. Все 5′-хвосты были разработаны для повышения температуры отжига в ПЦР, а 5′-хвосты, используемые для реакций IBV-GA и IBV-GA2 (Таблица 1), идентичны последовательностям промотора или терминатора РНК-полимеразы I в обратном порядке. -genetics для клонирования на основе рекомбинации.Оптимизированный конечный набор праймеров IBV-GA2 и протокол были следующими: 3 мкл РНК и 2 мкл смеси универсальных праймеров IBV-GA2 (таблица 1) использовали в 25-мкл реакционном объеме одностадийного RT-теста SuperScript III. -Система ПЦР с высокоточной ДНК-полимеразой Platinum Taq (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) (Таблица 2). Параметры температурного цикла: 45 ° C в течение 60 минут, 55 ° C в течение 30 минут, 94 ° C в течение 2 минут, а затем 5 циклов: 94 ° C в течение 20 секунд, 40 ° C в течение 30 секунд и 68 ° C в течение 20 секунд. 3 мин 30 с, затем 40 циклов 94 ° C в течение 20 секунд, 58 ° C в течение 30 секунд и 68 ° C в течение 3 минут 30 секунд с последним продлением при 68 ° C в течение 10 минут.

    ТАБЛИЦА 2

    ТАБЛИЦА 2 Универсальная установка для ОТ-ПЦР IBV-GA2
    Праймер Последовательности a Amt (мкл) из каждого 10 мкМ олиго
    B-PBs-UniF 5′-GGGGGGAGCAGAAGCGGAGC-3 ‘ 100
    B-PBT-UniR’2396
    B-PBT-UniR’2396 923GAGT9
    B-PA-UniF 5′-GGGGGGAGCAGAAGCGGTGC-3 ‘ 50
    B-PA-UniR 5′-CCGGGTTATTAGTAGAAAC23 9F23 995 -23 995 923 9F23AN 9F23AN 9F23 995 -23 995 923AN 923ANGTGC23 995 -23AN 9F23AN 9239 -23 995 -23 995 -23 9F23AN 923 995 923 995 5′-GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC-3 ‘ 100
    B-HANA-UniR 5′-CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC-3′ ‘100 GB G 9239GAC 923 9239 9239 9239 9239G 9239 9239 60
    B-NP-UniR 5′-CCGGGTTATTAGTAGAAACAACAGC-3 ‘ 60
    BM-Uni3F 5′-GGGGGGAGCAGCAGAAGCACGCACTT-323 923 923 923 923 923 923 923 923 923 Uni3 923 923 923 Uni -GGGGGGAGCAGAAGCAGGCACTT-3 ‘ 30
    BM-Uni3R 5′-CCGGGTTATTAGTAGAAACAACGCACTT-3′ 60 60
    B-NS-Uni3R 5′-CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGGATT-3 ‘ 50
    FluB Универсальный коктейль праймеров Рабочий запас 925 (смешайте праймеры, указанные выше) 795 94011
    RT смесь
    Реагенты a Amt (мкл)
    На реакцию На 100 реакций, обработанных
    ddH 2 O 7,0 700
    2 × буфер RT-PCR 12,5 1,250
    IBV-GA смесь праймеров 2,0 200
    0.5 50
    Вирусная РНК 3,0 Добавить по отдельности

    a

    DEPC, диэтилпирокарбонат; ddH 2 O, бидистиллированная вода. Каждая аликвота содержала четыре перечисленных реагента в количестве 22 мкл на реакцию.

    Плазмиды обратной генетики для клонирования на основе рекомбинации.

    Двунаправленная обратная генетическая плазмида pDZ (17) была линеаризована эндонуклеазой SapI, и олигонуклеотиды pDZ-A6-Adapt-F (5′-GGGAGCAGAAGCTGCAGTTTCTACT-3 ′) и pDZT-A6-Adapt-R (5′-CTAGTAGTAGTAGCTAGCTAGTAGCTAGTAGTAGTAGTCA-R (5′- 3 ‘) были отожжены и лигированы в линеаризованную плазмиду pDZ для создания плазмиды pBZ66A12, в результате чего между промотором и терминатором РНК-полимеразы I образовался буфер длиной 22 п.н. (см.рис.4А). Чтобы приспособить вариацию последовательности A / U в шестом положении на 5′-конце вРНК, олигонуклеотиды pDZ-T6-Adapt-F (5’-GGGAGCAGAAGCTGCAGTTACTACT-3 ‘) и pDZ-T6-Adapt-R (5’ -ATTAGTAGTAACTGCAGCTTCTGCT-3 ‘) отжигали и лигировали в pDZ для получения pBZ66A13. Эти модификации создают стратегию клонирования, которая может быть реализована с использованием коммерчески доступных ферментов (например, In-Fusion) и коротких участков (от 15 до 19 нуклеотидов) идентичности между новыми плазмидами обратной генетики и геномными ампликонами IBV (см.рис.4А).

    Секвенирование, сборка и депонирование нуклеотидов.

    Продукты различных ампликонов IBV-GA были успешно секвенированы с использованием платформ Ion Torrent PGM (Life technologies), HiSeq 2000 и MiSeq (Illumina) и 454 (Roche). Большинство геномов секвенировали с использованием платформ Ion Torrent PGM и / или MiSeq. Для Ion Torrent PGM, ампликоны IBV-GA были разрезаны в течение 15 минут, а адаптеры со штрих-кодом, совместимые с Ion Torrent, были лигированы с разрезанной ДНК с использованием набора библиотеки фрагментов Ion Xpress Plus (Life Technologies).Библиотеки со штрих-кодом были объединены и очищены реагентом AMPure XP (Agencourt). Количественная ПЦР была проведена на объединенных библиотеках штриховых кодов для оценки качества и определения коэффициента разбавления матрицы для эмульсионной ПЦР. Пул был соответствующим образом разбавлен и амплифицирован на частицах Ion Sphere (ISP) с использованием прибора Ion OneTouch (Life Technologies). Пул вирусных библиотек был расширен для положительных по шаблону интернет-провайдеров на приборе Ion OneTouch ES (Life Technologies). Секвенирование было выполнено на Ion Torrent PGM с использованием чипов Ion 316/318.

    Для MiSeq продукты IBV-GA служили шаблоном для создания библиотеки Nextera (Illumina). Вкратце, 25 нг ампликонов ДНК были помечены при 55 ° C в течение 5 минут. Меченую ДНК очищали с помощью набора ZR-96 DNA Clean & Concentrator (Zymo Research) и элюировали 25 мкл буфера для ресуспендирования. Адаптеры секвенирования и штрих-коды Illumina были добавлены к меченой ДНК с помощью ПЦР-амплификации. Два с половиной микролитра каждого индексного праймера из набора Nextera Index (Illumina) использовали в каждой ПЦР (общий объем 35 мкл).Термоциклирование выполнялось в соответствии с протоколом Nextera для создания библиотеки с двойным индексом для каждого образца. После ПЦР-амплификации 10 мкл каждой библиотеки объединяли в пробирку объемом 1,5 мл, и пул дважды очищали реагентом AMPure XP (Agencourt), в 1,2 раза превышающим конечный объем, для удаления всех оставшихся праймеров и небольших фрагментов ДНК. Очищенный пул секвенировали на приборе Illumina MiSeq version 2 с считыванием парных концов 250 пар оснований.

    Последовательности, считанные с платформ NGS, были отсортированы по штрих-коду, обрезаны и de novo собраны с использованием программы CLC bio clc_novo_assemble, и полученные контиги были проверены в пользовательских базах данных полноразмерных нуклеотидов IBV, чтобы найти ближайшую эталонную последовательность для каждый сегмент.Затем все считанные последовательности были сопоставлены с выбранными эталонными сегментами с помощью программы CLC bio clc_ref_assemble_long. В локусах, где данные последовательности Ion Torrent и Illumina согласовывались с вариацией (по сравнению с эталонной последовательностью), эталонная последовательность была обновлена, чтобы отразить разницу. Окончательное отображение всех чтений NGS в обновленные ссылочные последовательности было выполнено с помощью программы CLC bio clc_ref_assemble_long.

    Геномные последовательности> 1000 IBV были депонированы в базе данных GenBank (см. Таблицу S1 в дополнительном материале) в соответствии с Руководством по обмену данными и выпуску данных NIAID / Отдела микробиологии и инфекционных заболеваний (DMID) (http: // www.niaid.nih.gov/LabsAndResources/resources/dmid/gsc/pages/data.aspx). Филогенетический анализ проводится для понимания эволюции IBV (Д. Виджайкришна, Э. Холмс, У. Джозеф, М. Фурмент, Ю. Су, Р. Халпин, Р. Ли, Ю. Денг, В. Гуналан, X. Лин, Т. Стоквелл, Н. Федорова, Б. Чжоу, Н. Спирасон, Д. Кунерт, В. Боскова, Т. Стадлер, А. Коста, Э. Дуайер, К. Хуанг, Л. Дженнингс, В. Роулинсон, С. Салливан, А. Хёрт, С. Маурер-Стро, Д. Вентворт, Дж. Смит и И. Барр, неопубликованные данные).

    Клонирование геномных ампликонов в плазмиды обратной генетики.

    Стратегия клонирования In-Fusion на основе рекомбинации (18, 19) была использована для быстрого клонирования продуктов IBV-GA. Ампликоны IBV-GA2 очищали с помощью набора для очистки QIAquick PCR (Qiagen) и анализировали электрофорезом в агарозном геле. Очищенные ампликоны (от 200 до 400 нг) смешивали со 100 нг PstI-линеаризованных плазмид pBZ66A12 или pBZ66A13 и инкубировали в 10 мкл смеси In-Fusion (система клонирования In-Fusion HD; Clontech, Mountain View, CA) при 50 ° C для 15 мин. Смеси инкубировали на льду в течение 5 мин и 3 мкл использовали для трансформации компетентных клеток Stellar (Clontech).Колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР, и клоны, представляющие каждый сегмент вРНК, очищали и секвенировали.

    Спасение IBV.

    Рекомбинантные IBV были получены котрансфекцией восьми плазмид обратной генетики, несущих кДНК каждого генного сегмента, в сокультуру 293T / MDCK монослоя, как описано ранее (20–22). Вкратце, 0,6 мкг каждой плазмиды смешивали и инкубировали с 15 мкл реагента для трансфекции TransIT-LT1 (Mirus Bio, Мэдисон, Висконсин) при 20 ° C в течение 20 минут, а затем добавляли к 80% конфлюэнтным сокультурам клеток 293T / MDCK в 6- планшеты с лунками.Планшеты для трансфекции инкубировали при 33 ° C с 5% CO 2 в течение от 12 до ∼24 ч, после чего культуральный супернатант заменяли 3 мл среды Opti-MEM I (Life Technologies) с добавлением 0,3% бычьей сыворотки. альбумин (BSA) фракция V (Life Technologies), 3 мкг / мл N -тозил-1-фенилаланин-хлорметилкетон (TPCK) -трипсин (Worthington, Lakewood, NJ) и 1% антибиотик-антимикотик (Life Technologies). Через три дня после трансфекции супернатант собирали и вирус размножали в клетках MDCK при 33 ° C.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Используя IBV-GA1 / GA2, мы успешно амплифицировали и секвенировали геномы более 1000 IBV, собранных за 70 лет и из многих географических регионов. Амплификация / обогащение вирусного генома (ов), присутствующего в образцах, необходимо для одновременного и эффективного секвенирования сотен вирусных геномов с использованием высокопроизводительного NGS. До использования IBV-GA подходов, описанных здесь, образцы IBV подвергали множеству RT-PCR с праймерами, специфичными для последовательности, чтобы преобразовать геномную РНК IBV в перекрывающиеся ампликоны ДНК, и некоторые реакции оказались неудачными из-за несоответствия между заранее разработанными праймерами и праймерами. очень вариабельный вирусный геном.Комбинирование универсального IBV-GA2 с NGS создает конвейер секвенирования, который действительно не зависит от последовательности IBV (т.е. не требуется никакой геномной информации a priori ). Эта система позволила нам за короткий период времени удвоить количество геномов, доступных в GenBank (рис. 5). Ранее мы разработали аналогичную систему для вируса гриппа A, которую мы назвали мультисегментной ОТ-ПЦР (M-RTPCR) (19), и это резко снизило затраты и увеличило нашу пропускную способность (рис. 5). Комбинация праймеров IBV-GA2 (состоящая из праймеров, специфичных для нескольких сегментов) имеет очень высокую чувствительность (от 1 до 10 TCID 50 / реакция) и эффективно амплифицирует IBV из клинических образцов мазков без необходимости выделения или посева вируса.Это важно, потому что РНК-полимераза вируса гриппа подвержена ошибкам, а вирусы у человека существуют как популяция геномов (то есть квазивиды). Условия лабораторного культивирования, используемые для выделения вируса из образца мазка, часто позволяют быстро выявить мутанты, которые не являются репрезентативными для исходного материала мазка. Следовательно, амплификация непосредственно из материала мазка имеет решающее значение для анализа однонуклеотидных полиморфизмов с помощью глубокого NGS, точного антигенного прогнозирования и определения устойчивости к противовирусным препаратам.

    Рис. 5

    Рис. 5. Полные геномы вирусов гриппа A и B, депонированные в GenBank в рамках проекта по секвенированию генома гриппа. На графике показано количество полноразмерных вирусов гриппа A (IAV) (синяя линия) или вируса гриппа B (IBV) (красная линия), депонированных в GenBank в рамках проекта по секвенированию генома гриппа, спонсируемого NIH / NIAID, с момента его начала в 2005 г. Стрелки указывают на начало универсальных процедур геномной амплификации вируса гриппа A (M-RTPCR) (19) или вируса гриппа B (IBV-GA, IBV-GA2).Пары праймеров в коктейле IBV-GA2 (таблица 1) являются гибкими и могут также использоваться отдельно для амплификации генов, представляющих особый интерес, таких как сегменты HA и NA (рис. 2C). Этот тип подхода облегчает NGS, который фокусируется на антигенных вариациях и / или устойчивости к лекарствам. Например, плотность вирусов, анализируемых за один запуск NGS, может быть значительно увеличена (например, для секвенирования ∼93 генома IBV или ∼420 пар HA / NA со средним 200-кратным охватом секвенирования требуется 1 полоса MiSeq). Кроме того, пары праймеров IBV-GA2 (таблица 1) в различных комбинациях идеально подходят для расширенной диагностики на основе последовательностей, которая переходит в клиническую диагностику.Например, геномные ампликоны или специфические сегменты IBV могут быть быстро опрошены для одновременного выявления клонов, штаммов, специфических антигенных эпитопов, сигнатур антивирусной чувствительности / устойчивости и / или патогенных детерминант. Стратегии IBV-GA и IBV-GA1, которые могут быть использованы для амплификации геномов IBV из образцов с более высокими титрами облегчить секвенирование дополнительных нуклеотидов в нетранслируемых областях (UTR). Преимущество стратегий IBV-GA / GA1 состоит в том, что они генерируют информацию о последовательности, соответствующую почти полному сегменту вРНК (т.е.(например, очень мало нуклеотидов [9 или 10] включены праймерами в высококонсервативную область), что важно, потому что UTRs vRNA вируса гриппа играют критическую роль в транскрипции мРНК, репликации vRNA и морфогенезе вириона. Таким образом, желательно определять неконсервативные последовательности UTR без необходимости выполнения дополнительных методов, таких как быстрая амплификация концов кДНК или лигирование РНК ОТ-ПЦР (28, 29). Ампликоны, полученные в результате реакций IVB-GA, эффективно клонируются в наши модифицированные плазмиды обратной генетики с использованием стратегий, основанных на рекомбинации, без использования рестрикционных ферментов и лигаз, которые используются в текущих стратегиях.Комбинируя методику IBV-GA и методику клонирования на основе рекомбинации, любые IBV могут быть клонированы в плазмиды обратной генетики и быстро восстановлены. Ранее мы разработали аналогичную стратегию по спасению рекомбинантных IAV непосредственно из мазка за 10–12 дней (19), и это значительно улучшило нашу способность спасать рекомбинантные вирусы и создавать вакцины (19–22).

    В заключение, мы разработали и использовали универсальные методы геномной амплификации IBV с одной реакцией для производства NGS и рекомбинантных вирусов.Эта стратегия снижает затраты, экономит время и сохраняет исходные образцы, сохраняя при этом высокую чувствительность и универсальность. Полная интеграция этой технологии с NGS и плазмидами обратной генетики на основе рекомбинации доказала ее широкое применение и потенциал для оказания значительного влияния на исследования ИБК и производство вакцин.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Мы благодарим P. Blair, D. Bucher и D. Dwyer за предоставленные образцы вируса, использованные в этом исследовании. Мы также благодарим Питера Палезе и Адольфо Гарсиа-Састре за предоставление оригинальной плазмиды обратной генетики pDZ, которую мы модифицировали для создания наших плазмид обратной генетики IBV.

    Это исследование было частично поддержано федеральными фондами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальных институтов здравоохранения, Министерства здравоохранения и социальных служб, в соответствии с контрактом HHSN272200

    7C. Мельбурнский Центр сотрудничества ВОЗ по справочной информации и исследованиям гриппа поддерживается Министерством здравоохранения Австралии.

    B.Z., D.E.W. и X.L. имеют потенциальный конфликт интересов, поскольку они подали заявку на патент США на некоторые из описанных здесь технологий.

    Собачий грипп | Американская ветеринарная медицинская ассоциация

    Возбудитель

    Собачий грипп (CI) или собачий грипп — очень заразная вирусная инфекция, поражающая собак и кошек. Вирусы гриппа принадлежат к семейству Orthomyxoviridae. Собачий грипп является вирусом гриппа типа А и далее идентифицируется на основе состава двух специфических белков в липидном внешнем слое капсида: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время в США идентифицированы два штамма вируса собачьего гриппа: h4N8 и h4N2.

    Вирусы гриппа способны быстро меняться и давать новые штаммы, которые могут инфицировать разные виды. Оба штамма собачьего гриппа, идентифицированные в США, можно отнести к штаммам гриппа, которые, как известно, заражают не собак, а другие виды. В какой-то момент эти вирусы приобрели способность заражать собак и передаваться от собаки к собаке.

    Собачий грипп h4N8 был впервые выявлен во Флориде в 2004 году у гончих борзых. Считается, что этот штамм произошел от штамма конского гриппа h4N8, который перешел с лошадей на собак.С момента обнаружения в 2004 году собачий грипп h4N8 был обнаружен у собак в большинстве штатов США и округе Колумбия.

    Собачий грипп h4N2 был впервые выявлен в США в марте 2015 года после вспышки респираторного заболевания у собак в районе Чикаго. До этого сообщения о собачьем вирусе гриппа h4N2 были ограничены Южной Кореей, Китаем и Таиландом. Первоначально он был обнаружен у собак в Азии в 2006–2007 годах и, вероятно, возник в результате прямой передачи вируса птичьего гриппа собакам — возможно, из числа вирусов, циркулирующих на рынках живых птиц.

    После первоначального диагноза в Чикаго в ряде штатов были зарегистрированы дополнительные случаи собачьего гриппа h4N2. В начале 2016 года группе кошек из приюта в Индиане был поставлен диагноз собачий грипп h4N2. Считается, что вирус передался им от зараженных собак.

    В мае 2017 года собачий грипп h4N2 был диагностирован у собак во Флориде, Джорджии, Северной Каролине, Южной Каролине, Техасе, Кентукки, Теннесси, Миссури, Луизиане и Иллинойсе. Это был тот же штамм h4N2, который вызвал вспышку в 2015 году в Чикаго.

    Нет никаких доказательств того, что какой-либо из штаммов собачьего гриппа (h4N8 или h4N2) может инфицировать людей.

    Трансмиссия

    Собачий грипп передается воздушно-капельным путем или аэрозолями, содержащими выделения из дыхательных путей при кашле, лае и чихании. Собаки, находящиеся в тесном контакте с инфицированными собаками в таких местах, как питомники, грумеры, детские сады и приюты, подвергаются повышенному риску заражения. Собачий грипп может передаваться косвенно через предметы (например, будки, миски для еды и воды, ошейники и поводки) или людей, которые контактировали с инфицированными собаками.Важно очищать и дезинфицировать предметы, которые контактировали с инфицированной собакой, чтобы не подвергнуть других собак воздействию вируса. Точно так же люди, которые контактировали с инфицированной собакой, должны мыть руки и чистить одежду, чтобы избежать распространения вируса.

    Вирус может оставаться жизнеспособным (живым и способным инфицировать) на поверхностях до 48 часов, на одежде в течение 24 часов и на руках в течение 12 часов. Важно внедрить протоколы биобезопасности и процедуры дезинфекции, чтобы снизить риск передачи болезней.

    Инкубационный период

    h4N8 составляет от 1 до 5 дней, при этом клинические признаки в большинстве случаев проявляются через 2–3 дня после контакта. Собаки, инфицированные h4N2, могут начать проявлять респираторные симптомы через 2-8 дней после заражения. Собаки наиболее заразны в инкубационный период и выделяют вирус, даже если у них нет клинических признаков болезни. Некоторые собаки могут не проявлять никаких признаков болезни, но имеют субклиническую инфекцию и выделяют вирус.

    Патология и клинические признаки

    Вирус собачьего гриппа (CIV) инфицирует и размножается внутри клеток дыхательных путей от слизистой носа до концевых дыхательных путей.Воспалительная реакция на инфекцию приводит к риниту, трахеиту, бронхиту и бронхиолиту. Патологический процесс приводит к гибели эпителиальных клеток, выстилающих дыхательные пути, обнажая нижележащую базальную мембрану. Это предрасполагает дыхательные пути к вторичным бактериальным инфекциям, которые вызывают выделения из носа и кашель.

    Практически все собаки, подвергшиеся воздействию вируса собачьего гриппа, становятся инфицированными, примерно у 80% из них развиваются клинические признаки заболевания.Примерно 20% инфицированных собак, у которых нет клинических признаков заболевания, все же могут выделять вирус и распространять инфекцию.

    Как и другие вирусы гриппа млекопитающих, вирус собачьего гриппа вызывает у собак острую респираторную инфекцию. Для собачьего гриппа нет «сезона», и инфекции могут возникать в любое время года. Инфекция вируса гриппа собак часто напоминает инфекционный трахеобронхит собак («собачий кашель»), который вызывается одной или несколькими бактериальными или вирусными инфекциями, включая Bordetella bronchiseptica и вирус парагриппа.

    У большинства инфицированных собак наблюдается легкая форма собачьего гриппа. Наиболее частым клиническим признаком является кашель, который сохраняется от 10 до 21 дня, несмотря на лечение антибиотиками и подавляющими кашель средствами. Больные собаки могут иметь мягкий влажный кашель или сухой кашель, аналогичный кашлю, вызываемому питомником. Также могут наблюдаться выделения из носа и / или глаз, чихание, летаргия и анорексия. У многих собак появляются гнойные выделения из носа и жар (104-105 o F). Выделения из носа обычно вызываются вторичными бактериальными инфекциями, включая Pasteur ella multocida и виды микоплазм.

    У некоторых собак более тяжелое заболевание, и у них проявляются клинические признаки пневмонии, такие как сильная лихорадка (от 104 ° F до 106 ° F) и учащение дыхания и усилия. Рентгенография грудной клетки (рентген грудной клетки) может выявить уплотнение долей легких. Хотя большинство собак выздоравливают без происшествий, сообщалось о случаях смерти из-за h4N2.

    У кошек, инфицированных h4N2, наблюдаются признаки заболевания верхних дыхательных путей, включая выделения из носа, заложенность носа, недомогание, чмокание губами и чрезмерное слюноотделение.

    Диагноз

    Грипп собак нельзя диагностировать только по клиническим признакам (кашель, чихание и выделения из носа), поскольку эти клинические признаки также присутствуют при других респираторных заболеваниях собак. Доступны тесты для диагностики и идентификации штаммов вируса собачьего гриппа. Тесты включают: выделение вируса, иммуноанализы для обнаружения вирусного антигена, ПЦР для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты и серологию на антитела, специфичные к вирусу. ПЦР может быть самым надежным тестом для диагностики собачьего гриппа.Обратитесь в свою диагностическую лабораторию за рекомендациями относительно тестов и сбора образцов.

    Лечение

    Ветеринарная экспертиза необходима для определения вариантов лечения и наилучшего курса лечения. Лечение собачьего гриппа, как и большинства вирусных заболеваний, в основном является поддерживающим. Хорошее содержание и питание могут помочь собакам выработать эффективный иммунный ответ. Большинство собак выздоравливают от собачьего гриппа в течение 2-3 недель. Вторичные бактериальные инфекции, пневмония, обезвоживание или другие факторы здоровья (например,g., беременность, ранее существовавшее заболевание легких, иммуносупрессия, коллапс трахеи и т. д.) могут потребовать дополнительных диагностических и лечебных мероприятий, включая, помимо прочего:

    • Противомикробные препараты для известных или предполагаемых вторичных бактериальных инфекций.
    • Нестероидные противовоспалительные препараты, необходимые для уменьшения температуры и воспаления.
    • Жидкости для коррекции обезвоживания или поддержания гидратации.

    Модификации лечения следует вносить по мере необходимости, в зависимости от реакции на лечение, других факторов здоровья и других факторов, таких как соблюдение требований и возможности владельца / опекуна по уходу за животными.

    Чтобы предотвратить передачу вируса, собак, инфицированных собачьим гриппом h4N2, а также других домашних собак следует изолировать на 4 недели.

    Противовирусные препараты для лечения гриппа одобрены для использования только у людей. Мало что известно об их применении, эффективности и безопасности для собак. Ветеринары, которые используют одобренные лекарства способом, не соответствующим утвержденным инструкциям на этикетке (например, использование противовирусного лекарства, одобренного только для использования у людей), должны соблюдать федеральные правила использования сверхмаркированных лекарств Закона о разъяснении использования лекарственных препаратов для животных (AMDUCA).

    Заболеваемость и смертность

    Вирус собачьего гриппа не получил широкого распространения среди собак, и многие собаки никогда не подвергались воздействию этого вируса. Уровень заболеваемости (количество подвергшихся воздействию животных, у которых развивается болезнь) оценивается в 80%. Смертность (смертность) низкая; менее 10%. Смертельные случаи происходят в основном у собак с тяжелой формой заболевания.

    На сегодняшний день не зарегистрировано ни одного смертельного случая у кошек, инфицированных собачьим гриппом.

    Профилактика и контроль

    Вирус собачьего гриппа может сохраняться в окружающей среде в течение примерно 2 дней и оставаться жизнеспособным на руках и одежде до 24 часов.В ветеринарных учреждениях, интернатах и ​​приютах вирус собачьего гриппа, по-видимому, легко уничтожается дезинфицирующими средствами, обычно используемыми в этих учреждениях, такими как соединения четвертичного аммония (например, хлорид бензалкония), альдегиды, пероксимоносульфат калия, фенолы и отбеливатель (1:30 разведение) растворов. Следует разработать протоколы очистки и дезинфекции, чтобы снизить риск передачи вируса через непрямой контакт с людьми или другими фомитами (например, клетки, миски, смотровые комнаты и т. Д.).

    Все сотрудники должны мыть руки водой с мылом:

    • По прибытии на объект
    • До и после обращения с каждой собакой
    • После контакта со слюной, мочой, фекалиями или кровью собак
    • После очистки клеток
    • Перед едой, в перерывах или выходе из учреждения
    • До и после посещения туалета

    Протоколы изоляции должны строго соблюдаться для собак с клиническими признаками респираторного заболевания.Собак, подвергшихся воздействию КИ или проявляющих респираторные симптомы, не следует доставлять в места, где присутствуют другие собаки, такие как учебные классы, шоу или мероприятия, дневной уход, а также интернаты и приюты до завершения периода изоляции.

    Больных или подвергшихся воздействию собак следует изолировать, желательно в зоне с отдельной подачей воздуха. Рекомендуется период изоляции 4 недели. При обращении с больными животными используйте средства индивидуальной защиты (как минимум халат и перчатки), чтобы избежать загрязнения одежды.Очистите и продезинфицируйте всю одежду (включая обувь), оборудование, поверхности и руки после контакта с собаками с признаками респираторных заболеваний. Владельцы, чьи собаки кашляют или проявляют другие признаки респираторного заболевания, не должны участвовать в мероприятиях с другими собаками или приводить своих собак в помещения, где находятся другие собаки, во избежание заражения их вирусом.

    Ветеринарные врачи должны внедрить протоколы биобезопасности для предотвращения передачи собачьего гриппа между собаками в клинике.Собаки с клиническими признаками респираторного заболевания не допускаются в зал ожидания. Клиентам, возможно, придется подождать в машине со своей собакой, пока персонал клиники не будет готов осмотреть собаку, не рискуя столкнуться с другими собаками. Собаки с подозрением на собачий грипп должны избегать главного входа, а входить и выходить из помещения через другую дверь. Зоны, где осматриваются и обрабатываются потенциально инфицированные собаки, а также все используемые инструменты должны быть тщательно очищены и продезинфицированы после выписки собаки.Персонал должен использовать средства индивидуальной защиты (как минимум перчатки и халат) при осмотре или уходе за собаками с подозрением на собачий грипп.

    Вакцины доступны как от собачьего гриппа h4N8, так и от h4N2. Также доступна двухвалентная вакцина, обеспечивающая защиту от обоих штаммов. В настоящее время нет вакцины против гриппа собак, одобренной для использования у кошек. Вакцинация может снизить риск заражения собак собачьим гриппом. Вакцинация не может полностью предотвратить инфекцию, но может уменьшить тяжесть и продолжительность клинического заболевания.

    Вакцина против гриппа собак — это вакцина для «образа жизни», и она не рекомендуется для каждой собаки. В целом вакцина предназначена для защиты собак, подверженных риску заражения вирусом собачьего гриппа, включая тех, которые участвуют в деятельности со многими другими собаками или содержатся в общественных помещениях, особенно там, где вирус широко распространен. К собакам, которым может быть полезна вакцинация против гриппа, относятся собаки, которые получают вакцину от кашля питомника ( Bordetella / parainfluenza), поскольку группы риска схожи.Владельцы собак должны проконсультироваться со своим ветеринаром, чтобы определить риск заражения своей собаки вирусом собачьего гриппа и подходит ли вакцинация для их собаки.

    Дополнительная информация о собачьем гриппе

    Ресурсы по гриппу собак (Центр продовольственной безопасности и общественного здравоохранения Университета штата Айова)

    Ключевые факты о собачьем гриппе (Центры по контролю и профилактике заболеваний)

    Часто задаваемые вопросы о собачьем гриппе для владельцев домашних животных и ветеринаров (2017) (Колледж ветеринарной медицины Университета Флориды)

    Приютные организации: FAQ по собачьему гриппу (Колледж ветеринарной медицины Университета Флориды)

    Информационный бюллетень о собачьем гриппе (Университет штата Айова)

    Информационный бюллетень о собачьем гриппе h4N2 для ветеринаров (Колледж ветеринарной медицины Университета Флориды)

    Вирус гриппа собак (Ветеринарная диагностическая лаборатория Корнельского университета)

    Вспышка собачьего гриппа в 2015 г. в районе Чикаго (Ветеринарная диагностическая лаборатория Корнельского университета)

    Собачий грипп.com (Merck Animal Health)

    Список литературы

    Meyer M. UF Ветеринары обнаружили у собак новое заболевание. Исследуйте: исследования в Университете Флориды ; 2006: 11. Доступно по адресу: http://www.research.ufl.edu/publications/explore/v11n2/story3.html. По состоянию на 22 апреля 2015 г.

    Crawford C. Собачий грипп: часто задаваемые вопросы владельцев собак. Университет Флориды ; 2009.

    Корнельский университет: Колледж ветеринарной медицины.Возникающие проблемы — Собачий грипп: Резюме теста на вирус собачьего гриппа у собак, не связанных с беговыми дорожками , Центр диагностики здоровья животных .

    Crawford C. Собачий грипп: часто задаваемые вопросы ветеринаров. Университет Флориды ; 2009.

    Государственный университет Айовы. Собачий грипп. Доступно по адресу: www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/canine_influenza.pdf. Доступ 19 августа 2009 г.

    Корнельский университет: Колледж ветеринарной медицины.Возникающие проблемы — вирус собачьего гриппа. Центр диагностики здоровья животных ; 2006.

    Как наука отвечает на эти вызовы

    Пример анализа для определения способности ранее разработанных нейтрализующих антител против исходного вируса нейтрализовать вариант SARS-CoV-2.

    Исследования in vitro исследуют только способность антител нейтрализовать варианты в лаборатории, а не более широкие эффекты других компонентов иммунного ответа, таких как активация Т-клеток.Т-клетки активируют различные части иммунной системы или напрямую убивают вторгающиеся вещества, такие как вирусы и бактерии, и, как было показано, играют ключевую роль в иммунном ответе на SARS-CoV-2. 18-20 Для получения дополнительной информации о том, как оценивается иммунный ответ, вызванный вакцинами, щелкните здесь.

    Также можно проанализировать, как вакцины действуют против новых вариантов, определяя эффективность вакцины в конкретной группе тех, кто заразился одним из новых вариантов SARS-CoV-2 в контексте клинических испытаний.

    Как только исследователи поймут, как иммунный ответ, вызванный вакциной, коррелирует с эффективностью вакцины против новых вариантов, будет легче точно определить эффективность только с помощью анализов нейтрализации.

    Стратегии преодоления утечки вакцин

    Ускользание вакцины — это термин, используемый для описания процесса мутации вируса с образованием варианта, который ускользает от иммунного ответа, вызванного вакцинацией. Этот процесс редок, но его возникновение зависит от таких факторов, как терапевтические цели и частота вирусных мутаций. 21

    Как объяснялось выше, в случае SARS-CoV-2 скорость мутации низкая; однако, поскольку вирус настолько широко распространен, появилось множество его вариантов. Новые варианты могут снизить способность антител нейтрализовать вирус у людей, которые ранее заразились или прошли вакцинацию против COVID-19. Фактически, постоянно наблюдается снижение нейтрализующей способности ранее разработанных антител против южноафриканского варианта. 22,23

    Тем не менее, вакцины позволяют продуцировать множество различных антител и Т-клеток против многочисленных частей белка-шипа, 5,24 , и поэтому ожидается, что определенный уровень защиты все еще должен поддерживаться.Для обеспечения максимального уровня защиты были разработаны стратегии преодоления снижения эффективности вакцины:

    • Схема введения вакцины может быть изменена для увеличения общего иммунного ответа и, в идеале, для обеспечения большей защиты от новых вариантов (например, может быть рассмотрена дополнительная доза бустерной вакцины)
    • Возможна оптимизация исходной вакцины , например, разработка новой версии с обновленным спайковым белком; однако, хотя прямые изменения вакцины могут быть выполнены относительно быстро, потребуются дальнейшие шаги для обеспечения качества, безопасности и, возможно, эффективности новой вакцины (ов)

    Чтобы определить, требуется ли какой-либо из этих подходов, собираются данные эпиднадзора за появляющимися вариантами, чтобы гарантировать использование наилучшей стратегии вакцинации.

    Хотя кажется разумным ожидать, что со временем появятся новые варианты SARS-CoV-2, эксперты согласны с тем, что важно, чтобы нынешние вакцины продолжали вводить как можно большему количеству людей. Это связано с тем, что защита, обеспечиваемая вакцинами, выше, чем риск ускользания вакцины от потенциальных новых вариантов.

    Следующие шаги

    Данные свидетельствуют о том, что имеющиеся вакцины против COVID-19 могут по-прежнему вызывать защитный иммунный ответ против новых вариантов, выявленных на сегодняшний день, однако уровень эффективности, особенно против тяжелых заболеваний, еще не определен. 25 Тесты для анализа всего иммунного ответа, включая Т-клеточный ответ, улучшат понимание ученых о влиянии вариантов на эффективность вакцины. В вакцину могут быть внесены изменения, направленные на новые варианты, и, вероятно, они потребуются, поскольку новые варианты начнут доминировать среди циркулирующих вирусов.

    Сотрудничество между регулирующими органами и государственными инвестициями во всем мире будет иметь важное значение для достижения эффективного развертывания, если такие новые вакцины будут сочтены необходимыми в рамках наших постоянных усилий по прекращению пандемии.

    полных геномных последовательностей высокопатогенного вируса птичьего гриппа H5N1 в образцах вскрытия человека выявляют генетическую изменчивость и адаптивные изменения роста в культурах клеток MDCK

    Полные геномы высокопатогенного вируса птичьего гриппа H5N1 были идентифицированы в замороженных образцах вскрытия легких: трахеи , толстая кишка и кишечные фекалии пациента, умершего от болезни в 2006 году. Филогенетический анализ вирусных геномов показал, что эти вирусы принадлежали к кладе 1 и являлись реассортантами, полученными в результате реассортации вирусов внутри того же клада.Данные секвенирования образцов вскрытия выявили не менее 8 квазивидов вируса H5N1 во всех 4 типах образцов. Эти последовательности сравнивали с последовательностями, полученными из вирусных изолятов, выращенных в клетках почек собак Madin Darby ( MDCK). Изоляты вируса из трахеи, легких и фекалий показали 27 нуклеотидных замен, что привело к изменению 18 аминокислотных остатков. Однако изменений в аминокислотных остатках, определяющих вирулентность вируса, не произошло.Изменения чаще наблюдались в легких, особенно в генах HA и NA . Наше исследование показало, что адаптационные изменения для приспособленности вируса к выживанию в новом виде хозяина (клетки MDCK) могут включать многие гены, например, аминокислотную замену 177G или 177W, прилегающую к рецепторсвязывающим остаткам в глобулярной головке HA1 и замена M315I в PB2. Однако мутационные изменения около рецепторсвязывающего домена могут играть важную роль в определении клеточного тропизма и требуют дальнейшего изучения.

    1. Введение

    В настоящее время вирус гриппа A состоит из 18 подтипов гемагглютинина (HA) и 11 подтипов нейраминидазы (NA). Вирусы различных комбинаций HA и NA, т.е. между h2-h26 и N1-N9, обнаружены у видов птиц [1, 2], а h27N10 и h28N11 являются вирусами, подобными летучим мышам [2–4]. Подтипы, инфицирующие людей, включают вирусы h2N1, h3N2 (уже вымершие) и h4N2. Предпочтение рецепторов для вирусов птичьего гриппа (AI) и вирусов гриппа человека различно. Вирусы птиц предпочитают рецепторы эпителиальных клеток, содержащие α 2,3-галактозную сиаловую кислоту ( α 2,3 гал-SA).Напротив, вирусы человека предпочитают эпителиальные клетки, содержащие α 2,6-галактозную сиаловую кислоту ( α 2,6 гал-SA) [5]. Большинство вирусов AI имеют низкую патогенность и вызывают бессимптомную или легкую инфекцию у видов птиц, но некоторые штаммы H5 и H7 являются высокопатогенными. Иногда некоторые птичьи вирусы преодолевают видовой барьер и заражают человека. Смертность от вирусов сезонного гриппа у людей, как правило, минимальна, в то время как смертность от вирусов птичьего гриппа для людей достигает 33% для высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1, которые впервые появились в Гонконге в 1997 г. [6, 7] , 53% во всем мире для вирусов H5N1 HPAI, которые повторно появились с 2003 г. [8], и 39% для вируса H7N9 [9].Таиланд впервые сообщил о вспышке гриппа H5N1 среди домашних птиц и людей в январе 2004 года. Последний случай заболевания среди людей был зарегистрирован в 2006 году, тогда как последняя вспышка среди домашних птиц была в 2008 году. Всего было зарегистрировано 25 случаев заболевания людей, 17 случаев смерти или 68% летальности [8].

    Патология гриппа человека и H5N1 HPAI заметно различается. Инфекции вируса гриппа человека распространяются главным образом на дыхательные пути, тогда как инфекции вируса H5N1 HPAI распространяются за пределы дыхательных путей к органам дистального конца [10].Предыдущие исследователи продемонстрировали присутствие как геномной РНК, так и антигеномной РНК в различных органах, включая легкие, кишечник, селезенку, трахею, мозг, сердце, печень, почки и лимфатические узлы [11-15]. Вирус H5N1 никогда не выделялся из образцов человека за пределами дыхательных путей, за исключением тех, которые были включены в наше исследование. Более того, мы также объявили об обнаружении полногеномных последовательностей вируса H5N1 HPAI в тканях архивных органов мертвого пациента с помощью техники секвенирования следующего поколения (NGS) [16], но анализ последовательности еще не проводился.В этом исследовании аминокислотные последовательности различных вирусных генов из образцов аутопсии были сопоставлены с таковыми из вирусных изолятов, и были определены замены, которые могут быть связаны с адаптацией вируса к репликации в новых видах хозяев.

    2. Материалы и методы
    2.1. Этические вопросы

    Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом медицинского факультета больницы Сирирадж Университета Махидол, Таиланд.

    2.2. Пациент с вирусом H5N1 и клинические образцы

    В августе 2006 года 59-летний мужчина, проживавший в провинции Нонг Буа Лам Фу на северо-востоке Таиланда, был госпитализирован с тяжелой пневмонией, которая позже переросла в острый респираторный дистресс-синдром и полиорганную недостаточность.Несколько попыток диагностировать птичий грипп H5N1 с помощью определения генома потерпели неудачу. Тем не менее, его лечили по стандартной схеме осельтамивира на 16-й день после появления симптомов, когда был получен анамнез контактов с больными и мертвыми цыплятами. Он умер от болезни на 28-й день после начала. Ткани вскрытия и образцы кишечных фекалий собирали для диагностики заболевания путем обнаружения вирусного генома, выделения вируса в клетках MDCK и непрямого иммунофлуоресцентного анализа (IFA). Оставшиеся свежие ткани хранили замороженными при -80 ° C.

    2.3. Лабораторное исследование

    Каждую ткань (трахею, легкое, толстую кишку, селезенку и печень) промывали и обрабатывали индивидуально с помощью отдельных наборов инструментов. Обычную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией проводили с использованием протокола, описанного Poddar [17] и Всемирной организацией здравоохранения [18]. Однако результаты были неубедительными со всеми исследованными образцами тканей, включая образец кишечных фекалий. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA) проводили путем окрашивания мазков-слепков тканей моноклональным антителом к ​​нуклеопротеину гриппа A (Chemicon), и положительные результаты были получены с эпителиальными клетками трахеи и легких.

    Образцы тканей (трахеи, легких, толстой кишки, селезенки и печени) измельчали ​​в среде для роста вирусов (VGM), содержащей минимальную необходимую среду Эрла (EMEM, ThermoFisher) без добавления фетальной бычьей сыворотки, а образцы кишечных фекалий суспендировали в ВГМ. Суспензии образцов центрифугировали, и супернатанты инокулировали на монослои клеток MDCK, поддерживаемые в VGM. Было выполнено три последовательных слепых пассажей, и выделение вируса было успешным с образцами трахеи, легких и фекалий.Эти изоляты вируса H5N1 были названы A / Thailand / NBL1 / 2006-L, A / Thailand / NBL1 / 2006-T и A / Thailand / NBL1 / 2006-F по происхождению образцов из легких, трахеи и фекалий соответственно. Изоляты вируса на пассаже 4 были подвергнуты полному секвенированию генома методом Сэнгера, и данные секвенирования были депонированы в базе данных GenBank (таблица 1).

    PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS A / Таиланд / NBL1 / 2006 (H5N1) -Colon

    Пациент Местоположение Происхождение вируса 1 Имя вируса Сегмент Номер доступа GenBank.

    Мужчина 59 лет Провинция Нонг Буа Лам Фу, северо-восток Таиланда Вскрытие тканевых органов A / Таиланд / NBL1 / 2006 (H5N1) -Легкое MG668928-MG668935
    A / Thailand / NBL1 / 2006 (H5N1) -Trachea PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS MG668920-MG668927
    A / Thailand / NBL1 / 2006 (H5N1) -Фекальный образец PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS MG668912-MG A PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS MG668904-MG668911
    Изоляты вируса A / Thailand / NBL1 / 2006 (H5N1 ) –L 2 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS GQ466176-GQ466183
    A / Таиланд / NBL1 / 2006 (H5N1) –T 3 , PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS KJ

    5-KJ2

    A / Thailand / NBL1 / 2006 (H5N1) –F 4 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS KJ
  • 7-KJ

    4


  • Примечание: 1 полногеномное секвенирование прямых образцов было получено с помощью секвенирования следующего поколения (NGS) с платформой GS Junior (Roche Diagnostics, Basel Швейцария), в то время как полногеномное секвенирование вирусных изолятов было получено методом секвенирования ДНК Сэнгера. 2 Изолят вируса из легких. 3 Изолят вируса из трахеи. 4 Изолят вируса из образца фекалий.

    2.4. Секвенирование нового поколения образцов для прямого вскрытия

    NGS было проведено на образцах тканей после длительного хранения в течение почти 10 лет при -80 ° C. Тотальную РНК экстрагировали из образцов трахеи, легких, толстой кишки и фекалий с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) и очищали с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen).Экстрагированную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием системы синтеза первой цепи SuperScript III (Invitrogen). Затем кДНК использовали в качестве матрицы для амплификации всех 8 сегментов вирусного генома гриппа с использованием Platinum Taq HiFi (Invitrogen). Полный геномный сегмент PB2, PB1, PA, HA, NP и NA (> 1 т.п.н.) был амплифицирован как перекрывающиеся фрагменты, а именно PB2a, PB2b, PB1a, PB1b, PAa, PAb, HAa, HAb, NPa, NPb, NAa и NAb соответственно. Геномные сегменты M и NS были амплифицированы как один сегмент.Нуклеотидные последовательности этих праймеров для секвенирования можно получить по запросу. Реакция ПЦР объемом 50 мкл л состояла из 5 мкл л 10-кратного буфера для ПЦР, 2 мкл мкл 50 мМ MgSO 4 , 1,5 мкл л 10 мМ дНТФ, 2 мкл л каждый по 10 мкл, M прямого и обратного праймеров, 0,2 мкл л Platinum Taq HiFi, 5 мкл л кДНК и дистиллированная вода. ПЦР проводили в термоциклере GeneAmp PCR system 2400 (Applied Biosystems).Реакция состояла из 1 цикла выдержки при 94 ° C в течение 5 минут, за которым следовали 35 циклов амплификации (94 ° C в течение 15 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 68 ° C в течение 2 минут) и заключительный стадия наращивания при 68 ° C в течение 10 минут. Затем амплифицированные продукты ПЦР очищали с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen). Полногеномное секвенирование выполняли в три этапа: подготовка библиотеки, эмульсионная ПЦР (emPCR) и высокопроизводительное секвенирование с использованием платформы GS Junior (Roche Diagnostics). Вкратце, 500 нг каждого амплифицированного фрагмента ДНК, включая PB2a, PB2b, PB1a, PB1b, PAa, PAb, HAa, HAb, NPa, NPb, NAa, Nab, M и NS, были объединены вместе и лигированы к адаптерам с последующей эмульсионной ПЦР. и секвенирование.Четыре библиотеки ДНК с различными штрих-кодами, полученные из образцов трахеи, легких, толстой кишки и фекалий, были созданы с использованием набора GS DNA Rapid Library Preparation kit (Roche) в соответствии с протоколом производителя.

    2,5. Анализ данных NGS

    Исходные данные секвенирования были классифицированы по каждому образцу на основе последовательностей штрих-кода в библиотеках ДНК. Вторичный анализ данных был выполнен с использованием CLC Genomics Workbench версии 8.0.1 (http://www.clcbio.com/). Данные низкого качества () и последовательности адаптеров были обрезаны и удалены из считываний секвенирования.Пройденный фильтр (PF) reads () использовался для картирования и сопоставления с эталонным геномом гриппа A / Thailand / 1 (KAN-1) / 2004 (H5N1) (номер доступа GenBank AY555144-AY555151). Общее количество считываний каждого образца находилось в диапазоне от 100 000 до 200 000, а количество отображенных считываний варьировалось от 98% до 99%. Средняя длина считывания для всех образцов колебалась от 241 до 309 пар оснований. Вирусные последовательности, полученные из каждой ткани, были депонированы в GenBank под номерами доступа от MG668904 до MG668911 для толстой кишки, от MG668920 до MG668927 для трахеи, от MG668928 до MG668935 для легких и от MG668912 до MG668919 для образца фекалий, как показано в таблице 1.Необработанные чтения были депонированы в архиве чтения последовательностей под регистрационным номером BioProject PRJNA494792 [16]. Были исследованы нуклеотидные вариации и рассчитаны процентные доли минорных мутаций в каждом гене. Сигнатура генома, соответствующая относительной частоте аминокислотных остатков для каждого гена, была графически создана с использованием WebLogo (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) [19]. Предсказание мутационных положений в структуре белка HA было исследовано с использованием модели кода PDB: 3FKU [20] и проанализировано с использованием программы UCSF Chimera версии 1.13.1 [21].

    2.6. Построение филогенетического дерева

    Эталонные штаммы с известными генетически кладами были получены из ВОЗ (https://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/h5n1_nomenclature/en/) [22] и баз данных NCBI GenBank (https: // www. .ncbi.nlm.nih.gov). Конкатенированная полная кодирующая последовательность (CDS) из 8 сегментов (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M и NS) и отдельных сегментов вирусов H5N1, выделенных в Таиланде, была проанализирована филогенетически. Последовательности выравнивали с использованием множественного выравнивания последовательностей ClustalW в программе BioEdit версии 7.0.4.1, а филогенетическое дерево было построено с помощью программы MEGA 7.0 (http://megasoftware.net/) [23]. Эволюционные расстояния оценивались с использованием метода объединения соседей и алгоритма максимального совокупного правдоподобия. Надежность дерева объединения соседей оценивалась с помощью анализа начальной загрузки с использованием 1000 повторяющихся наборов данных. Поддерживающее значение начальной загрузки более 80% было показано на узлах каждого кластера.

    2.7. Анализ давления отбора

    Вирусы H5N1 и H5N6 человека, выделенные между 1997 и 2018 гг., Были проанализированы по всем кладам на соотношение несинонимичных (dN) и синонимичных (dS) замен (dN / dS) для каждого кодона с использованием оценочного отбора. для каждого кодона (HyPhy) в рамках модели метода Хасегава-Кишино-Яно в MEGA 7.0 [23].

    3. Результаты
    3.1. Гетерогенность геномов вируса гриппа H5N1 в различных тканевых органах

    В этом исследовании с помощью NGS изучались геномы вируса гриппа H5N1 в четырех видах аутопсийных образцов: трахеи, легких, толстой кишки и кишечных фекалий. Результаты показали, что вирусный геном H5N1 был обнаружен во всех исследованных образцах. Глубокий анализ секвенирования всего генома в каждой ткани продемонстрировал квазивиды вируса. Выравнивание вирусных нуклеотидных последовательностей из этих 4 образцов показало 8 квазивидов в 6 сегментах генов, т.е.е., PB2, PB1, PA, HA, NP и NA, но не в M и NS. В сегменте PB2 присутствовали четыре положения смешанных нуклеотидных остатков. Смешивание A и G было обнаружено в 7 положениях, в то время как смешивание T и G было обнаружено в 1 положении (таблица 2 и рис. S1).

    — NP 923 9628%
    T (47%) 23 23 9223 9223 925

    Сегмент Положение нуклеотида 1 Тип образцов для аутопсии Аминокислотное изменение
    Trachea Trachea
    PB2 945 G A A A M315I
    PB1 549 A (63%) 930 930 930 930 )
    G (39%)
    A (51%)
    G (49%)
    G (52%)
    A (48%)
    PA 1882 A G G G M628V
    HA 1230 G A (62%)
    G (38%)
    G G А (53 %)
    G (47%)
    G G G K150R
    605 G (59%)
    A (41%)
    A A A A A A
    NA 399 (459) 2 T C C T
    706 (763) 2 T T V255F
    723 (780) 2 A A G A 23
  • 96 92
  • Примечание: 1 нумерация нуклеотидов основана на гриппе A / Thailand / 1 (KAN-1) / 2004 (H5N1). 2 Нумерация NA основана на подтипе N2.

    3.2. Адаптация вируса для роста в клетках MDCK

    Три изолята вируса гриппа, полученные из образцов трахеи, легких и фекалий в 4 -м пассаже в клетках MDCK, секвенировали методом Сэнгера. Данные секвенирования были депонированы в базе данных GenBank с 2009 года под номерами доступа, показанными в таблице 1. Последовательности всех 8 вирусных генов этих изолятов были сопоставлены с последовательностями, полученными из соответствующих образцов, определенных NGS.Результат анализа аминокислотной последовательности показал 27 нуклеотидных изменений, что привело к заменам 18 аминокислот в 7 геномных сегментах: PB2, PA, HA, NP, NA, M и NS, как показано на рисунках 1 (a) и 1 (b ) и рис S2.

    Геномная сигнатура вирусов, обнаруженных в образцах вскрытия, продемонстрировала частоту или пропорцию аминокислотных вариаций, соответствующих точечным мутациям, обнаруженным в вирусных изолятах (рис. 1 (b)). Большинство вариаций было более частым с изолятом легких, особенно в сегментах генов HA и NA.Четыре изменения аминокислот наблюдались в домене HA1, который содержал сайт связывания рецептора (RBS) для прикрепления вируса к поверхности клетки-хозяина, определяя тропизм или специфичность клетки-хозяина. Выравнивание аминокислотных последовательностей HA1, полученных из образцов аутопсии, клинических изолятов и вируса клады 1 A / Thailand / 1 (KAN-1) / 2004 (H5N1), показало, что точечные мутации 177G или 177W соседствуют с остатками связывания рецептора. 179H, 186E, 190L и 191Y (рисунок 1 (c)). Аминокислотное положение 177 находилось в головке шаровика, закрытой от RBS, как демонстрирует трехмерная кристаллическая структура (рис. 1 (d)).Вариация последовательности или генетический дрейф в домене HA1 может влиять на связывание рецептора, адаптивное изменение тропизма клетки-хозяина и влиять на вирусные антигенные эпитопы. Мы также обнаружили нуклеотид 945G в PB2 ткани трахеи, в то время как 945A был обнаружен в образцах легких, толстой кишки и фекалий (рис. S1). Это привело к несинонимичной мутации M315I в изоляте вируса из трахеи. Это изменение аминокислоты M315I может быть необходимо для адаптации к росту в клетках MDCK, поскольку 315I был обнаружен в вирусных изолятах из всех видов клинических образцов.

    3.3. Идентификация клады вируса H5N1

    Нуклеотидные последовательности HA наших вирусов H5N1 были проанализированы для идентификации клады против различных референсных штаммов птичьего гриппа H5 ВОЗ, которые вызывали инфекции человека: клада вируса H5N1 0, 1, 2.1, 2.2, 2.3.2 и 2.3. 4 и вирус H5N6 клады 2.3.4.4 [24, 25]. Филогенетический анализ показал, что наши вирусы принадлежали к генетической кладе 1 и были тесно связаны с другими изолятами H5N1 в Таиланде, Вьетнаме и Камбодже (рис. 2).Кроме того, конкатенированные полные кодирующие последовательности 8 сегментированных геномов: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M и NS, а также сегменты HA были генетически проанализированы в отношении вирусов H5N1, циркулирующих в Таиланде у различных видов хозяев с 2004 по 2008. Результат показал, что конкатенированные сегменты PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M и NS вирусов A / Thailand / NBL1 / 2006 в основном напоминали A / Tree sparrow / Thailand / VSMU-14-KR / 2005. клады 1, в то время как геномные последовательности НА больше всего напоминали вирус клады 1 A / Chicken / Kohn Kaen / NIAh430 / 2004 (рис. 3).Это открытие привело к предположению, что наши вирусы являются реассортантами. Затем мы дополнительно филогенетически проанализировали каждый сегмент гена в отдельности. Результат подтвердил, что эти вирусы H5N1 были реассортантами, которые получили 7 генных сегментов: PB2, PB, PA, NP, NA, M и NS из A / Tree sparrow / Thailand / VSMU-14-KR / 2005-подобного вируса и Сегмент гена НА из вируса, подобного A / Chicken / Kohn Kaen / NIAh430 / 2004 (фиг. S3).


    3.4. Генетическая изменчивость в кладах вируса H5

    Сравнивались аминокислотные последовательности HA в кладах вирусов H5N1 и H5N6 человека, циркулировавших с 1997 по 2018 год.Результат показал генетическую изменчивость в положениях 47, 56, 177 и 293 в нашем изоляте легочного вируса. Напротив, последовательности НА из всех 4 образцов аутопсии и изоляты вируса из образцов трахеи и фекалий были высококонсервативными. Однако оценочное отношение несинонимичных (dN) к синонимичным (dS) замен (dN / dS) <1 указывает на отрицательное или очищающее селективное давление этих положений в генетических кладах на основе кодон за кодоном (Таблица 3 ).

  • 96
  • S .2 () V S

    6 dN 9-dS5 23 23

    Клада вируса H5 Аминокислотное положение HA 1
    47 (56) 2 56 (651723)

    3 2
    56 (651723)

    3 2 2
    293 (296) 2

    Clade 0 () V S G N
    G N
    Clade 2.1 () V S G N
    Clade 2.2 () V S G N
    Clade 2.32396 V S G N
    Clade 2.3.4 () V S G N
    Clade 2.3.4.4 () V S S S S S N
    A / Таиланд / NBL1 / 2006 (H5N1) — легкое V S G N
    A / Таиланд / NBL1 / 2006 (H5N1) -Trachea G N
    A / Thailand / NBL1 / 2006 (H5N1) -фекальный образец V S G N
    L1 / Таиланд / NB -Колон V S G N
    A / тайский земля / NBL1 / 2006 (H5N1) –L 3 G R W H
    A / Таиланд / NBL1 / 2006 (H5N1) –T 4 V V V G N
    A / Таиланд / NBL1 / 2006 (H5N1) –F 5 V S G N
    -2,0 -4,5 -5,7
    dN / dS 0,125 0,186 0,100 0,073
    0,28 0,998239623 28 0,99823 28 0, 28 28 0,998

    Примечание: 1 нумерация основана на A / Thailand / 1 (KAN-1) / 2004 (H5N1). 2 Нумерация HA основана на нумерации h4. 3 Изолят вируса из легкого. 4 Изолят вируса из трахеи. 5 Изолят вируса из фекалий.

    3.5. Анализ на детерминанты вирулентности H5

    Аминокислотных остатков в образцах вскрытия и изолятах вируса анализировали после инвентаризации генетических изменений H5N1 [26], как показано в таблице 4. Результат показал, что аминокислотные последовательности во всех образцах вскрытия и Изоляты вируса содержали PQRERRRKKRG в сайте расщепления НА, что указывает на их высокую вирулентность.Остатки 190E, 225G, 226Q, 227S и 228G (нумерация h4) указывают на то, что все вирусы предпочитают рецептор α 2,3-галактозно-связанной сиаловой кислоты птичьего типа. Замена h374Y, которая указывала на устойчивость к осельтамивиру и перамивиру, не присутствовала ни в образцах вскрытия, ни в изолятах вируса, даже несмотря на то, что пациент перед смертью прошел полный курс лечения осельтамивиром. С другой стороны, как образцы вскрытия, так и изоляты вируса содержали замену S31N в белке M2, что указывает на устойчивость к амантадину и римантадину.

    патогенность у мышей 609286 9286 9286 9286 клеток млекопитающих Снижение активности полимеразы 923K клеток 9283A Снижение вирулентности, снижение вирулентности, N3296 9283A Снижение вирулентности у хорьков 92900

    Белок Уменьшение аминокислотной мутации Ассоциация и функция Аминокислота, наблюдаемая при вскрытии / культуре

    63I
    E627K Повышенная эффективность репликации в культуре клеток и повышенная вирулентность у мышей 627K
    Повышенная активность полимеразы и адаптация вируса-хозяина млекопитающих мыши
    Повышенная активность полимеразы
    Вирус H5, передающийся среди хорьков
    M28I, A274T, K526R, I553V, L607V Пониженная активность полимеразы 28M , G309D, T339K , R477G, I495V, A676T Повышенная полимеразная активность, повышенная вирулентность у мышей 89V, 309D, 339K, 477G, 495V, 676T
    PB1 K207R
    Y436H Снижение активности и вирулентности полимеразы у крякв, хорьков и мышей 436Y
    T677M Снижение вирулентности у мышей 677T 3V, 328N, 375N
    V473L, P598L Пониженная активность полимеразы и эффективность репликации 473V, 598L
    PA P14928S35I, R266H, полиамеразы клетки 149S, 266R, 357I, 515T
    NA 49-68 деле ция Повышенная вирулентность у мышей делеция 49-68
    M1 N30D, T139A, T215A Повышенная вирулентность у мышей 30D, 139T, 215A M1 , A30V / T / S, S31N / G Пониженная чувствительность к амантадину и римантадину 26I, 27V, 34G, 30A, 31 N
    NS1 делеция 80-84, P42S, D87E, L982396, L98F2396 Повышенная вирулентность у мышей делеция 80-84, 42S, 87D, 98F, 101M
    ESEV (в домене PDZ) Повышенная вирулентность у мышей ESEV (в домене PDZ)
    4.Обсуждение

    H5 HA в сочетании с различными подтипами NA были наиболее частыми вирусами HPAI, вызывающими инфекции у человека. Самый распространенный подтип, вирус H5N1, вызвал инфицирование людей в 16 странах, что привело к 862 случаям, 455 смертельным исходам или 52,8% после его повторного появления в 2003 году до 9 декабря 2020 года. Последний случай инфицирования человека вирусом H5N1 произошел. в Лаосской Народно-Демократической Республике (Лаосская Народно-Демократическая Республика), о чем было сообщено в ВОЗ 31 октября 2020 г. Инфекция, вызванная вирусом H5N6 у человека, была менее распространена, последний случай был зарегистрирован 1 декабря 2020 г. в Китае [8].Недавно в России в декабре 2020 г. был зарегистрирован первый случай инфицирования человека вирусом H5N8 [27].

    Несмотря на то, что информация о патологии летальных случаев H5N1 весьма ограничена, совпадающие результаты предполагают, что вирус H5N1 HPAI может распространяться и размножаться в органах за пределами дыхательных путей [13, 28, 29]. Более того, об уровне естественной внутренней гетерогенности, частотах мутаций и однонуклеотидных полиморфизмах (SNP) вирусов гриппа A ранее сообщали несколько исследователей [30, 31].Благодаря технологии NGS, доступной в последнее время, это исследование может продемонстрировать полные геномные последовательности H5N1 во всех 4 типах образцов аутопсии: трахеи, легких, толстой кишки и кишечных фекалий. Выравнивание нуклеотидной последовательности показало 8 вирусных квазивидов с 6 генными сегментами, то есть PB2, PB1, PA, HA, NP и NA, но не в M и NS. Метод NGS предоставил подробную информацию о природных аминокислотных остатках, присутствующих в вирусных геномах в каждом образце вскрытия.

    Наши предыдущие попытки выделить вирус из различных тканей аутопсии нескольких пациентов с H5N1 не увенчались успехом.Неспособность выделить вирус из тканей, содержащих геномы вируса гриппа, еще недостаточно изучена. Инфекционные вирусы могут быть уничтожены тканевыми реакциями, возникающими в результате цитокинового шторма на конечной стадии заболевания. Однако наша попытка выделить вирус оказалась успешной у исследуемого пациента, который умер от вирусной инфекции H5N1 HPAI в 2006 году. Вирусы H5N1 были изолированы из образцов трахеи, легких и кишечных фекалий, но не из других органов. Нуклеотидные / аминокислотные последовательности этих вирусных изолятов сравнивали с последовательностями образцов аутопсии.Всего было обнаружено 27 нуклеотидных замен, приводящих к заменам 18 аминокислот. Мутационные изменения, обнаруженные в наших вирусных изолятах, произошли во время пассирования в клетках MDCK, которое продолжалось до 4 -го пассажа до секвенирования. Наше исследование показало, что мутационное изменение чаще встречается у изолята легкого и, в частности, в генах HA и NA. Этот вывод хорошо согласуется с базовой вирусологией гриппа, согласно которой гены HA и NA сильно изменчивы по сравнению с другими генами.В белке НА наших изолятов легочного вируса произошло 4 аминокислотных изменения, которые не присутствовали в других вирусах в этом исследовании и других вирусных кладах. Однако определение естественного отбора показало dN / dS <1, что свидетельствует об отрицательном давлении отбора этих остатков.

    Наше исследование обнаружило точечные мутации 177G в вирусах из трахеи и фекалий и 177W из вируса легких. Согласно трехмерной структуре, позиция 177 аминокислоты не находится на внешней поверхности глобулярной головки НА1; тем не менее, он был рядом с рецептор-связывающими остатками 179H, 186E, 190L и 191Y.Мы предположили, что изменение аминокислоты в положении 177 не может напрямую отвечать за связывание с рецепторами сиаловой кислоты клетки-хозяина. Тем не менее, мы не можем исключить возможность феномена стерического препятствия, возникшего из-за мутационного изменения в позиции 177 аминокислоты, которое может повлиять на соседние аминокислотные остатки при связывании с сайтом связывания рецептора. Более того, мы показали, что изменение аминокислоты M315I может иметь важное значение для адаптации вируса трахеи к росту в клетках MDCK, поскольку 315I был обнаружен в изолятах вируса из всех типов клинических образцов.Наше исследование показало, что изменения аминокислотных остатков в нескольких генах могут потребоваться для вирусной адаптации для роста в новом виде хозяина. Все изоляты вируса различного происхождения могли расти в клетках MDCK и давали титры, сопоставимые с титрами других вирусов H5N1 в нашей лаборатории.

    Филогенетический анализ, основанный на конкатенированных генах PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M и NS или на каждом гене, позволил предположить, что наши вирусы H5N1 были реассортантами, полученными из двух вирусов клады 1: A / Tree sparrow / Thailand / VSMU-14-KR / 2005-подобный вирус и A / Chicken / Kohn Kaen / NIAh430 / 2004-подобный вирус.Наша группа и другие тайские исследователи сообщили о реассортантах, полученных от двух вирусов H5N1 clade 1 у птиц-хозяев [32, 33]. В этом исследовании мы сообщили о реассортантной вирусной инфекции H5N1 у тайского пациента. Тем не менее, реассортантная вирусная инфекция H5N1 у людей ранее сообщалась во Вьетнаме [34, 35] и Камбодже [36].

    Кроме того, аминокислотная замена S31N в белке M2 наших вирусов позволила предположить, что вирус был устойчив к амантадину и римантидину [37], а остаток 274H в белке NA предполагал, что вирусы были чувствительны к осельтамивиру.Этот пациент умер, потому что осельтамивир был назначен поздно, и, кроме того, он был наложен на инфекцию Acinetobacter baumannii . Это исследование также проанализировало детерминанты вирулентности, присутствующие в вирусных геномах H5N1 HPAI, на основании руководящих принципов Центра профилактики и контроля заболеваний [26]. Наши вирусные геномы содержали аминокислотные остатки 89V, 309D, 339K, 477G, 495V, 676T и 627K в PB2 и остатки 30D и 215A в M1, все из которых связаны с усилением вирулентности вируса, повышенной полимеразной активностью или повышенной эффективностью репликации.Напротив, наши вирусные геномы также содержали остатки 598L в PB1 и 149S и 357I в PA, которые связаны со снижением активности полимеразы и эффективности репликации. Тем не менее, не было изменений в аминокислотных остатках, которые определяют вирулентность вируса H5N1 HPAI, в частности, наличие нескольких основных аминокислот в сайте расщепления HA и делецию 20 аминокислот в NA. Изменение адаптации для выживания в новом виде хозяина может включать многие гены. Тем не менее, гены HA и NA, которые определяют детерминанты клеточного тропизма и вирулентности, вероятно, будут более важными, чем другие.

    5. Заключение

    Вирус птичьего гриппа H5N1 диссеминировал и инфицировал органы за пределами дыхательных путей. Это исследование было первым, в котором были представлены полные вирусные геномы в архивных образцах вскрытия: образцы легких, трахеи, толстой кишки и кишечных фекалий. Вирус H5N1 был выделен из легких, трахеи и фекалий с использованием клеток MDCK. Филогенетический анализ продемонстрировал, что этот вирус был реассортантом, в котором сегмент НА от одного вида птиц реассортировался с 7 сегментами другого вируса от разных видов птиц.Исследование также обнаружило новые аминокислотные замены.

    Доступность данных

    Все полученные или проанализированные данные включены в рукопись и дополнительные материалы.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

    Вклад авторов

    P.P. задумал и разработал эксперименты и написал рукопись. К.С. провел эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. J.P. проводил эксперименты.П.Н. проанализировал данные и написал рукопись. С.П. проанализировал данные. М.У., П.А., К.У. предоставил образцы вскрытия. Все авторы прочитали и одобрили представленную рукопись.

    Благодарности

    Авторы хотели бы поблагодарить Phisanu Pooruk и Achareeya Korkusol за их техническую помощь. Это исследование было поддержано исследовательским грантом Университета Махидол и Исследовательским фондом Таиланда для старшего научного сотрудника.

    Дополнительные материалы

    Дополнительные 1. Дополнительный рисунок S1: множественные сопоставления нуклеотидных последовательностей вирусных геномов H5N1 HPAI в образцах вскрытия с использованием NGS. Гены, содержащие вариации / квазивиды, показаны в пустых прямоугольниках.

    Дополнительный 2. Дополнительный Рисунок S2: множественные сопоставления аминокислотных последовательностей вируса H5N1 HPAI, полученных из образцов вскрытия и изолятов вируса. Изменения аминокислот показаны в пустых прямоугольниках.

    Дополнительный 3. Дополнительный рисунок S3: филогенетический анализ отдельных оставшихся 7 генных сегментов, включая PB2, PB1, PA, NP, NA, M и NS из вирусов H5N1 клады 1 в Таиланде.

    HKUMed использует реконструкцию предковой последовательности для выявления эволюционных адаптаций, которые позволяют вирусам птичьего гриппа передаваться через млекопитающих-хозяев — Новости

    01 ноября 2021

    Исследователи из Школы общественного здравоохранения Медицинского факультета LKS Университета Гонконга (HKUMed) в сотрудничестве с Медицинской школой Duke-NUS (Duke-NUS) и Детской исследовательской больницей Св. Джуда (SJCRH) восстановили естественный Эволюционный процесс от птиц к млекопитающим европейского птицеподобного вируса свиного гриппа h2N1 (EA), который в конце 1970-х гг.

    Исследователи обнаружили, что рекомбинантные вирусы, представляющие различные стадии адаптации вирусов гриппа свиней EA, были реконструированы и охарактеризованы для выявления ступенчатых молекулярных изменений вирусной полимеразы и нуклеопротеина, которые способствовали эффективной передаче от свиньи к свинье. Результаты показывают, что стратегическая координация мероприятий по надзору и оценке риска может помочь идентифицировать вирусы с пандемическим потенциалом до того, как они полностью адаптируются к видам млекопитающих.Результаты теперь опубликованы в последнем выпуске Nature Microbiology , ведущего мирового научного журнала. [ссылка на публикацию]

    Вирусы пандемического гриппа, обладающие устойчивой способностью передаваться от человека к человеку, могут возникать после межвидовой передачи вирусов гриппа животных. Понимание эволюционных шагов, предпринимаемых вирусами птичьего гриппа по мере их адаптации к млекопитающим, поможет нам лучше контролировать вирусы зоонозного гриппа с пандемическим потенциалом. Ограниченное количество вирусов гриппа птичьего происхождения успешно прижилось у млекопитающих-хозяев.Эти вирусы предоставляют наилучшие возможности для определения молекулярных детерминант для успешного установления вирусов птичьего гриппа у млекопитающих.

    Методы исследования и выводы

    Под руководством д-ра Yen Hui-ling, доцента отдела лабораторных исследований общественного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения, HKUMed; Д-р Ричард Уэбби, Департамент инфекционных заболеваний SJCRH; и профессора Гэвина Джеймса Смита, Программа новых инфекционных заболеваний Duke-NUS, исследовательская группа стремилась проанализировать и изучить вирусную эволюцию, которая уже произошла в природе, с помощью реконструкции наследственной последовательности на основе информации о последовательности существующего низкопатогенного вируса птичьего гриппа и EA. вирусы свиного гриппа, чтобы получить вирусы, представляющие различные стадии адаптации вируса свиного гриппа EA по мере его перехода от птичьего к свиному хозяину с 1979 года.

    Исследовательская группа продемонстрировала, что эффективная передача вируса свиного гриппа EA у поросят была достигнута за счет ступенчатой ​​адаптации с изменениями прикрепления вируса к сиалиловым рецепторам и повышенным потенциалом репликации в клетках млекопитающих. Мутации в вирусной полимеразе (PB1-Q621R) и нуклеопротеине (NP-R351K), зафиксированные в циркулирующих вирусах свиного гриппа EA после 1983 г., значительно увеличили вирусную трансмиссивность у поросят.

    Научное значение

    Результаты показывают, что реконструкция предковой последовательности является подходящим подходом для исследования межвидовой передачи и адаптации хозяина вновь появившихся патогенов.Эти результаты также предполагают возможность вмешательства на ранней стадии, когда вирусы птичьего гриппа адаптируются к млекопитающим-хозяевам. Стратегии вмешательства включают вирусный надзор на стыке людей и животных, где могут возникать вторичные инфекции, и исследования по оценке риска недавно появившихся вирусов до того, как они полностью адаптируются к новому хозяину. Эти стратегии, скорее всего, будут успешными и представляют собой наилучшее использование ограниченных ресурсов готовности.

    Об исследовательском коллективе

    Это межведомственное совместное исследование возглавил д-р Yen Hui-ling, доцент Отделения лабораторных исследований общественного здравоохранения Школы общественного здравоохранения HKUMed; Д-р Ричард Уэбби, Департамент инфекционных заболеваний SJCRH; и профессор Гэвин Джеймс Смит, программный директор (временно исполняющий обязанности) и профессор программы по новым инфекционным заболеваниям Duke-NUS.Д-р Су Вэнь, научный сотрудник отдела лабораторных исследований общественного здравоохранения, Школа общественного здравоохранения, HKUMed, является ведущим автором исследования. К ключевым местным и зарубежным сотрудникам относятся д-р Майкл Чан Чи-Вай и профессор Малик Пейрис, Школа общественного здравоохранения, HKUMed; Д-р Роберт Г. Вебстер, Департамент инфекционных заболеваний, SJCRH; Д-р Су Чуан-фан Ивонн, Программа по новым инфекционным заболеваниям, Duke-NUS; Д-р Ву Чун-и, Исследовательский центр геномики, Academia Sinica, Тайбэй; Д-р Стефан Плешка, Институт медицинской вирусологии, Университет Юстуса Либиха, Гиссен, Германия; и д-р Kristien Van Reeth, факультет вирусологии, Гентский университет, Бельгия.

    Это исследование было поддержано Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний США (NIAID) в рамках контракта №

    Центров передового опыта по исследованиям и надзору за гриппом (CEIRS). HHSN272201400006C, Схема тематических исследований (Ref: T11-705 / 14N и T11-712 / 19-N) Совета по исследовательским грантам Совета по университетским грантам, Правительство Специального административного района Гонконг и Duke-NUS Signature Research Программа Министерства здравоохранения Сингапура.

    О Школе общественного здравоохранения, HKUMed

    Школа общественного здравоохранения медицинского факультета LKS Университета Гонконга имеет долгую и выдающуюся историю в области просвещения в области общественного здравоохранения и высокоэффективных исследований.Благодаря ведущим мировым исследованиям в области инфекционных заболеваний, а также неинфекционных заболеваний как местного, так и глобального значения, Школа внесла значительный вклад посредством своих исследований и пропаганды в целях улучшения здоровья населения и отдельных лиц как на местном, так и на глобальном уровне. Школа является ведущим центром исследований и обучения в области общественного здравоохранения по гриппу и другим появляющимся вирусам, борьбе с неинфекционными и инфекционными заболеваниями, борьбе против табака, загрязнению воздуха, психоонкологии, поведенческим наукам, наукам о физических упражнениях, эпидемиологии на протяжении всей жизни, населению. психическое здоровье и экономика здравоохранения, планирование и управление услугами здравоохранения.Эта работа послужила источником информации для международной (например, Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, Министерства здравоохранения Канады, Всемирной организации здравоохранения), национальной и местной политики в области общественного здравоохранения.


    1. Реконструкция последовательности предков — мощный инструмент для вывода первичных последовательностей из существующих последовательностей.

    Для СМИ

    Свяжитесь с медицинским факультетом LKS Университета Гонконга по электронной почте (medmedia @ hku.hk).

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.