Последовательность этапов развития заболевания вирусным гриппом: Грипп — симптомы, лечение, протекание

Грипп: симптомы и профилактика

Инфографика от Роскомнадзор и АиФ. Подробнее

Осложнения после перенесенного заболевания

Ежегодные эпидемии гриппа могут оказывать серьезное воздействие на все возрастные группы. Самый высокий риск развития осложнений от гриппа– у детей в возрасте до двух лет, взрослых в возрасте 65 лет и старше и людей любого возраста с определенными заболеваниями (хронические болезни сердца, легких, почек, крови и болезни обмена веществ (например, диабет) или с ослабленной иммунной системой, а также у женщин во время беременности.Болезнь может приводить к госпитализации и смерти, главным образом, среди этих групп высокого риска. Вирус гриппа подавляет иммунные реакции организма, поэтому значительно снижается способность человека противостоять болезням.

Различают несколько основных видов осложнений при гриппе:

Лёгочные: бактериальная пневмония, геморрагическая пневмония, формирование абсцесса лёгкого, образование эмпиемы плевры (воспаление плевральных листков, сопровождающееся образованием гнойного экссудата в плевральной полости), острый респираторный дистресс-синдром.

Внелёгочные: бактериальные риниты, синуситы, отиты, трахеобронхиты, вирусный энцефалит, менингит, неврит, радикулоневрит, поражение печени (синдром Рея), токсико-аллергический шок.

Смертность

От осложнений, вызванных гриппом, умирают по данным ВОЗ от 250 до 500 тыс. человек ежегодно. При этом основная смертность приходится на людей пожилого возраста (у большинства из которых имеются те или иные хронические заболевания), а также на лиц любого возраста, имеющих хронические заболевания.

Грипп при беременности

• Грипп невероятно опасен для беременных женщин и новорожденных детей!
• Пандемия, вызванная вирусом A/h3N2/1957 – летальность среди женщин, находящихся на разных сроках беременности составила более 50%;
• Пандемия, вызванная вирусом A/h2N1/2009 – по разным данным, летальность среди беременных составила в Великобритании – 6,%, в США и Австралии – до 16%, в России (на примере Ульяновской области) – 42,8%;
• Перинатальная смертность среди младенцев, родившихся от заболевших гриппом беременных женщин – 39:1000 по сравнению с тем же показателем у детей от неинфицированных гриппом матерей – 7:1000.

Лечение

До последнего времени лечение гриппа было обычно симптоматическое, в виде жаропонижающих, отхаркивающих и противокашлевых средств, а также витаминов. Теперь с помощью современных противовирусных препаратов от гриппа, доступных в некоторых странах, можно эффективно предотвращать и лечить болезнь. Их необходимо принимать, по возможности, на ранних стадиях болезни (в течение 48 часов после проявления симптомов). Однако у некоторых вирусов гриппа развивается устойчивость к противовирусным препаратам, ограничивающая эффективность лечения.

Неосложнённый грипп не лечат антибиотиками, поскольку антибиотики показаны только для терапии бактериальных инфекций (к которым грипп не относится).

Также следует отметить, что большинство лекарственных препаратов для лечения гриппа первоначально люди принимают самостоятельно, а не по назначению врача. Самолечение в случае с гриппом неприемлемо и приводит к потере драгоценного времени!

Эффективность вакцинации

Эффективным путем профилактики болезни или ее тяжелых последствий является вакцинация. Вот уже более 60 лет имеются и используются безопасные и эффективные вакцины. У здоровых людей противогриппозная вакцина может обеспечить умеренную защиту. Однако среди пожилых людей противогриппозная вакцина может быть менее эффективной в предотвращении заболевания, но может ослабить тяжесть протекания гриппа и уменьшить число случаев развития осложнений и смерти.

К примеру, эффективность прививок против сезонного гриппа A (h2N1) многими отрицается, однако в Екатеринбурге (с 2004 г. прививают против гриппа более 30%, а в 2009 г. — 40,1% населения) среди заболевших гриппом А (h2N1) непривитые составили 91,8%, а среди умерших — 100%.

Эффективность иммунизации современными противогриппозными вакцинами составляет 70-90% и зависит как от конкретной вакцины, условии ее хранения и транспортировки, так и от эпидемиологической обстановки в конкретное время, от особенностей организма малыша и прочих факторов.

Вакцинация гриппа во время беременности снижает вероятность заболевания и тяжесть протекания инфекции у детей в возрасте до 6 месяцев жизни, для которых нет вакцин против гриппа и специфической противовирусной терапии, так как: снижается риск инфицирования матери после родов, а соответственно, и ребенка в первые месяцы жизни; формируется пассивный иммунитет у ребенка за счет передачи антител против гриппа от матери плоду.

Вакцины

На протяжении многих лет ВОЗ дважды в год обновляет свои рекомендации в отношении состава вакцины, нацеленной на 3 (трехвалентная) самых характерных из циркулирующих типов вируса (два подтипа A и один подтип B вирусов гриппа). Начиная с сезона гриппа 2013-2014 годов в северном полушарии рекомендуется состав четырехвалентной вакцины, в которую добавлен второй вирус гриппа B в дополнение к вирусам, входящим в состав обычных трехвалентных вакцин. Ожидается, что четырехвалентные вакцины обеспечат более широкую защиту от инфекций, вызываемых вирусами гриппа подтипа В.

Подробнее о вакцинах

Последние эпидемии

Вирусы гриппа А могут также вызывать глобальные пандемии, характеризующиеся быстрым распространением новых подтипов вируса А (или штаммов подтипов), которые обладают способностью передачи от человека к человеку и достаточно отличаются по антигенной структуре от недавно циркулирующих вирусов гриппа. Зарегистрированные с середины 18-го столетия большие пандемии наблюдались с интервалом в 10-40 лет. Из них пандемия «испанского гриппа» 1918 года была наиболее тяжелой и, по расчетам, унесла в мире 20-40 миллионов или более человеческих жизней. Менее тяжелые пандемии наблюдались в 1957 году («азиатский грипп») и в 1968 году («гонконгский грипп»). В 2009 году глобальные вспышки, вызванные штаммом А(h2N1) («свиной грипп»), обозначенные как А(h2N1)pdm09, достигли пандемического уровня, хотя постепенно эволюционировали в картину сезонного гриппа в 2010 году.

Исторические сведения и интересные факты

Самой тяжелой считается пандемия гриппа 1918 года, которую в народе прозвали «испанкой». В конечном итоге, от нее пострадало 40% населения земного шара. Предупреждение и раннее лечение простудных заболеваний высокими дозами

Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

9-10 декабря 2021 г. в Конференц-зале Президентской библиотеки им. Б.Н. Ельцина (г. Санкт-Петербург, Сенатская площадь, д. 3) состоится II Международная научно-практическая конференция по вопросам противодействия новой коронавирусной инфекции и другим инфекционным заболеваниям.

Организаторы конференции: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФБУН Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора; ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

В конференции примут участие ведущие российские и зарубежные учёные, представители стран СНГ, ШОС, Европейского союза, международных организаций, в том числе Всемирной организации здравоохранения.

В ходе Конференции планируется обсуждение следующих научных вопросов:

• Эпидемиология новой коронавирусной инфекции. Прогнозы и модели. Противоэпидемические мероприятия. Реагирование. Лечение.
• Опыт международного сотрудничества по борьбе с COVID-19
• Молекулярно-генетические характеристики SARS-CoV-2: особенности, изменчивость, распространение.
• Новая угроза — толчок к развитию диагностических технологий. Новые подходы к диагностике, разработка тест-систем. Национальные стратегии лабораторного тестирования.
• Особенности формирования иммунного ответа при COVID-19.
• Результаты серологического мониторинга.
• Специфическая профилактика. Разработка и испытания вакцин, в том числе в контексте эволюции вируса
• О реализации распоряжений Правительства Российской Федерации (программ помощи зарубежным партнерам) в сфере содействия
  международному развитию по вопросам борьбы с инфекциями, включая приграничное сотрудничество. 

Формат участия в работе Конференции: очно и заочно.

Для очного участия в Конференции необходимо иметь код доступа, который будет направляться в официальных приглашениях, а также действительный QR-код о вакцинации, QR-код переболевшего или справку о медицинском отводе (необходимо приложить при регистрации).

Для аккредитации и доступа в здание Президентской библиотеки всем представителям СМИ необходимо пройти регистрацию, указав паспортные и контактные данные, информацию об оборудовании.

Перед началом работы Конференции 8 декабря 2021 г. Санкт-Петербургским НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера будет организовано обязательное ПЦР-тестирование для участников и представителей СМИ. ПЦР-тестирование будет проводиться в здании гостиницы «Англетер» (ул. Малая Морская, д. 24).

Время тестирования: для представителей СМИ – с 12:00 до 16:00; для участников – с 12:00 до 24:00.

Внимание! ПЦР-тесты других организаций не принимаются!

Регистрация на очное участие закроется 2 декабря 2021 года в 11:00.

Сайт конференции: https://pasteur.rbtour.ru/

Ссылка на регистрацию: https://pasteur.rbtour.ru/registraciya.html

Воздействие на клеточные мишени как средство борьбы с гриппозной инфекцией Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Инфекция и иммунитет 2014, Т. 4, № 1, с. 15-26

ВОЗДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТОЧНЫЕ МИШЕНИ КАК СРЕДСТВО БОРЬБЫ С ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

В.В. Зарубаев1, В.С. Смирнов2

1ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия 2 ЗАО МБНПК«Цитомед», Санкт-Петербург, Россия

Резюме. Грипп представляет собой высоко контагиозное заболевание человека. На фоне использования противовирусных препаратов формируются лекарственно-устойчивые штаммы вируса, следствием чего является снижение эффективности этиотропной химиотерапии. В обзоре рассмотрены способы снижения уровня репликации вируса и тяжести патологического процесса, основанные на использовании альтернативных мишеней не вирусного, а клеточного происхождения. Описаны препараты, снижающие продукцию провос-палительных цитокинов (эриторан), ограничивающие дегрануляцию тучных клеток (кетотифен), ингибиторы циклооксигеназ (целекоксиб, месалазин, SC-560), ингибиторы сфингозин-1-фосфатного пути (AAL-R), а также повышающие стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальными клетками (белок Slit). Особое внимание уделено ингибиторам клеточных путей, используемых вирусом для повышения репродукции, таких как NF-kB, Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR. Описана противогриппозная активность ингибиторов киназ и процесса аутофагии, а также препаратов смешанного механизма действия — глицирри-зиновой кислоты и дипептида а-глутамилтриптофана. Дальнейшие исследования в области поиска и оптимизации ингибиторов клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разработке новых противовирусных препаратов высокой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Ключевые слова: грипп, клеточные мишени, воспаление, сигнальные пути, противовирусные препараты.

Обзоры

Грипп представляет собой высококонтагиозное заболевание человека. Ежегодно гриппом на планете переболевает 500 млн человек, умирает около 2 млн [23]. Вирус гриппа вызывает ежегодные эпидемии, а при появлении нового антигенного варианта вируса — пандемии, охватывающие все регионы земного шара и характеризующиеся высокой заболеваемостью, числом пациентов, нуждающихся в госпитализации и смертностью среди всех возрастных групп населения. Пандемия гриппа А(НШ1)рёш09 характеризовалась широким охватом населения многих стран мира, в том числе Российской Федерации, тяжелым клиническим течением и высокой летальностью [5, 16]. Неблагоприятные исходы чаще всего наблюдались не только у лиц с сопутствующими хроническими заболеваниями [16], но и у молодых людей без существенной предшествующей патологии, в том числе у бе-

ременных женщин [3, 4]. В последние годы отмечены также случаи инфицирования человека вирусами гриппа птичьего происхождения подтипов Н5М, Н7Ш и Н7Ш [39].

Вирионы гриппа представляют собой сферические или нитевидные частицы диаметром 80—100 нм, покрытые липидной оболочкой с интегрированными поверхностными гликопро-теидами трех типов — гемагглютинином (НА) и нейраминидазой (НА) и вирусным ионным каналом М2. Оболочка вириона происходит от плазматической мембраны клетки-хозяина и содержит липидные «плотики» — участки ли-пидного бислоя, обогащенные холестерином и имеющие высокую плотность и меньшую текучесть, отделенные друг от друга текучими участками мембраны малой плотности. Под ли-пидной оболочкой расположен слой матриксно-го белка М1, контактирующего с одной стороны

Авторы:

Зарубаев В.В., к.б.н., зав. лабораторией молекулярных основ химиотерапии вирусных инфекций ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург;

Смирнов В.С., д.м.н., главный научный сотрудник ЗАО МБНПК «Цитомед», Санкт-Петербург.

Адрес для переписки:

Зарубаев Владимир Викторович

197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 15/17, ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ. Тел.: (812) 499-15-72 (служебн.). E-mail: [email protected]

поступила в редакцию 11.11.2013 принята к печати 12.11.2013

© В.В. Зарубаев, В.С. Смирнов, 2013

с цитоплазматическими доменами HA и NA, а с другой — с сердцевиной вириона. Сердцевинный рибонуклеопротеин (РНП) представлен восемью сегментами генома — одноцепочечной РНК негативной полярности — в комплексе с белком нуклеопротеина и тремя субъединицами полимеразного комплекса.

При инфицировании клетки РНП попадают в цитоплазму и ядро, где происходит транскрипция, трансляция и репликация сегментов вирусного генома. Транскрипция и репликация вирусспецифических РНК осуществляются вирусным полимеразным комплексом. В отличие от полимераз эукариотических клеток, вирусная полимераза лишена механизма коррекции ошибок. Вследствие этого частота мутаций вирусного генома составляет, по разным оценкам, от 10-4 до 10-6 нуклеотидов на цикл репликации [44, 54]. Это на несколько порядков выше, чем скорость мутирования бактерий и эукариот (1010—1011) [10]. Вследствие этих особенностей, а также короткого жизненного цикла эволюция вируса гриппа протекает быстро. Это служит причиной двух явлений. Во-первых, быстрое формирование мутаций позволяет вирусу ускользать от адаптивного иммунного ответа хозяина. Благодаря этому он способен вызывать ежегодные эпидемии, несмотря на формирование иммунной прослойки населения как следствие вакцинации и естественной заболеваемости. Во-вторых, на фоне использования противовирусных препаратов формируются лекарственно-устойчивые штаммы вируса, следствием чего является снижение эффективности противовирусной химиотерапии.

В настоящее время для профилактики и терапии гриппозной инфекции доступны препараты, обладающие различным механизмом активности. Следуя последовательности событий при развитии гриппозной инфекции, к ним необходимо отнести, во-первых, препараты ин-терферонов и их индукторов, стимулирующие врожденный иммунитет и ограничивающие инфекцию на ранних стадиях [55], и во-вторых, этиотропные препараты, воздействующие на специфические вирусные мишени. Международно признанными противогриппозными препаратами являются химические соединения двух групп — производные адамантана (амантадин и его аналог в России — ремантадин) [49] и ингибиторы вирусной нейрамини-дазы — осельтамивир (Тамифлю®) и занамивир (Реленца®) [8]. В США получено разрешение FDA на использование еще двух ингибиторов нейраминидазы — перамивира (Рапиакта®) внутривенно [50], и ланинамивира (Инавир®) ингаляционно [58]. В России ни перамивир, ни ланинамивир не сертифицированы.

Недостатком препаратов как первой, так и второй группы является снижение их эффективности при позднем начале лечения [29]. Препараты интерферонов и их индукторов про-

являют максимальный уровень защиты при использовании в качестве средств экстренной профилактики, проводимой сразу после инфицирования, еще до появления клинических симптомов. Этиотропные средства эффективны в первые 48 ч после появления клинических симптомов болезни [29]. Кроме того, к этиотроп-ным препаратам вирус, как уже упоминалось, способен быстро вырабатывать устойчивость. С середины 90-х гг., например, отмечен рост доли ремантадин-устойчивых вирусов, и на сегодняшний день практически все изоляты вируса гриппа устойчивы к препаратам адамантаново-го ряда — амантадину и ремантадину [19]. То же было отмечено в пределах подтипа сезонного гриппа А(НШ1), когда за полтора года (с ноября 2007 по март 2009 г.) уровень устойчивости к осельтамивиру вырос с 0 до 100% во всех регионах земного шара [9]. Осельтамивир-устойчивые штаммы отмечены также среди изолятов высокопатогенных вирусов гриппа птиц Н5№ [19] и Н7№ [22], а кроме того, описаны случаи формирования лекарственно-устойчивых вариантов вируса непосредственно в процессе терапии пациентов [22].

Когда речь идет о случаях тяжелого, затяжного, осложненного гриппа, включающих последствия цитокинового шторма [56], или поздних стадий болезни, для уменьшения тяжести заболевания применяют препараты третьей группы, снижающие остроту реактивных процессов. Такие процессы индуцируются вирусом, но реализуются механизмами хозяина. К ним следует отнести такие явления, как отек легких, токсический синдром, гиперпродукцию провоспали-тельных цитокинов, клеточную воспалительную инфильтрацию ткани легких, геморрагический синдром и т.п. Препараты этой группы не влияют на вирусную репродукцию, а представляют собой средства, влияющие на другие факторы патогенеза гриппозной инфекции, то есть средства патогенетической терапии.

Эти соединения являются важной составляющей терапии не только гриппа, но и других заболеваний со сходным патогенезом. Так, например, в качестве средства борьбы с экспрессией провоспалительных цитокинов при сепсисе был разработан антагонист ТЬЯ4 эриторан [42]. Помимо сепсиса, однако, он оказался эффективным средством защиты и от летальной гриппозной инфекции [52]. При дозе вируса, вызывающей гибель 90% животных в контроле, в группе, получавшей эриторан со 2 суток после инфицирования, гибель составила лишь 10—20%, что обеспечивало индекс защиты 78—89%, сопоставимый с показателями препарата сравнения — этиотропного средства осельтамивира. Более того, эриторан проявлял протективную активность и на поздних стадиях инфекции, вплоть до 6-х суток после заражения, когда активность осельтамивира уже не отмечалась [52]. Использование эриторана приводило также к значитель-

ной нормализации морфологической картины легких, снижая степень отека и воспалительной инфильтрации легочной ткани. При этом инфекционная активность вируса не менялась под воздействием препарата за исключением поздних стадий развития инфекции, когда размножение вируса в ткани уже не играет ведущей патогенетической роли.

Тяжесть гриппа, как уже упоминалось, во многом обусловлена дисрегуляцией воспалительного ответа на заражение вирусом. Такая инфекция характеризуется избыточной степенью воспалительных процессов и гиперпродукцией провос-палительных цитокинов, известной как «цито-киновый шторм» [56]. Одним из ведущих путей развития воспаления является каскад реакций, запускаемый ферментами циклооксигеназами СОХ-1 и СОХ-2, катализирующими превращение арахидоновой кислоты в простагландины. Ингибиторы циклооксигеназ широко используются в медицине как анальгетики и противовоспалительные средства. Классические нестероидные противовоспалительные препараты блокируют как СОХ-1, так и СОХ-2, предпочтительнее все же СОХ-1. В эксперименте синтетические ингибиторы СОХ-2 (целекоксиб) и СОХ-1 (БС-560) оказались способны в значительной мере снизить продукцию провоспалительных цитокинов ТНБа и G-CSF в бронхолегочных смывах мышей при гриппозной инфекции [6], однако сколько-нибудь существенного влияния на смертность животных, а тем более на продукцию вируса в легких обнаружено не было. Больше того, избирательное угнетение СОХ-1 приводило даже к повышению смертности, потере веса животными и более выраженной гипотермии, возможно играющей в данном случае ключевую роль.

В другом исследовании [62] была показана дополнительная протективная активность комбинации двух ингибиторов оксигеназ — целе-коксиба и месалазина — с противогриппозным препаратом прямого действия занамивиром. Целекоксиб, как уже указывалось, ингибирует фермент СОХ-2, месалазин способен угнетать как циклооксигеназный, так и липоксигеназ-ный воспалительные пути, приводя к снижению продукции провоспалительных цитокинов и эйкозаноидов, и, как следствие, к деактивации воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы. Кроме того, месалазин ингиби-рует активацию фактора NF-кB и стимулирует синтез фосфатидной кислоты, угнетая тем самым стимуляцию апоптоза церамидами [62]. При начале лечения через 48 часов после инфицирования, что моделирует реальную ситуацию в клинической практике, смертность в группе животных, получавших комбинированное лечение, была ниже, чем в группе, получавшей за-намивир в виде монопрепарата. Снижение титра вируса в легких при этом сопровождалось нормализацией структуры легочной ткани и снижением степени ее воспалительной инфильтрации,

в отличие от группы занамивира, где на фоне снижения инфекционной активности вируса не отмечалось разницы в смертности животных и воспалительной реакции в легких.

Другой противовоспалительный препарат — кетотифен — ингибирует процессы деграну-ляции тучных клеток [26]. Этим достигается ограничение продукции в очаге воспаления про-воспалительных медиаторов, включая гистамин, №N7 и фермент триптазу. Эти свойства кетоти-фена обуславливают его высокую протективную активность на модели летальной гриппозной инфекции, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа подтипа Н5№ [24]. Не влияя собственно на репродукцию вируса в легких, кетотифен, тем не менее, нормализовал показатели веса животных, снижал степень отека и воспалительной инфильтрации легочной ткани, уровень апопто-тических процессов в легких и специфическую смертность животных. При этом активность кетотифена, как и в случае эриторана, превышала активность вирусспецифического препарата осельтамивира [24].

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют, что необходимы дополнительные экспериментальные и/или клинические исследования, чтобы достоверно обосновать и стандартизировать применение ингибиторов цикло-оксигеназ в терапии тяжелого гриппа [25].1Р). Компоненты этого каскада играют важную роль в самых разных аспектах клеточного сигналинга и метаболизма. О важности этого пути свидетельствует, например, тот факт, что стимуляция синтеза S1P приводит к активации факторов транскрипции NF-кB и STAT3 с последующим формированием сигнальной петли, ведущей к злокачестве-ному перерождению клетки. Ингибирование этого процесса фармакологическими препаратами замедляет рост и прогрессирование опухоли и уровень воспалительных медиаторов. На 2013 г. описано свыше 25 препаратов, влияющих на компоненты S1P-сигнального пути, из них 11 находятся на завершающих стадиях клинических испытаний или разрешены к применению как средства терапии опухолей, ревматоидного артрита, язвенного колита, рассеянного склероза, псориаза, то есть патологий, так или иначе основанных на избыточном или неадекватном воспалении [31]. Рецепторы S1P (S1PR1—S1PR5) участвуют в развитии сепсиса, изменении проницаемости сосудов и развитии отека легких. При этом именно последнее касается темы настоящего обзора и обосновывает правомочность регуляции этих компонентов при тяжелом гриппе, признаком которого является как раз отек легких. (рис. 1), направленного против раннего иммунного ответа, приводило к существенному

Рисунок 1. Структура агониста сфингозин-1-фосфатного пути AAL-R

снижению смертности животных в эксперименте [59], причем степень защиты (82%) превосходила соответствующий показатель для препарата сравнения — осельтамивира (50%).

Подобно кетотифену, AAL-R не влиял на репродукцию вируса в легких животных, однако в значительной степени снижал количество клеток, составляющих воспалительный экссудат. Способность к продукции противовирусных антител при этом сохранялась. Оптимальные защитные показатели были достигнуты при совместном применении осельтамивира и AAL-R. Важно также, что использование этого сфин-гозинового аналога оказалось эффективным даже спустя 4 суток после начала инфекции, что свидетельствует о высоком терапевтическом потенциале такого подхода при терапии поздних и осложненных форм гриппа [36].

Отдельного внимания заслуживает еще один подход к терапии тяжелого гриппа — повышение способности организма к преодолению патологического процесса путем минимизации вредного действия воспалительных медиаторов на сосуды. Известно, что характерным свойством гриппа является резкое повышение проницаемости гистогематического барьера, что ведет к развитию множественных геморрагий и обусловливает полиорганную недостаточность при тяжелом гриппе [28]. Для компенсации этой повышенной проницаемости сосудов в организме существуют сигнальные пути противоположной направленности, стабилизирующие состояние эндотелия и базальных мембран. Так, например, последовательность реакций, запускаемая белком Slit и опосредуемая эндотелиальным рецептором Robo4, была идентифицирована как путь, модулирующий стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальны-ми клетками. Активация такого пути оказалась эффективной для снижения проницаемости капилляров, мультиорганного отека и смертности при многих формах экспериментальных инфекций, включая высокопатогенный грипп H5N1 [32]. При этом сам белок Slit не влиял на продукцию вируса. Более того, что особенно важно, он не оказывал воздействия даже на уровень про-воспалительных цитокинов в легких, что свидетельствует о том, что самого по себе ограничения реакции сосудов на гиперцитокинемию достаточно для снижения тяжести заболевания и уровня смертности. В описанных опытах, например, было достигнуто снижение смертности на 40-50%.

В целом, перечисленные препараты применяются как патогенетические средства для терапии тяжелого гриппа. Отличительная их особенность — высокий терапевтический эффект на поздних сроках заболевания и в случаях тяжелого и осложненного гриппа — основана на конкретных мишенях их действия и особенностях патогенеза таких форм инфекции. Известно, что с точки зрения патогенеза любой инфекционный процесс является суммой действия собственно патогена и ответной реакции организма. Как уже упоминалось, препараты прямого противовирусного действия активны лишь в первые дни заболевания, когда в организме протекают интенсивные процессы вирусной репродукции. Однако при уже запущенных реактивных процессах — цитокиновом шторме и массовой деструкции клеток, сформированном отеке легких и нарушениях микроциркуляции органов — основной вклад в патогенез гриппа вносит уже не вирусный, а именно реактивный компонент. Поэтому естественно, что препараты, направленные против этих факторов патогенеза имеют терапевтическую активность.

Выделяется, однако, еще одна, четвертая группа химических препаратов, которая заслуживает отдельного упоминания. Так же, как и препараты предыдущей группы, эти соединения воздействуют не на вирусные, а на клеточные мишени. Особенность этих мишеней состоит в том, что выполняя функции, важные для клетки, они являются необходимыми для жизненного цикла самого вируса. Емкость вирусного генома очень ограничена, и в ходе репродукции он вынужден использовать многие клеточные компоненты, в том числе метаболические и сигнальные механизмы клетки-хозяина. Естественно, что их ингибирование снижает инфекционную активность вируса и уровень его репликации.

Чтобы пояснить зависимость вирусной репродукции от клеточных метаболических путей, приведем наиболее очевидный пример — трансляция вирусных мРНК, полностью обеспечиваемая клеточной системой белкового синтеза. Угнетение этого процесса закономерно приводит к резкому снижению вирусной репродукции. Этот путь используется клеткой, например, в ходе развития антивирусного статуса при воздействии на клетки интерферона [46]. Однако селективность такого воздействия невелика, и действие интерферонов затрагивает как вирусные, так и клеточные процессы. В клетке, находящейся в антивирусном статусе, в равной степени разрушены и вирусные, и клеточные мРНК, благодаря чему подавлен синтез как вирусных, так и клеточных белков.

С развитием методических подходов к изучению внутри- и межклеточных механизмов передачи сигнала было выяснено, что многие вирусы способны использовать для собственной репликации и другие метаболические и сиг-

нальные клеточные сети [47]. В результате многочисленных исследований были разработаны специфические ингибиторы каждого из них, а за последние несколько лет была обнаружена и охарактеризована их противогриппозная активность. Приведем наиболее изученные в этом отношении примеры.

При инфицировании клетки вирусом гриппа активируется центральный и наиболее изученный путь регуляции врожденного противовирусного иммунитета — сигнальный путь NF-kB. В клетках он контролирует экспрессию генов, регулирующих острый воспалительный ответ, адгезию и дифференцировку клеток, апоп-тоз и ответ на вирусную инфекцию. На ранних стадиях инфекция приводит к активации комплекса PI3K/Akt и последующей активации экспрессии NF-kB. Он, в свою очередь, регулирует экспрессию многих генов, включая, в том числе, проапоптотические факторы TRAIL, Fas и FasL. Два последних активируют эффекторные белки апоптоза — каспазы, ферменты, осуществляющие специфическую деградацию комплекса ядерных пор в инфицированной клетке [12, 13, 51, 63]. Такая деградация является одним из первых этапов многоступенчатого процесса программируемой клеточной гибели. При помощи этого механизма ценой гибели инфицированной клетки достигается ограничение размножения вируса во всем организме.

Однако следует учитывать, что в ядре зараженной клетки происходят процессы транскрипции и репликации вирусного генома, и присутствуют многочисленные фрагменты вирусных РНП, которым предстоит выйти через ядерные поры в цитоплазму для участия в сборке вирио-нов потомства. На последней стадии описанного каскада реакций — деградации ядерных пор благодаря активности каспаз — диффузия вирусных РНП через разрушенные поры существенно облегчается по сравнению с порами интактными. Таким образом, являясь исходно противовирусным сигнальным путем, призванным ограничивать вирусную репродукцию, NF-kB в определенный момент, напротив, способствует более активной реализации жизненного цикла вируса [38]. Угнетение этого сигнального пути мешает реализации вирусной программы репликации и снижает эффективность продукции вирионов потомства.

Препараты-ингибиторы этого пути принадлежат к различным химическим группам и воздействуют на различные компоненты каскада [18]. Одни из них (SC75741) нарушают связывание NF-kB с ДНК, препятствуя тем самым индукции факторов апоптоза и активации кас-паз, другие (PS-341 (бортезомиб), MG132, VL-01 и др.) являются ингибиторами протеосом, препятствуя убиквитин-зависимой деградации IkB или ингибируют NF-кВ-активирующую киназу IKK (ацетилсалициловая кислота, LASAG), что в дальнейшем приводит к угнетению процесса

фосфорилирования и деградации 1кВ. В целом, независимо от конкретной точки приложения, ингибирование тех или иных компонентов пути NF-кB приводит к снижению вирусной продукции в клетке [17].

Другим примером использования клеточных путей вирусом гриппа является сигнальный путь Raf/MEK/ERK [33]. Как известно, трансляция вирусных белков происходит в цитоплазме инфицированной клетки.А) — транспортируются к плазматической мембране, встраиваются в нее и формируют кластеры. РНП потомства транспортируются к сайтам скоплений поверхностных белков, взаимодействуют с белком М1 и цитоплазматическими доменами НА и NA, что приводит к искривлению мембраны и дальнейшему почкованию ви-рионов потомства [48].

Формирование вирусных РНП происходит в ядре инфицированной клетки. С одной стороны, для полноценного формирования им необходимо находиться в ядре достаточно долго, чтобы образовать полноценную сердцевину будущих вирионов. С другой стороны, к моменту образования кластеров НА и NA на плазматической мембране им необходимо транспортироваться к сайтам сборки и почкования вирионов, то есть должен существовать механизм, запускающий или подавляющий ядерный экспорт РНП в зависимости от стадии развития инфекционного процесса в клетке. Таким механизмом и является сигнальный путь Raf/MEK/ERK. Его активация индуцируется сборкой агломератов вирусных гликопротеидов на поверхности клетки, и его компоненты направляют транспорт РНП к плазматической мембране. На сегодняшний день неясно, каким именно образом это происходит. Однако ингибиторы этого сигнального пути в значительной степени препятствуют нормальному протеканию вирусной инфекции и накоплению вируса в высоких титрах [35, 45].

Одним из первых этапов пути Raf/MEK/ ERK, является активация белка Raf при помощи ГТФ-связанной формы белка Ras. Поскольку примерно половина новообразований человека содержит в клетках мутации в генах raf или ras, разработка ингибиторов этих генов велась исключительно в аспекте онкологических проблем. Так, шесть препаратов, доведенных до II фазы клинических исследований в области противораковой химиотерапии, оказались эффективными ингибиторами гриппозной инфекции. Это соединения, близкие между собой по химической структуре — и0126, препараты С1-1040 и PD-0325901, AZD-6244 и AZD-8330, а также препарат RDEA-119 (рис. 2). Их 50% ин-гибирующие концентрации в отношении вируса гриппа лежат в пределах от 1200 до 4 нМ, что свидетельствует об их высокой противовирусной активности [11, 20]. р р

Рисунок 2. Ингибиторы сигнального пути Raf/MEK/ERK, доведенные до стадии клинических исследований

Еще один сигнальный путь — PI3K/AKT/ mTOR — также используется вирусом гриппа для обеспечения собственной репликации [12]. В клетке этот путь регулирует дифференци-ровку, метаболизм и инициацию трансляции, а также во многом пересекается с другими сигнальными путями, такими как Raf/MEK/ERK и NF-кB. В ходе вирусной репродукции этот путь используется на ранних этапах вирусной инфекции — для регуляции проникновения вируса в клетку, а также на поздних стадиях — для правильной локализации вирусных РНП и предотвращения преждевременного апопто-за инфицированных клеток. Бактериальный метаболит вортманнин и морфолиновое про-

Рисунок 3. Структура NVP-BEZ235 — ингибитора PI3K/AKT/mTOR [47]

изводное кверцетина LY294002, хотя и не были доведены до стадии клинических исследований из-за низкой биодоступности, явились, тем не менее, важным инструментом для фундаментальных исследований, связанных с передачей сигнала посредством PI3K-пути, а также основой для разработки оптимизированных производных [34]. Одно из них, NVP-BEZ235 (рис. 3), проходит II фазу клинических исследований в качестве противоракового препарата [47].

Описан еще один сигнальный путь, связанный с гриппозной инфекцией. Инфицирование вирусом гриппа активирует сигнальный белок C-Jun терминальную киназу (JNK). Она, в свою очередь, активирует фактор транскрипции AP-1, который стимулирует экспрессию интерферона-в, играющего важную роль в противовирусном ответе клетки. Ингибирование JNK, следовательно, должно приводить к повышению вирусной продукции. Тем не менее, синтетические ингибиторы SP600125 и AS601245 (рис. 4), напротив, снижали уровень репродукции вирусов гриппа независимо от их подтипа. Противовирусная активность этих препаратов была обусловлена их способностью ингибиро-вать синтез вирусных РНК при помощи не выясненного пока механизма [43]. Известно также, что SP600125 не влияет напрямую на активность вирусной РНК-полимеразы, а подавляет активность вирусного белка NS1, что, по-видимому,

Рисунок 4. Структуры SP600125 (а) и AS601245 (б) [43]

приводит к большей эффективности системы противовирусного врожденного иммунитета. Эти результаты были подтверждены в опытах на животных, где SP600125 снижал вирусную нагрузку в легких мышей по сравнению с контрольной группой.

В работе Kumar et al. [30] были идентифицированы два ингибитора тирозинкиназных рецепторов, также проявляющих выраженную противогриппозную активность. Один из них, AG879, является селективным ингибитором сигнального пути, обусловленного рецептором фактора роста нервов и рецептором эпидермального фактора роста 2 (TrkA/HER2), другой — тирфостин А9 — ингибирует сигнальный путь фактора роста тромбоцитов (PDGFR). Каждый из этих ингибиторов угнетает по крайней мере три внутриклеточных стадии жизненного цикла вируса — оба ингибируют синтез всех трех типов вирусспе-цифических РНК, блокируют ядерный экспорт вирусных РНП, а также предотвращают почкование дочерних вирусных частиц, воздействуя на путь, направляемый ферментом биосинтеза липидов — фарнезилдифосфатсинтетазой.

Говоря о роли клеточных киназ в цикле репликации вируса гриппа, следует также упомянуть об исследовании Konig et al. [27], в котором при помощи полногеномного скрининга были идентифицированы 295 клеточных факторов, необходимых для репликации вируса. Большая часть этих белков является киназами, то есть ферментами, регулирующими большинство клеточных сигнальных путей. В дальнейшем путем анализа стандартной библиотеки из 300 киназ [37] были изучены ингибиторы киназ широкого спектра, в результате чего идентифицировано вещество ON108110, эффективно ингибирующее 25 из 300 проанализированных киназ. При этом 8 из них оказались ранее охарактеризованы как необходимые для репликации вируса.

Дальнейшее тестирование показало, что 0N108110 угнетает ядерный экспорт вирусных рибонуклеопротеинов и/или репликацию вирусных РНК, частично воздействуя также на клеточные механизмы транскрипции. Однако вирусный полимеразный комплекс оказался гораздо более чувствителен к воздействию препарата, что позволяет использовать его в дозах, лежащих ниже порога токсичности. Кроме того, 0N108110 снижал продукцию двух других РНК-геномных вирусов — вируса везикулярного

стоматита и вируса болезни Ньюкасла, что указывает на его роль в ингибировании киназ, необходимых для репродукции не только вируса гриппа, но и других вирусов.

Одной их форм реакции клеток на стрессор-ные воздействия является аутофагия — высококонсервативный для всех эукариотических клеток процесс. Исходно аутофагия была идентифицирована как процесс, индуцированный голоданием клетки. Однако к настоящему времени известно, что он играет важную роль в физиологии и патофизиологии и является клеточным ответом на самые разные стимулы, в том числе на вирусную инфекцию. Он также может играть роль в поддержании репродукции вируса гриппа в клетках. В условиях угнетения аутофагических процессов фармакологическими препаратами или при помощи РНК-интерференции выход вирусного потомства и синтез вирусных белков значительно снижаются. Аутофагия, таким образом, является одним из ключевых процессов, обеспечивающих репликацию вируса гриппа.

Zhou et al. [64] было показано, что гриппозная инфекция запускает в зараженных клетках образование аутофагосом и стимулирует синтез белка LC3-II — специфического маркера этих орга-нелл. Обработка таких клеток 3-метиладенином или вортманнином — ингибиторами аутофа-гии — снижала выход вирусных частиц в 2—5 раз, а инфекционность вирусного потомства — приблизительно на порядок. Сходные результаты были получены при инактивации гена LC3 при помощи специфических siRNA. Механизмы подобных взаимоотношений вируса и клетки остаются до конца не выясненными.

Группой исследователей [7] была даже сконструирована система скрининга противогриппозных препаратов на основе анализа взаимодействия между компонентами аутофагического

N. ОН ОН

Рисунок 5. Структура киназного ингибитора ON108110 [37]

Рисунок 6. Структура эводиамина — ингибитора аутофагии, обладающего противогриппозной активностью [7]

пути. Способность химических соединений угнетать взаимодействие белков Atg5, Atg12 и Atg16 была трактована как потенциальная противогриппозная активность. На панели из 83 растительных препаратов традиционной китайской медицины было идентифицировано соединение эводиамин (рис. 6) — алкалоид, содержащийся в экстракте эводии (Evodia rutecarpa Benth.) способное ингибировать образование аутофагосом, индуцированное гриппозной инфекцией, а также обладающее противовирусной активностью в отношении широкой панели вирусов гриппа разных подтипов. При этом токсичность эводиамина составила 100 мкг/мл, а показатель 50% эффективной дозы — 1,6 мкг/мл, что дает индекс селективности около 60 и свидетельствует о высоком противовирусном потенциале этого соединения и возможности дальнейшей оптимизации его структуры для повышения активности.

Таким образом, как видно из приведенных примеров, помимо воздействия непосредственно на вирусные мишени, размножение вируса гриппа может быть подавлено при помощи модуляции клеточных сигнальных путей. Следует отметить, что несмотря ни на доказанный противовирусный потенциал, ни на разрешенное клиническое применение, большинство из перечисленных соединений не используется в качестве средства для терапии гриппа. В первую очередь, это связано с высокой комплексностью сигнальных путей-мишеней. Подавляющее большинство этих препаратов разработаны для использования в области онкологии, то есть способны вмешиваться в работу важных для клетки и организма сигнальных систем, регулирующих такие принципиальные процессы, как апоптоз, деление и дифференцировка, ангиогенез и т.д. Воздействие на них, помимо ограничения продукции вируса, приводит ко многим побочным эффектам, которые могут существенно сдвигать соотношение «выгода/риск» в сторону риска для здоровья. Кроме того, особенности фармакологического рынка диктуют необходимость разделения препаратов для лечения опухолей и респираторных вирусных инфекций. Иными словами, в практике фармакологии стремятся избегать одним и тем же действующим веществом лечить и онкологические заболевания, и грипп. Эти аспекты в некоторой степени ограничивают разработку эффективных противогриппозных препаратов, направленных на клеточные мишени.

Некоторые соединения, как было уже упомянуто, сочетают в себе несколько типов активности, каждая из которых приводит к снижению вирусной нагрузки, уменьшению интенсивности воспалительных процессов, нормализации структуры ткани при тяжелой гриппозной инфекции, и т.п. Так, например, глицирризи-новая кислота (ГК) является эффективным и малотоксичным индуктором IFNy. В работе Utsunomiya et al. [57] было показано, что благодаря этой способности глицирризиновая кислота на 100% предотвращает смертность мышей от гриппозной инфекции при заражении дозой вируса A(h3N2) 10 LD50. Параллельная обработка животных антителами к IFNy полностью снимала протективный эффект ГК, что доказывает механизм ее защитного действия. С другой стороны [40], показано, что ГК является мощным имуномодулятором. В терапевтических дозах на модели гриппозной инфекции макрофагов человека, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа H5N1, ГК снижала продукцию провоспалительных цитокинов CXCL10, IL-6 и CCL-5, а также ингибировала вирусиндуци-рованный апоптоз. При этом не было отмечено никакого влияния этого соединения на продукцию вируса в клетках.

Кроме того показано [41], что в клетках A549, являющихся аналогом альвеолоцитов человека, ГК ингибировала репликацию высокопатогенного вируса гриппа H5N1, снижала степень вирусиндуцированного апоптоза клеток и экспрессию провоспалительных цитокинов. Неясно, является ли такая активность следствием или независима от собственно ее противовирусной активности. Известно, что оболочечные вирусы в процессе слияния вирусной и клеточной мембран нуждаются в определенной текучести липидного бислоя и следовательно, зависят от реологических свойств клеточной мембраны. Так, снижение текучести мембраны на 5% ингибировало размножение ВИЧ-1 на 56%, а 5%-ное повышение текучести напротив, повышало инфекционность вируса в 2,4 раза [21]. Показано также, что те же закономерности применимы и в случае гриппозной инфекции [61]. В высоких концентрациях ГК препятствует интернализации вирионов гриппа, взаимодействуя с мембранами и снижая их текучесть. Эти свойства объясняют также активность ГК in vitro в отношении других вирусов — SARS-ассоциированного коронавируса, ВИЧ-1, респираторно-синцитиального вируса, вируса гепатита В, арбовирусов, вируса осповакци-ны, вирусов группы герпеса (вирус варицелла-зостер, вирус простого герпеса 1 типа, вирус Эпштейна—Барр, цитомегаловирус, вирус саркомы Капоши) и вируса везикулярного стоматита [15]. В дополнение к уже описанным механизмам подавления вирусной репродукции, известно, что ГК снижает мембранный транспорт и сиалирование поверхностного антигена

вируса гепатита В, а также ингибирует ферменты фосфорилирования при инфекции, вызванной вирусом везикулярного стоматита [15].

Таким образом, несмотря на противоречивые сведения о наличии у ГК прямой противовирусной активности в отношении вируса гриппа, можно говорить, что она является, тем не менее, потенциально важным компонентом комплексной противогриппозной терапии благодаря наличию других типов биологической активности, важных при лечении тяжелой и осложненной инфекции. В наших собственных исследованиях [1, 2] продемонстрирована протективная активность ГК против вирусов гриппа A(h2N1) pdm09 и A(h4N2). Снижение титра вируса в ткани легких при этом составило приблизительно 1 порядок. При этом достоверного противовирусного действия в культуре клеток MDCK отмечено не было. Добавление к ГК иммуномоду-лирующего дипептида а-глутамилтриптофана повышало противовирусную активность комбинации, снижая вирусный титр на 5—6 порядков по сравнению с контролем и гибель животных — на 77%. Таким образом, комбинация двух препаратов, неактивных in vitro, имела выраженный эффект in vivo, и механизмы этой активности следует расшифровывать в дальнейших исследованиях.

Преимущества описанного подхода к терапии гриппа очевидны. В отличие от этиотропных соединений, против которых вирус способен вырабатывать устойчивость, препараты против клеточных мишеней лишены этого недостатка. По сравнению с вирусом гриппа, клетка — гораздо более сложная система, обладающая многими уровнями контроля за возникновением мутаций и их коррекции, вплоть до гибели клетки, несущей эти изменения. Во-вторых, в дополнение к антивирусной активности, многие препараты этой группы обладают другими видами биологической активности — противовоспалительной, цитопротекторной и др. Такая активность не столь важна в случаях заболеваний средней тяжести, однако становится жизненно важной, когда речь идет о случаях позднего, тяжелого и осложненного гриппа, где ведущую роль в патогенезе играют не вирусные, а реактивные процессы. Список препаратов — потенциальных кандидатов для комплексной терапии гриппа, разумеется, не исчерпывается соединениями, перечисленными в настоящем обзоре. С развитием представлений о патогенезе

гриппозной инфекции как о сложном процессе, включающем связанные и взаимозависимые каскады реакций, появляются основания включать все больше число ингибиторов каждого из них в число лекарств, способных нормализовать течение гриппа. Сюда относятся статины, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента и блокаторы ангиотензинового рецептора, агонисты рецепторов, активируемых перокси-сомными пролифераторами и агонисты АМФ-активируемых протеинкиназ, и др. [14].

В настоящем обзоре мы ограничились терапией одной только гриппозной инфекции. Описанные соединения, однако, воздействуют на процессы, общие для тяжелых воспалительных заболеваний, независимо от конкретной этиологии — продукцию провоспалительных цитокинов, миграцию клеток в очаг воспаления, и т.п. Поэтому следует ожидать, что соединения, активные при гриппе, окажутся также эффективными и при других вирусных заболеваниях сходного патогенеза, как это имеет место в случае ГК. Следовательно, дальнейшие исследования в области поиска и оптимизации ингибиторов клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разработке новых противовирусных препаратов высокой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Таким образом, препараты для терапии гриппозной инфекции следует разделять как по механизмам действия, так и по срокам применения. Во-первых, это препараты, наиболее эффективные для профилактики и экстренной профилактики (интерфероны и их индукторы). Во-вторых, это препараты этиотропного механизма, использование которых необходимо на всех сроках гриппа после постановки диагноза, но эффективно лишь на ранних стадиях заболевания. Наконец, в-третьих, на дальних стадиях и в случаях тяжелой и осложненной инфекции необходимо использование соединений патогенетического механизма действия, которые могут снижать или не снижать собственно вирусную репродукцию. При этом применение препаратов, действующих на систему врожденного иммунитета, является абсолютно целесообразным как в раннем периоде терапии, так и в более поздние сроки, при этом сочетанное применение специфических и неспецифических препаратов представляет собой оптимальный путь повышения эффективности терапии гриппа.

Списоклитературы

1. Смирнов В.С., Зарубаев В.В., Анфимов П.М., Штро А.А. Влияние комбинации глутамил-триптофана с глицирри-зиновой кислотой на течение острой инфекции у мышей, вызванной вирусом гриппа (h4N2) // Вопросы вирусологии. — 2012. — № 3. — C. 23-27.

2. Смирнов В.С., Гаршинина А.В., Штро А.А., Аникин В.Б., Галочкина А.В., Беляевская С.В., Зарубаев В.В. Протективная активность комбинации глутамил-триптофана и глицирризиновой кислоты при пероральном введении на модели экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной осельтамивир-устойчивым штаммом вируса // Вопросы вирусологии. — 2014 (в печати).

3. Черняев А.Л., Зайратьянц О.В., Полянко Н.И. Патологическая анатомия гриппа A/h2N1 // Архив патологии. — 2010. — № 3. — C. 3-6.

4. Яковлев А.А., Рахманова А.Г., Цинзерлинг В.А. О пандемии гриппа A/h2N1 у иммунодепрессивных лиц в Санкт-Петербурге (апрель-декабрь 2009 г.) // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2010. — Т. 2, № 1. — С. 94-101.

Ссылки 5-64 см. в References (с. 24-26). See References for numbers 5-64 at pp. 24-26.

Infekcia i immunitet (Infection and Immunity) reviews

2014, vol. 4, no. 1, pp. 15-26 RtVItWS

INFLUENCE ON CELLULAR TARGETS FOR TREATING INFLUENZA INFECTION

Zarubaev V.V.a, Smirnov V.S.b

a Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation, St. Petersburg, Russian Federation b MBRD «Cytomed», St. Petersburg, Russian Federation

Abstract. Influenza is a highly contagious infection of humans. The use of specific antivirals leads to emergence of drug-resistant strains following by the decrease of efficacy of ethiotropic chemotherapy. In this review the data about the decrease of the level of viral replication and severity of pathological process based on the use of alternative targets of cellular instead of viral origin are presented. The medicines for decreasing the production of proinflammatory cytokines (eritoran), restricting the degranulation of mast cells (ketotifen), inhibitors of cyclo oxygenases (celexocib, mesalasine, SC-560), inhibitors of sphingosine-1-phospate pathway (AAL-R) and compounds increasing the capillars stability by strengthening the contacts between endothelial cells (Slit protein) have been described in the review. The special attention is paid to the inhibitors of cellular pathways that are used by the virus to provide its reproduction, such as NF-kB, Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR. Information concerning anti-influenza activity of kinase and autophagy inhibitors is summarised as well as data about the preparations of combined mechanism of activity — glycirrhizic acid and dipeptide alpha-glutamyl-tryptophane. Further studies in the field of search and optimization of inhibitors of cellular components as remedies against influenza infection could lead to the development of novel antivirals with high efficacy, broad spectrum of activity and low probability of virus resistance.

Key words: influenza, host targets, inflammation, signal pathways, antivirals. Authors:

Zarubaev V.V.H, PhD (Biology), Head of the Laboratory of Molecular Anti-Viral Chemotherapy, Research Institute of Influenza. 197376, Russian Federation, St. Petersburg, Professor Popov str., 15/17. Phone: (812) 499-15-72 (office). E-mail: [email protected];

Smirnov V.S., PhD, MD (Medicine), Principal Scientist, MBRD «Cytomed», St. Petersburg, Russian Federation.

References

1. Smirnov V.S., Zarubaev V.V., Anfimov P.M., Shtro A.A. Vliyanie kombinatsii glutamil-triptofana s glitsirrizinovoy kislotoy na techenie ostroy infektsii u myshey, vyzvannoy virusom grippa (h4N2) [Effect of a combination of glutamyl-tryptophan and glycyrrhizic acid on the course of acute infection caused by influenza (h4h3) virus in mice]. Voprosy virusologii — Problems of Virology, 2012, vol. 57, no. 3, pp. 23—27.

2. Smirnov V.S., Garshinina A.V., Shtro A.A., Anikin V.B., Galochkina A.V., Belyaevskaya S.V., Zarubaev V.V. Protektivnaya ak-tivnost’ kombinatsii glutamil-triptofana i glitsirrizinovoy kisloty pri peroral’nom vvedenii na modeli eksperimental’noy letal’noy grippoznoy infektsii u belykh myshey, vyzvannoy osel’tamivir-ustoychivym shtammom virusa (v pechati) [Antiviral activity of complex of glycirrhysic acid-alpha-glutamyltryptophan against experimental lethal influenza infection in white mice caused by oseltamivir-resistant strain of the virus (in press)].pez S. Molecular Anatomy of 2009 Influenza Virus A (h2N1). Archives of Medical Research, 2009, vol. 40, pp. 643-654.

6. Carey M.A., Bradbury J.A., Rebolloso Y.D., Graves J.P., Zeldin D.C., Germolec D.R. Pharmacologic inhibition of COX-1 and COX-2 in influenza A viral infection in mice. PLoS One, 2010, vol. 5(7), e11610.

7. Dai J.P., Li W.Z., Zhao X.F., Wang G.F., Yang J.C., Zhang L., Chen X.X., Xu Y.X., Li K.S. A drug screening method based on the autophagy pathway and studies of the mechanism of evodiamine against influenza A virus. PLoS One, 2012, vol. 7(8), e42706.

8. De Clercq E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat. Rev. Drug Discov, 2006, vol. 5, pp. 1015—1025.

9. Dixit R., Khandaker G., Ilgoutz S., Rashid H., Booy R. Emergence of oseltamivir resistance: control and management of influenza before, during and after the pandemic. Infect. Disord. Drug Targets, 2013, vol. 13, no. 1, pp. 34—45.

10. Drake J.W., Charlesworth B., Charlesworth D., Crow J.F. Rates of spontaneous mutation. Genetics, 1998, vol. 148, no. 4, pp. 1667—1686.

11. Droebner K., Pleschka S., Ludwig S., Planz O. Antiviral activity of the MEKinhibitor U0126 against pandemic h2N1v and highly pathogenic avian influenza virus in vitro and in vivo. Antiviral Res., 2011, vol. 92, pp. 195—203.

12. Ehrhardt C., Ludwig S. A new player in a deadly game: influenza viruses and the PI3K/Akt signalling pathway. Cell. Microbiol., 2009, vol. 11, pp. 863-871.

13. Ehrhardt C., Wolff T., Pleschka S., Planz O., Beermann W., Bode J.G., Schmolke M., Ludwig S. Influenza A virus NS1 protein activates the PI3K/Akt pathway to mediate antiapoptotic signaling responses. J. Virol., 2007, vol. 81, pp. 3058-3067.

14. Fedson D.S. Treating influenza with statins and other immunomodulatory agents. Antiviral Res., 2013, vol. 99, no. 3, pp. 417-435.

15. Fiore C., Eisenhut M., Krausse R., Ragazzi E., Pellati D., Armanini D., Bielenberg J. Antiviral effects of Glycyrrhiza species. Phytother. Res., 2008, vol. 22, no. 2, pp. 141-148.

16. Gill J.R., Sheng Z.M., Ely S.F., Guinee D.G.Jr., Beasley M.B., Suh J., Deshpande C., Mollura D.J., Morens D.M., Bray M., Travis W.D., Taubenberger J.K. Pulmonary pathologic findings of fatal 2009 pandemic influenza A/h2N1 viral infections. Arch. Pathol. Lab. Med, 2010, vol. 134, pp. 235-243.

17. Gilmore T.D., Garbati M.R. Inhibition of NF-kappaB signaling as a strategy in disease therapy. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2011, vol. 349, pp. 245-263.

18. Gilmore T.D., Herscovitch M. Inhibitors of NF-kappaB signaling: 785 and counting. Oncogene, 2006, vol. 25, pp. 6887-6899.

19. Govorkova E.A., Baranovich T., Seiler P., Armstrong J., Burnham A., Guan Y., Peiris M., Webby R.J., Webster R.G. Antiviral resistance among highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses isolated worldwide in 2002—2012 shows need for continued monitoring. Antiviral Res., 2013, vol. 98, no. 2, pp. 297-304.

20. Haasbach E., Hartmayer C., Planz O. Combination of MEK inhibitors and oseltamivir leads to synergistic antiviral effects after influenza A virus infection in vitro. Antiviral Res., 2013, vol. 98, pp. 319-324.

21. Harada S., Yusa K., Monde K., Akaike T., Maeda Y. Influence of membrane fluidity on human immunodeficiency virus type 1 entry. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, vol. 329, pp. 480-486.

22. Hay A.J., Hayden F.G. Oseltamivir resistance during treatment of H7N9 infection. Lancet, 2013, vol. 381, no. 9885,pp. 2230-2232.

23. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/2003/fs211/en.

24. Hu Y., Jin Y., Han D., Zhang G., Cao S., Xie J., Xue J., Li Y., Meng D., Fan X., Sun L.Q., Wang M. Mast cell-induced lung injury in mice infected with H5N1 influenza virus. J. Virol, 2012, vol. 86, no. 6, pp. 3347-3356.

25. Hui D.S., Lee N., Chan P.K. Adjunctive therapies and immunomodulatory agents in the management of severe influenza. Antiviral Res, 2013, vol. 98, no. 3, pp. 410-416.

26. Huston D.P., Bressler R.B., Kaliner M., Sowell L.K., Baylor M.W. Prevention of mast-cell degranulation by ketotifen in patients with physical urticarias. Ann. Intern. Med., 1986, vol. 104, no. 4, pp. 507-510.

27. Konig R., Stertz S., Zhou Y., Inoue A., Hoffmann H.H., Bhattacharyya S., Alamares J.G., Tscherne D.M., Ortigoza M.B., Liang Y., Gao Q., Andrews S.E., Bandyopadhyay S., De Jesus P., Tu B.P., Pache L., Shih C., Orth A., Bonamy G., Miraglia L., Ideker T., Garcia-Sastre A., Young J.A., Palese P., Shaw M.L., Chanda S.K. Human host factors required for influenza virus replication. Nature, 2010, vol. 463, pp. 813-817.

28. Kuiken T., Riteau B., Fouchier R.A., Rimmelzwaan G.F. Pathogenesis of influenza virus infections: the good, the bad and the ugly. Curr. Opin. Virol., 2012, vol. 2, no. 3, pp. 276-286.

29. Kumar A. Early versus late oseltamivir treatment in severely ill patients with 2009 pandemic influenza A (h2N1): speed is life. J. Antimicrob. Chemother., 2011, vol. 66, no. 5, pp. 959-963

30. Kumar N., Liang Y., Parslow T.G., Liang Y. Receptor tyrosine kinase inhibitors block multiple steps of influenza a virus replication. J. Virol, 2011, vol. 85, no. 6, pp. 2818-2827.

31. Kunkel G.T., Maceyka M., Milstien S., Spiegel S. Targeting the sphingosine-1-phosphate axis in cancer, inflammation and beyond. Nat. Rev. Drug Discov., 2013, vol. 12, no. 9, pp. 688-702.

32. London N.R., Zhu W., Bozza F.A., Smith M.C., Greif D.M., Sorensen L.K., Chen L., Kaminoh Y., Chan A.C., Passi S.F., Day C.W., Barnard D.L., Zimmerman G.A., Krasnow M.A., Li D.Y. Targeting Robo4-dependent Slit signaling to survive the cytokine storm in sepsis and influenza. Sci. Transl. Med, 2010, vol. 2, no. 23, 23ra19.

33. Ludwig S., Wolff T., Ehrhardt C., Wurzer W.J., Reinhardt, J., Planz O., Pleschka S. MEK inhibition impairs influenza B virus propagation without emergence of resistant variants. FEBS Lett., 2004, vol. 561, pp. 37-43.

34. Maira S.M., Finan P., Garcia-Echeverria C. From the bench to the bed side: PI3K pathway inhibitors in clinical development. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2010, vol. 347, pp. 209-239.

35. Marjuki H., Yen H.L., Franks J., Webster R.G., Pleschka S., Hoffmann E. Higher polymerase activity of a human influenza virus enhances activation of the hemagglutinin-induced Raf/MEK/ERK signal cascade. Virol. J., 2007, vol. 4, pp. 134.

36. Marsolais D., Hahm B., Walsh K.B., Edelmann K.H., McGavern D., Hatta Y., Kawaoka Y., Rosen H., Oldstone M.B. A critical role for the sphingosine analog AAL-R in dampening the cytokine response during influenza virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2009, vol. 106, no. 5, pp. 1560-1565.

37. Martinez-Gil L., Alamares-Sapuay J.G., Ramana Reddy M.V., Goff P.H., Premkumar Reddy E., Palese P. A small molecule multi-kinase inhibitor reduces influenza A virus replication by restricting viral RNA synthesis. Antiviral. Res., 2013, vol. 100, no. 1, pp. 29-37.

38. Mazur I., Wurzer W.J., Ehrhardt C., Pleschka S., Puthavathana P., Silberzahn T., Wolff T., Planz O., Ludwig S. Acetylsalicylic acid (ASA) blocks influenza virus propagation via its NF-kappaB-inhibiting activity. Cell. Microbiol., 2007, vol. 9, pp. 1683-1694.

39. Mei L., Song P., Tang Q., Shan K., Tobe R.G., Selotlegeng L., Ali A.H., Cheng Y., Xu L. Changes in and shortcomings of control strategies, drug stockpiles, and vaccine development during outbreaks of avian influenza A H5N1, h2N1, and H7N9 among humans. Biosci. Trends., 2013, vol. 7, no. 2, pp. 64-76.

40. Michaelis M., Geiler J., Naczk P., Sithisarn P., Ogbomo H., Altenbrandt B., Leutz A., Doerr HW., Cinatl J Jr. Glycyrrhizin inhibits highly pathogenic H5N1 influenza A virus-induced pro-inflammatory cytokine and chemokine expression in human macrophages. Med. Microbiol. Immunol., 2010, vol. 199, no. 4, pp. 291—297.

41. Michaelis M., Geiler J., Naczk P., Sithisarn P., Leutz A., Doerr H.W., Cinatl J. Jr. Glycyrrhizin exerts antioxidative effects in H5N1 influenza A virus-infected cells and inhibits virus replication and pro-inflammatory gene expression. PLoS One, 2011, vol. 6, no. 5, e19705.

42. Mullarkey M., Rose J.R., Bristol J., Kawata T., Kimura A., Kobayashi S., Przetak M., Chow J., Gusovsky F., Christ W.J., Rossignol D.P. Inhibition of endotoxin response by E5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J. Pharmacol. Exp. Ther, 2003, vol. 304, pp. 1093-1102.

43. Nacken W., Ehrhardt C., Ludwig S. Small molecule inhibitors of the c-Jun N-terminal kinase (JNK) possess antiviral activity against highly pathogenic avian and human pandemic influenza A viruses. Biol. Chem., 2012, vol. 393, no. 6, pp. 525-534.

44. Nobusawa E., Sato K. Comparison of the mutation rates of human influenza A and B viruses. J. Virol., 2006, vol. 80, no. 7, pp. 3675-3678.

45. Olschlager V., Pleschka S., Fischer T., Rziha H.J., Wurzer W., Stitz L., Rapp U.R., Ludwig S., Planz O. Lung-specific expression of active Raf kinase results in increased mortality of influenza A virus-infected mice. Oncogene, 2004, vol. 23, pp. 6639-6646.

46. Pitha P.M., Kunzi M.S. Type I interferon: the ever unfolding story. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2007, vol. 316, pp. 41-70.

47. Planz O. Development of cellular signaling pathway inhibitors as new antivirals against influenza. Antiviral Res., 2013, vol. 98. no. 3, pp. 457-468.

48. Rossman J.S., Lamb R.A. Influenza virus assembly and budding. Virology, 2011, vol. 411, no. 2, pp. 229-236.

49. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives. Antiviral Res., 1998, vol. 37, pp. 83-95.

50. Shetty A.K., Peek L.A. Peramivir for the treatment of influenza. Expert Rev. Anti Infect. Ther., 2012, vol. 10, pp. 123-143.

51. Shin Y.K., Li Y., Liu Q., Anderson D.H., Babiuk L.A., Zhou Y. Sh4 binding motif 1 in influenza A virus NS1 protein is essential for PI3K/Akt signaling pathway activation. J. Virol, 2007, vol. 81, pp. 12730-12739.

52. Shirey K.A., Lai W., Scott A.J., Lipsky M., Mistry P., Pletneva L.M., Karp C.L., McAlees J., Gioannini T.L., Weiss J., Chen W.H., Ernst R.K., Rossignol D.P., Gusovsky F., Blanco J.C., Vogel S.N. The TLR4 antagonist Eritoran protects mice from lethal influenza infection. Nature, 2013, vol. 497, no. 7450, pp. 498-502.

53. Smee D.F., Julander J.G., Tarbet E.B., Gross M., Nguyen J. Treatment of oseltamivir-resistant influenza A (h2N1) virus infections in mice with antiviral agents. Antiviral. Res., 2012, vol. 96, no. 1, pp. 13-20.

54. Smith D.B., Inglis S.C. The mutation rate and variability of eukaryotic viruses: an analytical review. J. Gen. Virol., 1987, vol. 68, pt 11, pp. 2729-2740.

55. Tazulakhova E.B., Parshina O.V., Guseva T.S., Ershov F.I. Russian experience in screening, analysis, and clinical application of novel interferon inducers. J. Interferon Cytokine Res., 2001, vol. 21, no. 2, pp. 65-73.

56. Tisoncik J.R., Korth M.J., Simmons C.P., Farrar J., Martin T.R., Katze M.G. Into the eye of the cytokine storm. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2012, vol. 76, no. 1, pp. 16-32

57. Utsunomiya T., Kobayashi M., Pollard R.B., Suzuki F. Glycyrrhizin, an active component of licorice roots, reduces morbidity and mortality of mice infected with lethal doses of influenza virus. Antimicrob. Agents Chemother., 1997, vol. 41, no. 3, pp. 551-556.

58. Vavricka C.J., Li Q., Wu Y., Qi J., Wang M., Liu Y., Gao F., Liu J., Feng E., He J., Wang J., Liu H., Jiang H., Gao G.F. Structural and functional analysis of laninamivir and its octanoate prodrug reveals group specific mechanisms for influenza NA inhibition. PLoS Pathog, 2011, vol. 7, e1002249.

59. Walsh K.B., Teijaro J.R., Wilker P.R., Jatzek A., Fremgen D.M., Das S.C., Watanabe T., Hatta M., Shinya K., Suresh M., Kawaoka Y., Rosen H., Oldstone M.B. Suppression of cytokine storm with a sphingosine analog provides protection against pathogenic influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, vol. 108, no. 29, pp. 12018-12023.

60. Warner T.D., Mitchell J.A. Cyclooxygenases: new forms, new inhibitors, and lessons from the clinic. FASEB J., 2004, vol. 18, pp. 790-804.

61. Wolkerstorfer A., Kurz H., Bachhofner N., Szolar O.H. Glycyrrhizin inhibits influenza A virus uptake into the cell. AntivirRes., 2009, vol. 83, pp. 171-178.

62. Zheng B.J., Chan K.W., Lin Y.P., Zhao G.Y., Chan C., Zhang H.J., Chen H.L., Wong S.S., Lau S.K., Woo P.C., Chan K.H., Jin D.Y., Yuen K.Y. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, vol. 105, no. 23, pp. 8091-8096.

63. Zhirnov O.P., Klenk H.D. Control of apoptosis in influenza virus-infected cells by up-regulation of Akt and p53 signaling. Apoptosis, 2007, vol. 12, pp. 1419-1432.

64. Zhou Z., Jiang X., Liu D., Fan Z., Hu X., Yan J., Wang M., Gao G.F. Autophagy is involved in influenza A virus replication. Autophagy, 2009, vol. 5, no. 3, pp. 321-328.

Received 11.11.2013 Accepted 12.11.2013

какие бывают, как распознать грипп по первым признакам и начать его лечить?

Узнать подробнее…

Узнать подробнее…
Имеются противопоказания. Необходимо получить консультацию специалиста.

Как принимать препарат?
Имеются противопоказания. Необходимо получить консультацию специалиста.

Подробнее…

Как принимать препарат?
Имеются противопоказания. Необходимо получить консультацию специалиста.

Грипп распространен чрезвычайно широко. Это одно из наиболее часто встречающихся инфекционных заболеваний — 95% людей, обратившихся к врачам по поводу инфекций, страдают именно гриппом. В нашей стране гриппом ежегодно заражается от 27 до 41 миллиона человек, а всего в мире с этой болезнью каждый год сталкивается около 500 миллионов человек[1].

Поскольку шансы заразиться гриппом очень высоки, каждый должен знать, каковы типичные признаки гриппа, что можно делать для облегчения состояния, а что нельзя и какие медикаменты предлагает современная медицина для лечения гриппа.

Источники заболевания и эпидемиология

Эпидемии гриппа — явление цикличное, возвращающееся каждый год. Обычно начало приходится на сентябрь, а пик — на период с февраля по март[2]. Грипп передается от человека к человеку — и передается довольно легко. Основной способ передачи — воздушно-капельный, однако грипп передается также и бытовым путем. Для заражения достаточно 0,0001 мл носоглоточного секрета — это микроскопическая капелька, которую практически невозможно разглядеть. Кроме того, вирус гриппа очень живуч — он сохраняет свою вирулентность в течение долгих часов. Например, в воздухе вирус остается активным до 9 часов, на ткани — до 12 часов, а на пластике — до двух суток[3].

Интересный факт
Чаще всего гриппом болеют дети и подростки в возрасте 1–14 лет — на эту возрастную группу приходится 37% всех случаев гриппа[4].

Как отличить грипп от простуды?

Собственно, «простуда» — это не медицинский термин. Так в разговорной речи обозначают любое острое респираторное заболевание вирусной или бактериальной природы. Грипп вызывается вирусом, однако бактериальные ОРЗ тоже распространены, хотя и заметно меньше.

Отличить вирусное ОРЗ от бактериального бывает непросто. Точный ответ могут дать только результаты анализов. Впрочем, есть несколько внешних признаков, позволяющих заподозрить грипп.

При гриппе болезнь начинается очень резко — еще утром вы чувствовали себя хорошо, а после обеда понимаете, что серьезно больны. Температура поднимается до 38–39˚С. Почти всегда грипп сопровождается реакциями, похожими на аллергию, — глаза становятся красными, зудят и слезятся, появляются прозрачные выделения из носа. В самом начале заболевания обычно нет ни сильного насморка с обильными окрашенными выделениями, ни боли в горле, ни кашля.

При бактериальных ОРЗ болезнь развивается медленнее, температура нарастает постепенно и редко пересекает отметку в 38˚С. Для бактериальной инфекции очень характерны локальные поражения, такие как сильная боль в горле, насморк с зеленоватыми или желтоватыми выделениями, отиты, бронхиты и пр. Симптомы, похожие на аллергические, при бактериальных ОРЗ зачастую отсутствуют.

Бактериальная инфекция часто является следствием гриппа — организм, ослабленный вирусом, не может противостоять бактериям, что приводит к развитию бактериальных осложнений.

Что делать, если появились первые симптомы гриппа

Если вы подозреваете, что заразились гриппом, первое, что нужно сделать, — обратиться к врачу и сдать анализы. Только так можно определить, к какому типу относится инфекция, какие именно препараты помогут ее побороть, а также выяснить, нет ли бактериальных осложнений. Прием лекарств можно начинать только после постановки диагноза, однако нелекарственные методы нужно применять сразу же после того, как вы почувствуете недомогание.

Крайне важно взять больничный и обеспечить себе постельный режим. Человек, заболевший гриппом, очень заразен, и попытки перенести болезнь на ногах приведут к тому, что ваши коллеги и все, с кем придется контактировать, также заболеют. Вы же повысите свои шансы заполучить неприятное (возможно, даже опасное!) бактериальное осложнение гриппа, например, менингит или пневмонию.

При гриппе следует много пить — жар вызывает потливость, и, следовательно, большую потерю влаги. Вопреки расхожему мнению, очень горячие напитки противопоказаны — даже легкий ожог слизистых оболочек гортани сделает их более уязвимыми для бактериальных инфекций. Питье должно быть теплым и обильным. Отлично подойдут травяные чаи, морсы, некислые соки, компоты, кефир, обезжиренное молоко. Кофе пить нежелательно — оно усиливает сердцебиение и может ухудшить состояние. Выпивая не менее 2 литров жидкости в сутки, вы помогаете организму избавляться от токсинов, которые и вызывают значительную часть симптомов гриппа — слабость, сонливость, тошноту, головную боль.

Поддерживайте в комнате комфортную температуру и не забывайте регулярно открывать окна — это понижает концентрацию микробов в воздухе. Если на улице холодно, лучше положите дополнительное одеяло, но не отказывайтесь от проветривания.

Принимать душ при гриппе можно, если, конечно, после душа вы не собираетесь выходить на холодный воздух. Иногда при гриппе человек чувствует себя настолько плохо, что едва может дойти до ванной комнаты. В таком случае можно ограничиться обтиранием влажным полотенцем или гигиеническими салфетками. Так или иначе, пот с кожи желательно смывать.

Все лекарства от гриппа можно разделить на две группы: те, которые борются с причиной болезни (этиотропные препараты), и те, которые не лечат само заболевание, но облегчают его проявления (симптоматические препараты).

Симптоматические средства. Эта группа медикаментов включает в себя:

• Жаропонижающие. Для улучшения состояния при гриппе применяют нестероидные противовоспалительные средства. Они понижают температуру, а многие из этих средств оказывают и противовоспалительное воздействие. Самые известные жаропонижающие — ибупрофен, ацетилсалициловая кислота, парацетамол.
• Капли от насморка. При заложенности носа врачи рекомендуют капать сосудосуживающие капли (например, ксилометозолин), они мгновенно снимают отек и позволяют вздохнуть свободно. Но с этими средствами следует обращаться осторожно и не применять их более 3–5 дней — иначе есть риск развития медикаментозного ринита, при котором отек слизистой оболочки носоглотки станет постоянным и вы уже не сможете обходиться без капель.
• Антигистаминные препараты. Они позволяют снять такие симптомы гриппа, как покраснение глаз, отек носоглотки и прозрачные выделения из носа. В этом отношении эффективны тавегил, лоратадин и другие лекарства от аллергии.

Этиотропные препараты. Это средства, которые воздействуют на возбудителя болезни, то есть на вирусы или на бактерии.

• Противовирусные средства. Грипп — вирусное заболевание, и потому для его лечения нужно применять именно лекарства, помогающие справиться с вирусом, — «Ремантадин», «Арбидол», «Осельтамивир» и другие подобные препараты. Таких препаратов множество, они воздействуют на вирус на разных стадиях его жизненного цикла, но все такие средства преследуют одну цель — не дать вирусу распространяться. Противовирусные препараты особенно эффективны в первые дни болезни, но совершенно бессмысленны в терапии бактериальных осложнений гриппа вроде пневмонии, бронхита или отита.
• Антибиотики. Как уже было сказано, антибиотики не воздействуют на вирусы, они активны лишь в отношении бактерий. Но поскольку к вирусной инфекции при гриппе очень часто присоединяется бактериальная (особенно если грипп не лечили должным образом с самого начала), то при гриппе нередко назначают и антибактериальные средства. К таким относятся пенициллин, цефалоспорины и макролиды.
• Иммуностимуляторы. Так называют препараты, укрепляющие защитные силы организма и помогающие иммунной системе самостоятельно отражать атаки вирусов и бактерий. Широко применяются препараты интерферона и индукторов интерферона — их можно использовать как для лечения, так и для профилактики гриппа во время эпидемий.

Профилактика

Самый надежный способ избежать заболевания — своевременно пройти вакцинацию. Современные вакцины эффективны и безопасны, но нужно помнить, что они не дают долгосрочного иммунитета, поэтому проходить вакцинацию следует ежегодно.

Во время эпидемий нужно соблюдать некоторые меры предосторожности. Старайтесь избегать скопления людей, а если это невозможно, носите одноразовые медицинские маски. Мойте руки как можно чаще, поскольку инфекция часто проникает в организм именно через них. Достаточно прикоснуться к поверхности, на которой находятся невидимые капельки жидкости с вирусом, а потом потереть глаза — и вы уже больны.

Проводите влажную уборку как можно чаще, желательно протирать пол, поверхности и дверные ручки антибактериальным раствором или моющим средством с антибактериальным эффектом. Это касается и рабочего места — мы не призываем вас самостоятельно убирать весь офис, но протирать спиртовыми салфетками стол, телефон и клавиатуру компьютера все же стоит.

Если вы часто болеете, имеет смысл принимать иммуномодуляторы. Стресс, переутомление, бессонница, строгие диеты, хронические заболевания в анамнезе — все эти факторы ослабляют нашу защиту, и во время эпидемий ей требуется помощь.

Лечить грипп необходимо — без своевременной правильной терапии очень велик риск развития осложнений, которые могут давать о себе знать долгие годы. А такие последствия гриппа, как менингит и пневмония, смертельно опасны, особенно для детей, подростков и пожилых людей.

Эволюция сезонных вирусов гриппа

Выявление отбора при развитии гриппа внутри хозяина с использованием данных вирусных последовательностей

Abstract

Эволюция гриппа внутри хозяина является жизненно важным компонентом его эпидемиологии.Особый интерес вызывает вопрос о том, какую роль играет отбор в формировании вирусной популяции в течение одной инфекции. Здесь мы описываем метод измерения отбора, действующего на вирус гриппа в пределах отдельного хозяина, на основе данных последовательности генома с временным разрешением от инфекции. Анализируя данные о последовательности из исследования передачи, проведенного на свиньях, описывающих часть гена гемагглютинина (HA1) вируса гриппа, мы обнаруживаем признаки ненейтральности в шести из шестнадцати инфекций.Мы находим доказательства как положительного, так и отрицательного отбора, действующего на определенные аллели, в то время как в трех случаях данные свидетельствуют о наличии зависящего от времени отбора. При одной инфекции мы наблюдаем, что потенциально является специфическим иммунным ответом против вируса; обнаружено, что несинонимичная мутация в эпитопной области вируса находится в условиях сначала положительного, а затем резко отрицательного отбора. Что особенно важно, учитывая отсутствие гомологичной рекомбинации при гриппе, наш метод учитывает неравновесие по сцеплению между нуклеотидами в разных положениях в гене гемагглютинина, что позволяет анализировать популяции, в которых в любой момент времени присутствуют множественные мутации.Наш подход предлагает новое понимание динамики инфекции гриппа, обеспечивая подробную характеристику сил, лежащих в основе вирусной эволюции.

Сведения об авторе

Эволюция вируса гриппа имеет большое значение для здоровья человека. В процессе эволюции современные вирусы гриппа развивают способность заражать людей, вакцинированных против более ранних штаммов. Новые штаммы гриппа, поражающие птиц и свиней, могут эволюционировать, чтобы инфицировать и распространяться между людьми, вызывая глобальную пандемию.Вирус гриппа обитает в организме человека или животного-хозяина, поэтому вирусная эволюция происходит внутри отдельных людей или распространяется между ними. Поэтому вопрос о том, что происходит с вирусом во время заражения, вызывает большой интерес. Здесь мы описываем статистический метод, который использует данные последовательности вирусного генома для измерения того, как эволюция влияет на вирус гриппа в пределах одного хозяина. Изучая данные об инфекциях, передаваемых между свиньями, мы находим доказательства эволюционной адаптации у шести из шестнадцати животных, по которым были доступны данные.В одном случае очевиден иммунный ответ свиньи против вируса. Наш метод обеспечивает статистическую основу для использования данных о последовательностях для изучения эволюции вирусов в очень короткие сроки, что позволяет проводить новые исследования эволюции вирусов внутри хозяина.

Образец цитирования: Иллингворт CJR, Фишер А., Мустонен В. (2014) Идентификация отбора в эволюции гриппа внутри хозяина с использованием данных вирусных последовательностей. PLoS Comput Biol 10 (7): e1003755. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1003755

Редактор: Клаус О. Уилке, Техасский университет в Остине, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 9 декабря 2013 г .; Принята к печати: 13 июня 2014 г .; Опубликовано: 31 июля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Illingworth et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: CJRI был поддержан стипендией сэра Генри Дейла, совместно финансируемой Wellcome Trust и Королевским обществом (номер гранта 101239 / Z / 13 / Z). AF поддерживается Немецким исследовательским фондом (DFG) под номером гранта FI 1882 / 1-1. Мы также хотели бы поблагодарить Wellcome Trust за поддержку в соответствии с номером гранта 098051. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Общий риск для здоровья человека, связанный с новым вирусом гриппа H7N9 [1], хотя и потенциально серьезен, пока неизвестен [2], [3]. Пандемический грипп — это зооноз [4], и поэтому можно ожидать, что любая новая пандемия возникнет в результате двухэтапного процесса [5], [6], при этом вирус сначала приобретает способность вызывать спорадические локализованные инфекции у людей до тех пор, пока после второго перехода перерастает в глобальную пандемию. Каждый из этих этапов носит эволюционный характер и характеризуется, в свою очередь, адаптацией вируса к заражению человека-хозяина и развитием повышенной трансмиссивности между хозяевами.В штамме nH7N9 первый из этих шагов уже произошел, включая приобретение мутаций, ответственных за связывание специфических рецепторов человека [7]. Таким образом, развитие глобальной эпидемии зависит от эволюции увеличения трансмиссивности вируса, фенотипического изменения, которое может происходить только во время роста вируса в среде хозяина. Как и в случае с другими вирусными видами [8], понимание эволюции гриппа внутри хозяина является важной задачей.

Широкий спектр подходов к математическому моделированию был направлен на вопросы инфекции, передачи и эволюции гриппа [9].Особое значение для данного исследования имеют модели, отслеживающие динамику отдельной инфекции. Основываясь на наблюдаемых изменениях вирусного титра с течением времени, были сделаны выводы о многих важных свойствах инфекции, включая репродуктивное число для клеточной инфекции, временные рамки и количество вирусов, продуцируемых во время инфицирования клетки, а также влияние на вирусную популяцию. как врожденного, так и адаптивного иммунных ответов [10] — [14]. Учитывая данные об уровнях внутриклеточной РНК, были описаны тонкие детали репликации вируса в клетке [15].Эволюционные модели конкуренции между вирусными штаммами прояснили взаимосвязь между отбором по росту и эффектами передачи, а также динамикой иммунного ускользания [16] — [18].

В приведенных выше случаях вирусная популяция моделировалась либо как популяция идентичных людей, либо как набор отдельных классов вирусов, характеризующихся различными свойствами иммунного ускользания или передачи. Основываясь на этих подходах, для моделирования эволюции гриппа H5N1 была использована генетическая классификация вирусов [19]; Пригодность вируса определялась по наличию или отсутствию набора мутаций.Здесь мы делим вирусную популяцию аналогичным образом, выражая приспособленность вируса как функцию его генетического состава. Однако вместо того, чтобы анализировать последствия предлагаемого ландшафта приспособленности, мы делаем вывод о том, как на самом деле действовал отбор, основываясь на наблюдаемых данных генетической последовательности.

При хронических инфекциях, таких как ВИЧ, легко доступны данные о последовательностях с временным разрешением от отдельных хозяев [20]. Однако течение инфекции гриппа даже у хозяина с ослабленным иммунитетом [21] относительно короткое.Таким образом, генетические данные с временным разрешением редки, основные примеры были собраны из экспериментально инфицированных популяций животных [22], [23]. В этой работе мы рассматриваем данные одного такого исследования, посвященного изучению эволюции гриппа h2N1 у людей в популяции свиней [24], [25].

Основной принцип нашего метода — изучить роль отбора, действующего на вирусную популяцию, с помощью метода максимального правдоподобия. Мы принимаем крупнозернистую модель квазивидов (см. [26]) для описания эволюции вирусной популяции, в которой вирусы классифицируются в соответствии с нуклеотидами (здесь обозначены аллелями), присутствующими в ограниченном количестве позиций (или локусов) в их геномная последовательность.В этой модели эволюция протекает детерминированно, в зависимости только от начального состояния популяции и роли отбора за или против определенных аллелей. Рассматривая последствия для динамики популяции различных предложенных моделей отбора и сравнивая их с наблюдаемой эволюцией системы, мы оцениваем, как отбор работал.

Низкая скорость рекомбинации в сегментах РНК вируса гриппа [27], [28] в сочетании с высокой частотой вирусных мутаций приводит к сложной эволюционной динамике, причем судьба мутаций сильно зависит от генетического автостопа и клональной интерференции [29]. — [31].Таким образом, различение эффектов отбора требует учета взаимодействий между аллелями в разных локусах [32]. Здесь это достигается путем рассмотрения частот гаплотипов, наборов последовательностей с конкретными аллелями в определенных локусах (например, аллель C в локусе i и аллель T в локусе j ).

В нашей модели вирусная популяция может быть описана с потенциально любым геномным разрешением, отслеживая популяцию с точки зрения гаплотий, охватывающих произвольное количество локусов.Однако модели с более высоким локусом требуют больше вычислений. Таким образом, мы сначала применяем процесс фильтрации, чтобы вырезать локусы, в которых аллели не показывают статистических свидетельств эволюции в результате отбора. Для каждого полиморфного локуса мы используем модель эволюции с одним локусом, чтобы найти аллели, которые, по-видимому, эволюционируют с ненейтральным поведением, меняя частоту с течением времени. Изменение частоты аллеля может происходить как прямой результат отбора или из-за неравновесия по сцеплению с выбранным аллелем или аллелями в других локусах.Таким образом, чтобы различать эти случаи, когда очевидная ненейтральность наблюдается более чем в одном локусе, мы применяем к данным мультилокусную модель изменения частоты гаплотипов. Эта модель явно учитывает взаимодействия между аллелями в разных локусах и используется для определения максимального правдоподобия объяснения изменений, наблюдаемых в данных последовательности.

Как уже отмечалось в другом месте, использование данных вирусных последовательностей для понимания популяционных структур требует серьезной осторожности (например,грамм. [33], [34]). Селективная амплификация последовательностей или общая систематическая ошибка при секвенировании может создать неверную картину популяции в целом. Рекомбинация, индуцированная ПЦР, может привести к ложным измерениям неравновесия по сцеплению между аллелями в разных локусах. Мы обсуждаем возможное влияние каждого из этих факторов на наши результаты.

Результаты

Были проанализированы данные о вирусных последовательностях, собранные в предыдущем эксперименте по передаче [25]. Обзор структуры этого эксперимента показан на рисунке 1.Цепь инфекции была распространена путем содержания пар неинфицированных свиней с парами инфицированных свиней, причем ранее инфицированные свиньи удалялись после того, как произошла передача. На протяжении всего эксперимента у свиней собирали образцы с помощью мазков из носа, при этом вирусные последовательности амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР и секвенировали по Сэнгеру. Вирусные последовательности были собраны у большинства свиней; для 16 из 24 свиней, участвовавших в эксперименте, данные были собраны в более чем один момент времени, что является важным предварительным условием для нашего метода.Для образцов, собранных у этих животных, глубина секвенирования варьировалась от 6 до 81 последовательности (в среднем 51) от свиньи в заданный момент времени, при этом данные собирались до пяти временных точек в течение инфекции. Между отдельными инфекциями наблюдалась ограниченная передача вариантов.

Рис. 1. Доказательства отбора были обнаружены у вирусов от шести животных в двух экспериментах.

Каждая свинья представлена ​​кружком, пронумерованным индексом. Стрелки между свиньями обозначают потенциальные случаи передачи.Свиньи, вакцинированные до заражения, обведены красным; невакцинированные свиньи обведены черным контуром. Подчеркнуто количество свиней, по которым данные о вирусной популяции были доступны для более чем одной временной точки. Свиньи, у которых был произведен отбор, выделены оранжевым цветом.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g001

В нашем анализе ненейтральное поведение было выявлено в шести популяциях. В целом признаки отбора были относительно редкими.Хотя в популяции в целом наблюдалось очень много отдельных мутаций, большинство существенных изменений частоты аллелей происходило в небольшом количестве участков (например, рисунок 2). Таким образом, восемнадцать аллелей в наборе данных были идентифицированы как потенциально не нейтральные. Было обнаружено, что эффекты интерференции между аллелями важны; из этих восемнадцати аллелей в общей сложности девять были идентифицированы как действительно находящиеся в процессе отбора, изменения частоты у остальных девяти можно объяснить неравновесием сцепления с другими выбранными аллелями.В популяциях, идентифицированных как ненейтральные, были обнаружены различные формы отбора, в том числе свидетельства в пользу выбора, зависящего от времени, и отбора, действующего одновременно в более чем одном локусе (выборка предполагаемых траекторий показана на Рисунке 3; далее выводы представлены на вспомогательном рисунке S1). Наша модель с множеством локусов различает случаи, когда несколько аллелей меняют частоту при независимом отборе, и случаи, когда отбор, действующий на один аллель, приводит к существенным изменениям частоты других (таблица 1).

Рисунок 2. Наблюдения за вирусной популяцией у свиньи 405.

(A) Частоты минорных аллелей больше нуля, зарегистрированные в каждом локусе с течением времени. Вертикальные черные линии указывают локусы, в которых было обнаружено явное ненейтральное поведение в частоте минорного аллеля; индексы для этих локусов отображаются над рисунком. В локусе 844 можно увидеть постоянное увеличение частоты минорных аллелей с течением времени; в локусе 553 частота минорного аллеля увеличивается между 2 и 3 днями, а затем уменьшается до нуля.В локусе 447 частота аллеля меньшинства достигает значения, близкого к 0,4 в конечный момент времени; более низкая частота аллелей наблюдается в соседнем локусе 446. (B) Частоты гаплотипов для аллелей в трех локусах, которые демонстрируют ненейтральное поведение.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g002

Рис. 3. Графики частот репрезентативных гаплотипов для различных моделей отбора.

Сравнительная модель подходит для Pig104: Модель постоянного отбора против мутации G → A в локусе 113 превосходит нейтральную модель, Pig109: Модель, в которой две из трех мутаций в локусах 553, 696 и 914 превосходят результаты модели, в которых одна или ни одна из этих мутаций находится в процессе отбора. Pig405: Модель отбора с двумя локусами постоянного отбора для мутации G → A в локусе 844 с переменным, убывающим отбором для мутации A → G в локусе 553 дала наилучшее соответствие данным. Pig412: Модель зависящего от времени отбора в локусе 696 с постоянным отрицательным отбором в локусе 48 была оптимальной. Цветные полосы погрешностей показывают 95% доверительные интервалы для предельной частоты каждого гаплотипа с учетом наблюдения; планки погрешностей смещены относительно соответствующих временных точек, чтобы их можно было идентифицировать.Выводы показаны только для гаплотипов, которые наблюдались в данных последовательности. В Pig405 частота гаплотипа CAA скрыта под частотой TAA.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g003

У Pig104 были обнаружены убедительные доказательства [35] отрицательного отбора, действующего против мутации G → A в локусе 114, с предполагаемым коэффициентом отбора — 1,6 за 12 часов (ч). Такая величина отбора относительно велика; для сравнения, аллель с частотой 50% с коэффициентом отбора -1 за 12 часов снизился бы до 12% частоты через один день и до менее 2% через 2 дня.Отборная мутация в этом случае синонимична, так что наблюдение сильно вредного отбора, возможно, вызывает удивление. Хотя с использованием нашего метода не было выявлено никаких статистических доказательств отбора по этому аллелю у других свиней, такой же полиморфизм был обнаружен в данных, собранных в самый ранний момент времени для свиней 115 и 116, но не в последующие моменты времени, что согласуется с гипотеза об отрицательном отборе по этому нуклеотиду во всех вирусных популяциях.

У Pig109 были обнаружены убедительные доказательства положительного отбора по крайней мере по двум из трех аллелей; в пользу полиморфизма G → A в локусе 553, полиморфизма A → G в локусе 696 или полиморфизма G → A в локусе 914.Фиксация всех трех из этих мутаций произошла между двумя образцами, и модели с любой одной из этих мутаций в качестве выбранного аллеля работали одинаково хорошо, давая оценочные коэффициенты отбора от 3,0 до 3,1 за 12 часов для выбранного аллеля. Совместное рассмотрение частот гаплотипов с четырьмя локусами предоставило доказательства того, что по крайней мере две из этих мутаций независимо подвергались отбору. Наиболее вероятная модель имела коэффициенты 2,8 на 12 часов в каждом из локусов 696 и 914. Однако разница между аддитивными моделями с двумя локусами была небольшой, и модели, в которых любые два из трех полиморфизмов находились в стадии отбора, работали одинаково хорошо ( Вспомогательная таблица S1).Интересной особенностью этого результата является то, что пары мутантных аллелей, которые, как предполагается, находятся в процессе отбора, сильно сцеплены, мутантные аллели в локусах 696 и 914 появляются только вместе в последовательности, а не изолированно. Вывод о том, что отбор действует в двух локусах, а не только в одном локусе, возникает из эффекта мутации в модели; этот результат более подробно рассматривается во вспомогательной информации. Мы отмечаем, что в то время как полиморфизм в локусе 696 является синонимом, полиморфизм в локусе 696 не является синонимичным по характеру, что соответствует мутациям D185N и S305N (первый содержится в области эпитопа Ca2 [36]).

У свиньи 115 были обнаружены слабые доказательства положительного отбора в пользу полиморфизма G → A в локусе 188 с предполагаемым коэффициентом отбора 1,2 за 12 часов. Этот полиморфизм не является синонимом и представляет собой аминокислотную замену G63E. Использование этого результата против выводов из данных последовательности, которые были рандомизированы во времени, в значительной степени поддержало этот вывод; из всего 200 наборов данных рандомизированной последовательности более сильный сигнал в пользу модели постоянного отбора был выявлен только в восьми случаях.Подробности начальной загрузки всех результатов приведены в вспомогательном тексте S1 и на вспомогательном рисунке S2.

У Pig405 были обнаружены убедительные доказательства положительного отбора, действующего на полиморфизм G → A в локусе 844, с коэффициентом отбора 0,4 за 12 ч, наряду с одновременным, зависящим от времени отбором, действующим на полиморфизм A → G в локусе 553. Отбор в этом втором локусе был первоначально положительным, со средней силой 0,9 за 12 ч в течение первого временного интервала, слабо отрицательной в течение второго временного интервала, со средней силой -0.1 за 12 часов, затем, наконец, сильно отрицательный, со средней величиной более -2 за 12 часов для последнего временного интервала. Каждый из этих полиморфизмов несинонимичен (соответствует мутациям V282I и N185D соответственно; мутация в локусе 553 идентична мутации, наблюдаемой в Pig109, хотя и в обратном направлении). Выявление зависимого от времени отбора, действующего на последнюю, мутацию эпитопа, представляет особый интерес, что повышает вероятность того, что это соответствует адаптивному иммунному ответу хозяина на вирус.В этой популяции величина зависящего от времени выбора, сделанная для последней временной точки, была большой и отрицательной, но ее трудно было идентифицировать с точностью. Это происходит из-за зависящей от времени модели отбора, сочетающейся с наблюдаемой частотой аллеля, равной нулю в конечный момент времени. Исключая влияние частот аллелей в других локусах, данные в таком случае могут привести к выводу о произвольно сильном отрицательном отборе; временное разрешение, при котором собираются данные, накладывает ограничение на величину выбора, которая может быть правильно сделана [37].

У Pig410 мы выявили слабые доказательства зависящего от времени отбора, действующего на синонимичную мутацию C → T в локусе 447; в этом случае расчет начальной загрузки дал более сильный сигнал выбора, чем для реальных данных, только в трех из 200 случаев (подтверждающий рисунок S2). Зависящий от времени отбор был также идентифицирован у Pig412, где были найдены убедительные доказательства того, что зависящий от времени отбор, действующий на синонимичную мутацию G → A в локусе 696, с дополнительными слабыми доказательствами отрицательного отбора, действующего на синонимичную мутацию A → G в локусе 48. .В рамках модели с несколькими локусами коэффициент отбора 1,8 был идентифицирован в локусе 696 для первого временного интервала. Предполагаемая сила отбора в этом локусе для второго, последнего временного интервала была неточной, но очень большой и отрицательной; значение -22,8 за 12 ч, указанное в таблице 1, снова вызвано наблюдаемой нулевой частотой в конечный момент времени.

аллелей, по которым был сделан вывод, были распределены по белку НА (вспомогательная фигура S3). Значительные изменения частоты аллелей были выявлены более чем в одной инфекции в пяти разных локусах (447, 553, 696, 824 и 844).Из них предполагалось, что отбор воздействует на локусы 696 и 844 более чем в одной инфекции. Такое повторение мутаций можно объяснить планом эксперимента; отбор, скорее всего, будет наблюдаться, когда полиморфизмы существуют в популяции с незначительной частотой, в то время как полиморфизмы с более высокой частотой с большей вероятностью будут передаваться между инфекциями.

При первоначальном сканировании потенциально ненейтральных аллелей в данных от Pig113 по трем локусам 447, 824 и 844 были идентифицированы очень слабые доказательства отбора.Однако в рамках полной модели с множеством локусов в конечном итоге предпочтение было отдано нейтральной модели эволюции. Как мы обсудим далее в Вспомогательном тексте S1, наша эволюционная модель более консервативна в определении отбора в случаях, когда несколько локусов рассматриваются одновременно.

Обсуждение

Здесь мы описали новый подход к пониманию эволюции вируса гриппа внутри хозяина, основанный на последовательностях, собранных в последующие моменты времени в рамках одной инфекции. Наш метод сочетает в себе квазивидовую модель вирусной эволюции с иерархическим набором потенциальных моделей отбора, определяя эволюционный сценарий, который лучше всего объясняет наблюдаемые данные о последовательности.Важнейшим компонентом нашей модели является учет неравновесия по сцеплению между аллелями в разных локусах; в то время как модели с одним локусом достаточно для случаев, когда только одна мутация в гене изменяется по частоте [38], наблюдение более чем одного одновременного изменения частоты аллелей в нерекомбинантном гене требует более сложного анализа.

Наш подход к выводу о выборе существенно отличается от вычисления dN / dS [25], не в последнюю очередь в рассмотрении данных на уровне частоты гаплотипа.Хотя в более ранней работе dN / dS применялся к последовательностям, собранным в вирусных популяциях от всех наблюдаемых инфекций, мы допускаем, что ландшафт отбора, действующий на вирус, может варьироваться между животными или, возможно, изменяться в пределах одного животного с течением времени. Результаты нашего анализа также различаются; в то время как значимые отношения dN / dS были идентифицированы в положениях кодонов 204 и 257, мы не нашли доказательств отбора аллелей ни в одном из этих локусов. Мы отмечаем, что в короткие сроки могут возникнуть трудности с использованием количества синонимичных и несинонимичных мутаций для вывода о выборе.Хотя этот подход имеет большую ценность при применении к расходящимся последовательностям, таким как те, которые собраны из гомологичных генов у разных видов [39], его применение к последовательностям из одной популяции дает результаты, которые может быть труднее интерпретировать [40], [41] .

Наш подход к эволюции вируса внутри хозяина основан на интерпретации данных вирусной последовательности, многократно собранных от отдельных инфекций. Моделируя эволюцию, можно оценить последствия для вирусной популяции гипотетических ландшафтов приспособленности (например,грамм. [16]). Если известно, что мутация фиксируется с заданной вероятностью в заданном временном масштабе, можно узнать необходимое преимущество приспособляемости, обеспечиваемое этой мутацией [42], [43]. Однако для получения подробной картины эволюции вируса внутри хозяина необходимо использовать секвенирование с временным разрешением, описывающее популяцию в нескольких временных точках. Наш метод обеспечивает систематический подход к умозаключению отбора; в то время как набор потенциальных моделей пригодности очень велик [44], мы строим вверх от нейтральной модели к возрастающей сложности, руководствуясь данными.Хранение данных в центре нашего подхода означает, что мы можем упустить влияние определенных эффектов фитнеса; может быть недостаточно данных, чтобы составить полную картину того, как работает эволюция. Однако наш иерархический подход означает, что при наличии точных данных, описывающих совокупность, мы не должны делать ложных выводов о наличии отбора.

Анализируя данные, мы определили отбор, действующий как на синонимичные, так и на несинонимичные мутации. Слабый отбор, действующий на синонимичные мутации, был идентифицирован для использования кодонов при гриппе [45] и против мутаций, нарушающих структуру РНК в ВИЧ [46], хотя величина предполагаемого здесь отбора значительно выше, чем в любом случае.Предполагая наличие отбора, наш метод не может сопоставить случаи отбора с конкретными биологическими механизмами; для этого обычно требуются дополнительные данные.

Одним из результатов, для которого может быть предложен биологический механизм, является вирусная популяция Pig405, где мы определили переменную и снижение отбора, действующее на несинонимичную мутацию в области эпитопа Са2, возможно, в результате специфического иммунного ответа. Для этой мутации время начала сильного отрицательного отбора на четвертый день после контакта с вирусом раньше, чем за пять дней до обнаружения адаптивного ответа, сообщенного для инфекции гриппа h4N2 у мышей [47].Кроме того, исследования по моделированию связали врожденный иммунный ответ с начальным снижением вирусной нагрузки, адаптивный ответ, ведущий к окончательному избавлению от вируса [13]. Здесь не наблюдалось снижения титра вируса во время предполагаемого отрицательного отбора, и выведение происходило через восемь дней после заражения [24]. Опять же, потребуются дополнительные данные, чтобы сделать более конкретный вывод; объединение данных о вирусной последовательности и иммунном ответе приведет к лучшему пониманию таких систем.

Допущения при моделировании

Наша эволюционная модель предполагает, что вирусная популяция генетически хорошо перемешана с хозяином и что она развивается детерминированным образом, как в отношении мутации, так и в отношении отбора. Первое из этих предположений утверждает, что каждый образец вирусов, собранный у свиньи, является репрезентативным для вирусной популяции животного в то время. Это было бы неверно, если бы, например, вирусная популяция была разделена на различные подмножества, причем отбор в каждом из них действовал по-разному.Изучение этих эффектов было невозможно с учетом изученных здесь данных.

Наше предположение о детерминированной эволюции основано на том, что основная вирусная популяция является большой по численности, то есть достаточно большой, что значительно превышает 1, где N — количество вирусов в животном, μ — мутация частота на локус, а σ — величина отбора [48]. Учитывая выбор, самое низкое разрешение, при котором мы сообщаем о выборе, 0.1 за 12 часов, что составляет два цикла репликации за время жизни инфицированной клетки [10], [15], что эквивалентно разнице в приспособленности 0,05 на поколение. Таким образом, эта часть предположения верна, если N существенно больше, чем 20 вирусов. Принимая во внимание мутацию, критерий, который является более строгим, чем критерий отбора (где μ имеет порядок 10 ^-5 [49], [50]), требуя, чтобы N было существенно больше, чем 10 ⁵ . При гриппе модели репликации в одной клетке предполагают, что в каждой клетке продуцируется порядка 10 ⁴ вирионов [51], в то время как в образцах, из которых были секвенированы вирусы, вирусная нагрузка составляет от 30 до 5500 частиц на µ л [24] было измерено; как только инфекция прогрессирует до точки, когда становится возможным вирусное секвенирование, популяция, скорее всего, достаточно велика для этого.На самых ранних стадиях инфекции стохастическое мутационное поведение может потенциально привести к неправильному выводу о частотах исходных вариантов в популяции; однако эти значения не используются для каких-либо биологических выводов о системе.

Горизонтальная передача между животными, находящимися в одном помещении, не была включена в модель; мы считаем, что это вряд ли сильно повлияло на собранные данные. Если вирусные популяции у двух одновременно инфицированных свиней существенно различались по составу, передача вирусов от одного животного к другому могла бы изменить состав вирусной популяции у второго животного.Однако вирусные популяции в этом эксперименте не различались в достаточной степени по последовательности, чтобы можно было отличить суперинфекцию от роста de novo мутаций . Кроме того, хотя титр вируса, участвующий в передаче, неизвестен, мы полагаем, что входящий титр, вероятно, будет значительно меньше, чем ранее существовавшее количество вирусов у второго инфицированного животного.

Точность данных

Второе предположение в нашем исследовании состоит в том, что собранные данные о последовательностях относительно точны.То есть мы утверждаем, что последовательности, полученные из выборки, являются репрезентативными для самой выборки. Основание нашего вывода на основе данных означает, что точность данных жизненно важна для получения полезных результатов. Например, в дополнение к необработанному количеству аллелей наш подход явно использует связи между мутациями. Наш метод учитывает возможность общей ошибки в процессе секвенирования и полностью учитывает статистический шум, присущий выборке конечных данных. Однако существуют систематические ошибки в данных, которые также могут повлиять на полученные результаты.Например, рекомбинация, индуцированная ПЦР, может изменить наблюдаемые частоты мультилокусных гаплотипов [52], [53]. Тестируя такой эффект, подгоняя экспоненциальную модель к наблюдаемому абсолютному неравновесию по сцеплению между парами аллелей, мы не нашли доказательств такой рекомбинации, не наблюдается ухудшения этой статистики с увеличением расстояния между аллелями (подтверждающий рисунок S4).

Ошибка при секвенировании также влияет на то, распознается ли мутация как находящаяся в процессе отбора.Мутации, которые предпочтительно идентифицируются методом секвенирования, будут появляться в образце с более высокими частотами, так что изменения в их частотах будут усилены, что приведет к большей вероятности того, что такие мутации были обнаружены в процессе отбора. Для этого набора данных использовался последовательный метод секвенирования для обработки всех образцов; Таким образом, мы предположили, что систематическая ошибка секвенирования является постоянной между выборками, так что наблюдаемые изменения частоты аллелей были вызваны либо конечным процессом выборки, либо процессом мутации и отбора.Оценить степень систематической ошибки в наблюдаемых последовательностях сложно, сами последовательности представляют собой единственную информацию о реальной вирусной популяции. Подсчет мутаций, наблюдаемых в данных, показал высокий коэффициент перехода: трансверсия, равный 9,7 (подтверждающий рисунок S5). Это в целом согласуется со значениями, наблюдаемыми для других популяций РНК-вирусов [54], [55], хотя измерения этого соотношения при гриппе ранее основывались на глобальных популяциях, а не внутри хозяина [56].Предвзятый отбор образцов, будь то сбор биологического образца, который не является репрезентативным для всей популяции, или в результате последующей амплификации ПЦР, также может повлиять на наши выводы. Здесь мы предположили, что данные представляют собой беспристрастную выборку реальной совокупности.

Наши выводы частично ограничены использованием последовательностей, описывающих только область HA1 вируса гриппа. Хотя наши выводы об отклонении от нейтральности в популяции не зависят от аллелей в других частях вируса, на отнесение отбора к данным аллелям могут влиять ненаблюдаемые полиморфизмы в области HA2 гриппа или если повторная сортировка была ограничена (хотя см. [57] ]) с аллелями в других вирусных сегментах.Потенциальное влияние отбора, действующего на полиморфизмы, которые не наблюдались, имеет наибольшее значение для случаев явно зависящего от времени отбора; постоянный отбор, действующий на мешающие мутации, вызывает зависящие от времени эффекты отбора [32]. Одним из примеров является случай Pig412, где сначала подразумевается положительный, затем отрицательный выбор. При этой инфекции многие гаплотипы, которые наблюдаются в промежуточный момент времени, больше не видны в конечный момент времени; этот паттерн согласуется либо с переключением в направлении отбора, действующим на синонимичную мутацию в локусе 696, как предполагалось, либо с очень сильным положительным отбором, действующим на ненаблюдаемую мутацию в консенсусном гаплотипе, вызывая избирательное сканирование позже в наблюдении.Такой сценарий гораздо менее вероятен в случае Pig405, где гаплотип, содержащий аллель, предположительно находящийся под отрицательным отбором, вытесняется в конечном временном интервале четырьмя другими гаплотипами, включая гаплотип первоначального консенсуса.

Выводы

Здесь мы описали структуру для вывода о выборе, действующем на вирусную популяцию в пределах отдельного хозяина, на основе данных последовательности с временным разрешением. Отбор внутри хозяина важен для будущей эволюции вируса гриппа H7N9 и для понимания эпидемиологии других штаммов гриппа.Во время эпидемии как рост внутри хозяина, так и передача вирусов являются важными и потенциально конкурирующими факторами; мутация, полезная для роста внутри хозяина, может оказаться вредной для передачи и наоборот. Хотя здесь мы рассмотрели только первый из этих факторов, наш метод можно легко использовать для вывода о роли отбора для передачи при определенных условиях. Прежде всего, потребуется существенная преемственность между нативной и передаваемой популяциями, так чтобы изменения частот аллелей до и после передачи были в первую очередь результатом отбора; серьезное узкое место исказит структуру населения.Во-вторых, потребуется ясность в отношении источника каждой инфекции; в рассмотренных экспериментах, где инфекция начинается с неизвестной смеси вирусов от двух других людей, невозможно оценить роль отбора в передаче. События передачи в анализируемых здесь данных обсуждались в другом месте [58]. В более простых случаях, когда передача происходит между известными индивидуумами и когда преемственность между вирусными популяциями более очевидна (например, [59]), использование нашего метода для вывода результатов отбора, воздействующего на события передачи, вероятно, будет достижимым.

Сбор данных о последовательностях, описывающих эволюцию гриппа внутри хозяина, в настоящее время относительно редок, хотя мы ожидаем, что улучшения в технологии секвенирования сделают такие данные все более доступными. Расширенный сбор данных о последовательностях от пациентов и из эволюционных экспериментов значительно расширит наше понимание вирусной инфекции. Наш подход увеличивает ценность такой работы, подробно описывая силы, лежащие в основе вирусной эволюции внутри хозяина.

Методы

Описание вирусной динамики

Теория квазивидов [26] обеспечивает детерминированное описание эволюции подверженных мутациям самовоспроизводящихся организмов; эта структура оказала глубокое влияние на исследования вирусной эволюции РНК [60] — [63]. Чтобы описать эволюционную динамику вируса гриппа в пределах отдельного хозяина, мы применяем грубозернистую модель квазивидов, в которой вирусная популяция описывается как гаплотипы, охватывающие ограниченный набор локусов, а не как полные вирусные последовательности.В частности, мы представляем вирусную популяцию как частотный вектор, определенный в дискретные моменты времени и состоящий из элементов, где — доля последовательностей в популяции с гаплотипом; то есть с нуклеотидами в подмножестве локусов вирусного генома.

Для моделирования мутации между гаплотипами мы предположили постоянную скорость мутации, μ , между любыми двумя конкретными нуклеотидами в данном локусе, вероятность мутации от гаплотипа к гаплотипу в одном поколении дается формулой (1) где — Расстояние Хэмминга между двумя последовательностями гаплотипов.

Отбор учитывали путем приписывания каждому гаплотипу (потенциально зависящего от времени) коэффициента отбора. Влияние отбора на частоту гаплотипов между временами и, таким образом, определялось функцией: (2) где. Принимая во внимание эволюцию гриппа, мы предположили, что точки времени должны быть расположены с 12-часовыми интервалами, что примерно соответствует времени, необходимому для цикла внутриклеточного роста внутри клетки [10]. В рамках такого раунда роста каждый вирус проходит два раунда репликации, моделируемых как имеющие равные скорости мутаций, с параметром, представляющим общую скорость мутации на нуклеотид на поколение, равное 10 ^-5 [49], [50].Предполагалось, что отбор воздействует на вирусную популяцию после того, как она покинет клетку, давая соотношение (3) где — матрица, состоящая из элементов, моделирующая один раунд репликации. Таким образом, поведение системы детерминированно определяется параметрами выбора и начальным состоянием системы, заданным элементами вектора.

Отметим, что, хотя данные о последовательностях собирались в известное время на протяжении каждого заражения, точный момент начала каждого заражения неизвестен.Здесь мы предположили, что прошло ровно 24 часа до первого наблюдаемого набора данных о последовательности заражения. Хотя неопределенность в этом значении имеет последствия для точности элементов предполагаемого вектора, окончательных выводов из этих значений сделано не было.

Определение ненейтрального поведения и выбор

Вывод о выборе был выполнен путем сравнения значений максимального правдоподобия, полученных в рамках иерархической серии моделей, каждая из которых определяет параметры и.Модель крупных квазивидов может быть выражена в терминах гаплотипов произвольной длины. Опишем общую модель ниже.

Эволюционная модель.

Мы рассматриваем популяцию с произвольным числом полиморфных локусов, каждый из которых содержит аллели, которые могут или не могут находиться в процессе отбора. Каждый локус может содержать один из четырех нуклеотидов, так что вектор, описывающий начальное состояние популяции, имеет элементы, потенциально большое количество. Поэтому, чтобы уменьшить сложность модели, мы рассматривали только согласованные и наибольшие миноритарные аллели в каждом локусе.В каждом локусе консенсусный аллель, обозначенный 0, был определен как мажоритарный аллель в выборке, взятой из популяции при первом наблюдении. Затем определяли самый большой миноритарный аллель, обозначенный 1, чтобы максимизировать общее количество наблюдаемых последовательностей, которые имели один из гаплотипов в локусах. Если в данном локусе присутствовало более двух аллелей, это упрощение искажает правдоподобие полученной модели. Однако в рассматриваемом наборе данных такие случаи были крайне редкими; мы обсуждаем это далее в вспомогательном тексте S1.

Параметры описывающие и определялись независимо. Начальная частота гаплотипа включалась в качестве переменной в модель, если этот гаплотип наблюдался хотя бы один раз в данных последовательности, другие начальные частоты были установлены на ноль. Параметры отбора были включены в соответствии с применяемой моделью отбора. В базовой нейтральной модели мы устанавливаем величину отбора для каждого гаплотипа и момент времени равными нулю. В других моделях отбора вариантный аллель может быть либо нейтральным, либо находиться в условиях постоянного или зависящего от времени отбора в каждом локусе.Если аллель подвергался отбору более чем в одном локусе, взаимодействие между этими аллелями могло быть аддитивным или эпистатическим по своей природе. Таким образом, можно рассматривать произвольные модели отбора.

В модели отбор применялся ко всем релевантным гаплотипам. В случае постоянного отбора в одном локусе, в котором аллель 1 в локусе подвергался отбору с величиной, значения будут равны для всех гаплотипов, в которых локус имел аллель 1, и для всех времен.

Был включен последний параметр ошибки, определяющий вероятность того, что секвенирование вернет ошибочный гаплотип для данной последовательности. Предполагая, что при чтении любого данного гаплотипа возникает не более одной ошибки (т. Е. Частота ошибок низкая), мы определяем частоту гаплотипа, описывая частоту гаплотипа в модели во время, как (4) где рассчитывается, как описано выше .

Учитывая набор параметров, описывающих начальное состояние популяции, и коэффициенты отбора, действующие на совокупность, мы можем записать вероятность этих параметров как (5) где — общее количество выборок, собранных в точке, — количество выборки с гаплотипом в момент времени, — это прогнозируемая частота гаплотипа во время и представляет собой набор всех гаплотипов по локусам в.

Байесовский информационный критерий (BIC) [64] был использован для сравнения моделей с разными уровнями сложности. Учитывая оптимизированные значения логарифмического правдоподобия для разных моделей, описывающих один и тот же набор данных, лучшая модель была определена как модель, дающая наименьшее значение BIC (6), где — количество параметров, включенных в модель, а — общее количество последовательностей в наборе данных. , суммированные по временным точкам. Мы отмечаем, что количество начальных частот, полученных при вычислении, определяется свойствами данных; Различия между моделями системы полностью связаны с количеством параметров, описывающих выбор.

Начиная с нейтральной модели, были протестированы модели отбора возрастающей сложности с добавлением локусов при выборе. Этот процесс продолжался либо до тех пор, пока добавление отбора к аллелю в другом локусе не улучшило значение BIC, либо пока вероятность модели не стала достаточно близкой к максимальной теоретически достижимой вероятности (полученной, когда предполагаемые частоты гаплотипов были идентичны наблюдаемым частотам), что добавление дополнительного параметра неизбежно приведет к увеличению BIC.

Идентификация аллелей, потенциально находящихся в процессе отбора.

Вышеупомянутый метод основан на предварительном выборе локусов, содержащих аллели, которые потенциально находятся в процессе отбора. В проведенном здесь анализе эти локусы были идентифицированы с использованием версии описанной выше модели с одним локусом. Для каждого полиморфного локуса наблюдаемые частоты аллелей с течением времени использовались для расчета вероятности того, что самый большой аллель меньшинства находился под постоянным или зависящим от времени отбором, эти значения сравнивали с вероятностью наблюдения в нейтральной модели.Вероятность рассчитывалась с использованием биномиальной модели (7), где — количество последовательностей, наблюдаемых в данный момент с аллелем 1 в локусе, и — предполагаемая частота последовательностей с аллелем 1 в локусе в данный момент. Это оценивает, проявляет ли аллель явно ненейтральное поведение, изменяя частоту либо из-за присущего отбора, либо из-за неравновесия по сцеплению с другими ненейтральными аллелями. Все локусы, для которых модель ненулевого отбора давала большую вероятность, чем модель нейтральности, были включены в набор.Наглядное представление нашего метода приведено на рисунке 4.

Рисунок 4. Модели выбора.

(A) Пример модели с одним локусом. Одиночный аллель, обозначенный 1 (красный) в локусе драйвера, считается потенциально находящимся в процессе отбора; исходный согласованный аллель обозначен 0. На изменения частот аллелей в локусе со временем влияют мутации и отбор; аллели, обозначенные 2 и 3, относятся к оставшимся двум нуклеотидам в этом локусе. Изменения частоты аллелей сравниваются с изменениями, полученными в моделях, в которых аллель 1 является либо нейтральным, либо при постоянном или зависящем от времени отборе; соответствующие параметры для выбора и для начального состояния системы изучаются. (B) Пример модели с двумя локусами. Мы предполагаем, что аллели в локусах и, как было обнаружено, демонстрируют очевидное ненейтральное поведение, а другие аллели неотличимы от нейтральности. Мы делим популяцию на гаплотипы на основе аллелей, присутствующих в этих локусах, давая частоты гаплотипов,, и. Затем наблюдаемые частоты сравниваются с частотами, полученными с помощью различных моделей отбора в одном или двух из этих локусов. На этом рисунке показаны примеры последовательностей для одного момента времени.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.g004

Описание степени поддержки модели.

В тексте мы описываем разницу в BIC более чем на 2 единицы как свидетельство в пользу модели, с разницей более чем в 6 единиц как убедительное свидетельство в пользу модели (см. [35]). Мы описываем разницу BIC менее 2 единиц как слабое свидетельство в пользу модели. В качестве дополнительного теста на достоверность выводов из модели с одним локусом мы провели оценки бутстрэппинга против различий BIC, полученных из данных рандомизированной последовательности; во всех случаях, когда мы выявили более чем слабые доказательства для выбора, эти тесты подтвердили наш результат (см. вспомогательный текст S1).

Валидация метода

Тест способности метода различать выбранные и невыбранные аллели и правильно делать выводы о величине отбора, действующего на локус, был выполнен путем выполнения анализа смоделированных данных. Для смоделированных популяций с одним отобранным аллелем коэффициент корреляции более 0,95 был обнаружен между реальными и предполагаемыми коэффициентами отбора с эквивалентной корреляцией 0,91 для смоделированных систем с двумя отобранными аллелями.Дополнительные подробности приведены в вспомогательном тексте S1 и вспомогательных рисунках S6 и S7.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Выводы, сделанные методом единого локуса. Подбор модели и соответствующие логарифмические вероятности показаны для нейтральной, постоянной выборки ( σ ) и зависящей от времени ( σ ( t )) моделей выбора для выбранных локусов в данных. Модель постоянного отбора дает оптимальную оценку BIC для локуса Pig115 188 и локуса Pig405 844.Модель зависящего от времени отбора дает оптимальную оценку BIC для локуса Pig410 447; нейтральная модель предпочтительна для локуса 114 Pig115. Планки ошибок дают 95% -ные интервалы апостериорной вероятности для каждой частоты аллеля в каждый момент времени с учетом наблюдаемых последовательностей. Оптимальный балл BIC, определенный для каждого набора данных, выделен жирным шрифтом.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Загрузка выводов BIC. Разница в BIC между отобранными и нейтральными моделями для единственного аллеля, дающая наиболее убедительные доказательства выбора у каждого животного, измеренная с помощью BIC. Здесь положительная разница BIC свидетельствует в пользу выбранной модели. Здесь значения реальных данных последовательностей сравниваются с эквивалентной статистикой для случайных перестановок последовательностей, собранных от каждого животного. Каждая гистограмма показывает реальную и случайную статистику; красная стрелка показывает положение в распределении реального вывода.В Pig104, Pig109 и Pig412 реальные данные давали более сильный сигнал выбора, чем все 200 случайных наборов данных. В Pig405, Pig410 и Pig115 количество случайных наборов данных, дающих более сильные сигналы выбора, составляло один, три и восемь соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s002

(PDF)

Рисунок S3.

Примерные местоположения остатков, затронутых нуклеотидными мутациями в системах, для которых было идентифицировано ненейтральное поведение. Остатки, соответствующие полиморфизму нуклеотидов, показаны как для синонимичных (оранжевый), так и для несинонимичных (красный) мутаций. Участок HA1 для одной единицы тримерного белка показан желтым; область HA2, которая не была включена в данные последовательности, показана синим цветом. Две другие части тримера показаны серым цветом. Остаток, соответствующий положению нуклеотида 553, находится в сайте эпитопа Са2.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s003

(PDF)

Рисунок S4.

Доказательств рекомбинации, индуцированной ПЦР, не обнаружено. Серые точки показывают значения нормализованной статистики неравновесия по сцеплению D для аллелей, находящихся на разном расстоянии друг от друга. Сплошная красная линия показывает среднее значение скользящего окна D при ширине 100 баз. Пунктирная серая линия показывает оптимальное соответствие данным экспоненциальной линии регрессии. Сравнение BIC экспоненциальной регрессии с линейной моделью отдавало предпочтение последней, давая оценку для рекомбинации, индуцированной ПЦР, равной нулю.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Спектр мутаций, наблюдаемых в популяции. (A) Число появлений мутаций, наблюдаемых в данных последовательности. Мутации подсчитывали относительно согласованной последовательности, считая несколько наблюдений одной и той же мутации у одного и того же животного за одно событие. (B) Доля мутаций, наблюдаемых в данных последовательности, масштабированная по содержанию нуклеотидов в консенсусной последовательности.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s005

(PDF)

Рисунок S6.

Результаты получены из смоделированных популяций, в которых отбирался единственный локус. (A) Показатели истинно положительных (красный) и ложноположительных (черный) для идентификации выбора в выбранном локусе после использования модели вывода с несколькими локусами, описанной в основном тексте. Синяя линия показывает частоту ложных срабатываний для идентификации отбора с использованием модели с одним локусом; учет интерференции между аллелями дает существенно лучший результат. (B) Предполагаемые коэффициенты отбора, полученные из модели с несколькими локусами. Индивидуальные выводы показаны маленькими красными кружками; случаи, для которых отбор не отличался от нейтральности, представлены как имеющие нулевой предполагаемый отбор. Черная линия показывает полное соответствие между реальными и предполагаемыми коэффициентами отбора.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s006

(TIF)

Рисунок S7.

Результаты получены из смоделированных популяций, в которых аллели в двух локусах эволюционировали в результате аддитивного отбора. (A) Показаны комбинированные ошибки вывода пар коэффициентов выбора. Ошибка E в каждом случае вычисляется как евклидово расстояние между реальным и предполагаемым коэффициентами выбора. (B) Предполагаемые коэффициенты отбора, полученные из модели с несколькими локусами для отдельных аллелей. Выводы показаны в виде маленьких красных кружков; случаи, для которых отбор не отличался от нейтральности, представлены как имеющие нулевой предполагаемый отбор.Черная линия показывает полное соответствие между реальными и предполагаемыми коэффициентами отбора.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s007

(TIF)

Таблица S1.

Дальнейшие выводы для Pig109. В каждом конкретном случае приводится оптимальная модель каждого типа. Небольшие различия BIC были выявлены между случаями отбора различных аллелей или комбинаций аллелей. Коды моделей: σ : Постоянный выбор в одном локусе; 2 σ : Аддитивный отбор по двум локусам.Значение BIC для оптимальной модели выделено жирным шрифтом.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s008

(PDF)

Текст S1.

Подробная информация об оптимизации правдоподобия журнала. Рассмотрение случаев множественных аллелей в одном локусе. Важность мутации для выводов, сделанных для Pig109 и Pig113. Методы построения фигур. Вывод о выборе из смоделированных популяций. Начальная загрузка посредством вывода выбора из данных рандомизированной последовательности.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003755.s009

(PDF)

Благодарности

Мы хотим поблагодарить Элеонору Грей и Саймона Уотсона за обсуждение вирусного секвенирования.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: CJRI AF VM. Проведены эксперименты: CJRI. Проанализированы данные: CJRI. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: CJRI. Написал статью: CJRI AF VM. Интерпретировал результаты: CJRI AF VM.

Ссылки

1. 1.Гао Р., Цао Б., Ху Й., Фэн З., Ван Д. и др. (2013) Инфицирование человека новым вирусом птичьего гриппа A (H7N9). N Engl J Med 368: 1888–97.
2. 2. Lai KY, Ng GWY, Wong KF, Hung IFN, Hong JKF и др. (2013) Инфекция вируса птичьего гриппа человека H7N9: обзор и оценка риска пандемии. Новые микробы и инфекции 2: e48.
3. 3. Моренс Д.М., Таубенбергер Дж.К., Фаучи А.С. (2013) Пандемические вирусы гриппа — надежды на то, что дорога не взята. N Engl J Med 368: 2345–8.
4. 4. Шортридж К.Ф. (1992) Пандемический грипп: зооноз? Семинары по респираторным инфекциям 7: 11–25.
5. 5. Вулф Н.Д. (2005) Охота на диких животных, вырубка лесов и прогноз возникновения зоонозных заболеваний. Emerging Infect Dis 11: 1822–1827.
6. 6. Morse PSS, Mazet PJA, Woolhouse PM, Parrish PCR, Carroll D, et al. (2012) Прогнозирование и предотвращение следующей пандемии зоонозов. Ланцет 380: 1956–1965.
7. 7. Лю Д., Ши В., Ши И, Ван Д., Сяо Х и др.(2013) Происхождение и разнообразие новых вирусов птичьего гриппа A H7N9, вызывающих инфицирование человека: филогенетический, структурный и коалесцентный анализ. Ланцет 381: 1926–32.
8. 8. Pepin KM, Lass S, Pulliam JRC, Read AF, Lloyd-Smith JO (2010) Идентификация генетических маркеров адаптации для наблюдения за вирусными скачками хозяина. Nat Rev Microbiol 8: 802–13.
9. 9. Мурильо Л.Н., Мурильо М.С., Перельсон А.С. (2013) К многомасштабному моделированию инфекции гриппа. Дж. Теор Биол. 332: 267–290.
10. 10. Baccam P, Beauchemin C, Macken CA, Hayden FG, Perelson AS (2006) Кинетика вирусной инфекции гриппа A у людей. Журнал вирусологии 80: 7590–7599.
11. 11. Саенс Р.А., Куинливан М., Элтон Д., Макрэ С., Бланден А.С. и др. (2010) Динамика вирусной инфекции и патологии гриппа. Журнал вирусологии 84: 3974–83.
12. 12. Митчелл Х., Левин Д., Форрест С., Бошемин САА, Типпер Дж. И др. (2011) Более высокий уровень эффективности репликации вируса пандемического гриппа 2009 (h2N1), чем у сезонных и птичьих штаммов: кинетика из культуры эпителиальных клеток и компьютерное моделирование.Журнал вирусологии 85: 1125–35.
13. 13. Pawelek KA, Huynh GT, Quinlivan M, Cullinane A, Rong L, et al. (2012) Моделирование динамики вирусной инфекции гриппа внутри хозяина, включая иммунные ответы. PLoS Computational Biology 8: e1002588.
14. 14. Luo S, Reed M, Mattingly JC, Koelle K (2012) Влияние иммунного статуса хозяина на внутреннюю и популяционную динамику антигенного иммунного бегства. Журнал Королевского общества Интерфейс 9: 2603–13.
15. 15.Heldt FS, Frensing T, Reichl U (2012) Моделирование внутриклеточной динамики репликации вируса гриппа для понимания контроля синтеза вирусной РНК. Журнал вирусологии 86: 7806–17.
16. 16. Кумбс Д., Гилкрист М.А., Болл С.Л. (2007) Оценка важности давления отбора внутри и между хозяевами на эволюцию хронических патогенов. Theor Popul Biol 72: 576–91.
17. 17. Волков И., Пепин К.М., Ллойд-Смит Дж.О., Банавар Дж. Р., Гренфелл Б.Т. (2010) Синтез селективного давления внутри хозяина и на уровне популяции на вирусные популяции: влияние адаптивного иммунитета на ускользание от вирусного иммунитета.Журнал Королевского общества Интерфейс 7: 1311–8.
18. 18. Park M, Loverdo C, Schreiber SJ, Lloyd-Smith JO (2013) Множественные шкалы отбора влияют на эволюционное появление новых патогенов. Philos Trans R Soc Lond, B, Biol Sci, 368: 20120333.
19. 19. Russell CA, Fonville JM, Brown AEX, Burke DF, Smith DL, et al. (2012) Возможность эволюции вируса гриппа A / H5N1, передаваемого через дыхательные пути, в организме млекопитающего-хозяина. Наука 336: 1541–7.
20. 20.Ри С.Ю., Гонсалес М.Дж., Кантор Р., Беттс Б.Дж., Равела Дж. И др. (2003) База данных обратной транскриптазы и протеазных последовательностей вируса иммунодефицита человека. Исследование нуклеиновых кислот 31: 298–303.
21. 21. Гедин Э., Холмс Э.С., ДеПасс СП, Пинилла Л.Т., Fitch A и др. (2012) Наличие устойчивых к осельтамивиру пандемических минорных вариантов A / h2N1 до медикаментозной терапии с последующим отбором и передачей. Журнал инфекционных болезней 206: 1504–11.
22. 22. PR Мерсии, Бэйли Дж.Дж., Дэйли Дж., Элтон Д., Джервис К. и др.(2010) Эволюционная динамика вируса гриппа лошадей внутри и между хозяевами. Журнал вирусологии 84: 6943–54.
23. 23. Murcia PR, Baillie GJ, Stack JC, Jervis C, Elton D, et al .. (2013) Эволюция вируса гриппа лошадей у ​​вакцинированных лошадей. Журнал вирусологии: 1–5.
24. 24. Ллойд LE, Jonczyk M, Jervis CM, Flack DJ, Lyall J и др. (2011) Экспериментальная передача вируса птичьего гриппа h2N1 свиней между иммунологически неопытными и вакцинированными свиньями.Грипп и другие респираторные вирусы 5: 357–64.
25. 25. PR Мерсии, Хьюз Дж., Баттиста П., Ллойд Л., Бэйли Дж. Дж. И др. (2012) Эволюция евразийского вируса птичьего гриппа у наивных и вакцинированных свиней. Патогены PLoS 8: e1002730.
26. 26. Эйген М., Шустер П. (1977) Гиперцикл. Принцип естественной самоорганизации. Часть A: Возникновение гиперцикла. Naturwissenschaften 64: 541–65.
27. 27. Boni MF, Zhou Y, Taubenberger JK, Holmes EC (2008) Гомологичная рекомбинация очень редка или отсутствует в вирусе гриппа человека А.Журнал вирусологии 82: 4807–11.
28. 28. Lam TTY, Chong YL, Shi M, Hon CC, Li J и др. (2013) Систематический филогенетический анализ вируса гриппа А позволяет выявить множество новых мозаичных сегментов генома. Инфекция, генетика и эволюция: журнал молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики инфекционных болезней 18: 367–378.
29. 29. Miralles R, Gerrish PJ, Moya A, Elena SF (1999) Клональная интерференция и эволюция РНК-вирусов. Наука 285: 1745–7.
30. 30.Strelkowa N, Lässig M (2012) Клональное вмешательство в эволюцию гриппа. Генетика 192: 671–82.
31. 31. Иллингворт CJR, Мустонен В. (2012) Компоненты отбора в эволюции вируса гриппа: эффекты сцепления превосходят неотъемлемый отбор. Патогены PLoS 8: e1003091.
32. 32. Иллингворт CJR, Мустонен В. (2011) Различение мутаций водителя и пассажира в эволюционной истории, классифицированных по интерференции. Генетика 189: 989–1000.
33. 33. Depledge DP, Palser AL, Watson SJ, Lai IYC, Gray ER и др. (2011) Специфический захват и полногеномное секвенирование вирусов из клинических образцов. PLoS ONE 6: e27805.
34. 34. Скумс П., Манкузо Н., Артеменко А., Торк Б., Мандою И. и др. (2013) Реконструкция структуры вирусной популяции на основе данных секвенирования следующего поколения с использованием мульти-товарных потоков. BMC Bioinformatics 14 Приложение 9: S2.
35. 35. Kass RE, Raftery AE (1995) Байесовские факторы.Журнал Американской статистической ассоциации 90: 773–795.
36. 36. Brownlee GG, Fodor E (2001) Прогнозируемая антигенность гемагглютинина пандемии испанского гриппа 1918 года предполагает птичье происхождение. Philos Trans R Soc Lond, B, Biol Sci 356: 1871–6.
37. 37. Illingworth CJR, Mustonen V (2012) Метод вывода положительного отбора по динамике маркеров в бесполой популяции. Биоинформатика (Оксфорд, Англия) 28: 831–7.
38. 38. Фолл М., По Ю.П., Рензетт Н., Феррер-Адметлла А., Банк С и др.(2014) Устойчивость к лекарственным препаратам вируса гриппа: популяционная генетическая перспектива с выборкой во времени. PLoS Genetics 10: e1004185.
39. 39. Hurst LD (2002) Отношение Ka / Ks: диагностика формы эволюции последовательности. Тенденции Genet 18: 486.
40. 40. Кряжимский С.А., Плоткин Ю.В. (2008) Популяционная генетика dN / dS. PLoS Genetics 4: e1000304.
41. 41. Mugal CF, Wolf JBW, Kaj I (2013) Почему время имеет значение: эволюция кодонов и временная динамика dN / dS.Mol Biol Evol 31: 212–31.
42. 42. Fonville JM, Burke DF, Lewis NS, Katzelnick LC, Russell CA (2013) Количественная оценка преимущества пригодности замен полимеразы в вирусах гриппа A / H7N9 во время адаптации к человеку. PLoS ONE 8: e76047.
43. 43. Кимура М. (1962) О вероятности фиксации мутантных генов в популяции. Генетика 47: 713–719.
44. 44. Franke J, Klözer A, de Visser JAGM, Krug J (2011) Эволюционная доступность мутационных путей.PLoS Computational Biology 7: e1002134.
45. 45. Кряжимский С.А., Базыкин Г.А., Душофф Дж. (2008) Естественный отбор для использования нуклеотидов в синонимичных и несинонимичных сайтах в генах вируса гриппа А. Журнал вирусологии 82: 4938–45.
46. 46. Zanini F, Neher RA (2013) Количественная оценка отбора против синонимичных мутаций в эволюции env ВИЧ-1. Журнал вирусологии 87: 11843–11850.
47. 47. Miao H, Hollenbaugh JA, Zand MS, Holden-Wiltse J, Mosmann TR и др.(2010) Количественная оценка раннего иммунного ответа и кинетики адаптивного иммунного ответа у мышей, инфицированных вирусом гриппа А. Журнал вирусологии 84: 6687–98.
48. 48. Рузин И.М., Родриго А., Коффин Дж. М. (2001) Переход между стохастической эволюцией и детерминированной эволюцией в присутствии отбора: общая теория и приложение к вирусологии. Обзоры микробиологии и молекулярной биологии 65: 151–185.
49. 49. Парвин Дж. Д., Москона А., Пан В. Т., Лейдер Дж. М., Палезе П. (1986) Измерение скорости мутаций вирусов животных: вируса гриппа А и полиовируса типа 1.Журнал вирусологии 59: 377–83.
50. 50. Санхуан Р., Небот М.Р., Кирико Н., Мански Л.М., Белшоу Р. (2010) Частота вирусных мутаций. Журнал вирусологии 84: 9733–9748.
51. 51. Сидоренко Ю., Райхл Ю. (2004) Структурированная модель репликации вируса гриппа в клетках MDCK. Biotechnol Bioeng 88: 1–14.
52. 52. Meyerhans A, Vartanian JP, Wain-Hobson S (1990) Рекомбинация ДНК во время ПЦР. Nucleic Acids Res 18: 1687–91.
53. 53. Шао В., Больц В.Ф., Шпиндлер Дж. Э., Кирни М. Ф., Мальдарелли Ф. и др.(2013) Анализ 454 ошибок секвенирования, источников ошибок и рекомбинации артефактов для обнаружения низкочастотных мутаций лекарственной устойчивости в ДНК ВИЧ-1. Ретровирология 10: 18.
54. 54. Sharp PM, Bailes E, Gao F, Beer BE, Hirsch VM и др. (2000) Происхождение и эволюция вирусов СПИДа: оценка временного масштаба. Труды Биохимического общества 28: 275–282.
55. 55. Асеведо А., Бродский Л., Андино Р. (2014) Мутационные и фитнес-ландшафты РНК-вируса, выявленные с помощью популяционного секвенирования.Nature 505: 686–690.
56. 56. Таубенбергер Дж. К., Рид А. Х., Лоуренс Р. М., Ван Р., Джин Дж. И др. (2005) Характеристика генов полимеразы вируса гриппа 1918 г. Природа 437: 889–893.
57. 57. Marshall N, Priyamvada L, Ende Z, Steel J, Lowen AC (2013) перегруппировка вируса гриппа происходит с высокой частотой при отсутствии несоответствия сегментов. Патогены PLoS 9: e1003421.
58. 58. Stack JC, Murcia PR, Grenfell BT, Wood JLN, Holmes EC (2013) Определение передачи вируса гриппа A между хозяевами с использованием моделей генетической изменчивости внутри хозяина.Proc Biol Sci 280: 20122173.
59. 59. Ричард М., Шраувен Э.Дж., де Грааф М., Бестеброер Т.М., Спронкен М.И.Дж. и др. (2013) Ограниченная воздушно-капельная передача вируса гриппа A H7N9 между хорьками. Nature 501: 560–3.
60. 60. Holmes EC, Moya A (2002) Применима ли концепция квазивидов к РНК-вирусам? Журнал вирусологии 76: 460–462.
61. 61. Wilke CO (2005) Теория квазивидов в контексте популяционной генетики. BMC Evol Biol 5: 44
62. 62.Más A, López-Galíndez C, Cacho I, Gómez J, Martínez MA (2010) Неоконченные истории о вирусных квазивидах и дарвиновских взглядах на эволюцию. Журнал молекулярной биологии 397: 865–77.
63. 63. Лауринг А.С., Андино Р. (2010) Теория квазивидов и поведение РНК-вирусов. Патогены PLoS 6: e1001005.
64. 64. Шварц G (1978) Оценка размерности модели. Анналы статистики 6: 461–464.

Универсальная геномная амплификация вируса гриппа B упрощает секвенирование, диагностику и обратную генетику

ВВЕДЕНИЕ

Это исследование демонстрирует универсальные подходы к амплификации полных сегментированных геномов прошлых, настоящих и будущих IBV в одном реакционном сосуде, независимо от штамма вируса. Оптимизированная методика (IBV-GA2) достаточно надежна для использования с материалом клинических мазков, и ее можно масштабировать для использования в высокопроизводительной обработке.Наконец, праймеры IBV-GA / GA2 были также разработаны для облегчения клонирования геномных сегментов IBV в наши индивидуализированные плазмиды обратной генетики для спасения вирусов, что ускорит создание посевного материала вакцины и фундаментальные исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки.

Клетки 293T почек эмбриона человека (HEK-293T) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки собачьей почки Madin-Darby (MDCK) поддерживали в минимальной эссенциальной среде (MEM) с добавлением 5% FBS.

Вирусы и клинические образцы.

Анализ концов IBV и дизайн праймера.

ТАБЛИЦА 1

Подчеркнутые нуклеотиды соответствуют геному IBV.

^b

Повторное замораживание и оттаивание рабочего материала снижает эффективность ОТ-ПЦР.

Амплификация и оптимизация генома IBV.

Большинство образцов требовали выделения РНК в JCVI. РНК выделяли из 100–200 мкл культурального супернатанта, аллантоисной жидкости или образцов клинических мазков с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, Валенсия, Калифорния) или набора вирусной РНК ZR-96 (Zymo Research, Ирвин, Калифорния). РНК элюировали 30 мкл воды, свободной от РНКазы, и служили матрицей для одностадийной RT-PCR-амплификации всего генома IBV в одной реакции.

ТАБЛИЦА 2

^a

DEPC, диэтилпирокарбонат; ddH ₂ O, бидистиллированная вода. Каждая аликвота содержала четыре перечисленных реагента в количестве 22 мкл на реакцию.

Плазмиды обратной генетики для клонирования на основе рекомбинации.

Секвенирование, сборка и депонирование нуклеотидов.

Продукты различных ампликонов IBV-GA были успешно секвенированы с использованием платформ Ion Torrent PGM (Life technologies), HiSeq 2000 и MiSeq (Illumina) и 454 (Roche). Большинство геномов секвенировали с использованием платформ Ion Torrent PGM и / или MiSeq. Для Ion Torrent PGM, ампликоны IBV-GA были разрезаны в течение 15 минут, а адаптеры со штрих-кодом, совместимые с Ion Torrent, были лигированы с разрезанной ДНК с использованием набора библиотеки фрагментов Ion Xpress Plus (Life Technologies).Библиотеки со штрих-кодом были объединены и очищены реагентом AMPure XP (Agencourt). Количественная ПЦР была проведена на объединенных библиотеках штриховых кодов для оценки качества и определения коэффициента разбавления матрицы для эмульсионной ПЦР. Пул был соответствующим образом разбавлен и амплифицирован на частицах Ion Sphere (ISP) с использованием прибора Ion OneTouch (Life Technologies). Пул вирусных библиотек был расширен для положительных по шаблону интернет-провайдеров на приборе Ion OneTouch ES (Life Technologies). Секвенирование было выполнено на Ion Torrent PGM с использованием чипов Ion 316/318.

Для MiSeq продукты IBV-GA служили шаблоном для создания библиотеки Nextera (Illumina). Вкратце, 25 нг ампликонов ДНК были помечены при 55 ° C в течение 5 минут. Меченую ДНК очищали с помощью набора ZR-96 DNA Clean & Concentrator (Zymo Research) и элюировали 25 мкл буфера для ресуспендирования. Адаптеры секвенирования и штрих-коды Illumina были добавлены к меченой ДНК с помощью ПЦР-амплификации. Два с половиной микролитра каждого индексного праймера из набора Nextera Index (Illumina) использовали в каждой ПЦР (общий объем 35 мкл).Термоциклирование выполнялось в соответствии с протоколом Nextera для создания библиотеки с двойным индексом для каждого образца. После ПЦР-амплификации 10 мкл каждой библиотеки объединяли в пробирку объемом 1,5 мл, и пул дважды очищали реагентом AMPure XP (Agencourt), в 1,2 раза превышающим конечный объем, для удаления всех оставшихся праймеров и небольших фрагментов ДНК. Очищенный пул секвенировали на приборе Illumina MiSeq version 2 с считыванием парных концов 250 пар оснований.

Последовательности, считанные с платформ NGS, были отсортированы по штрих-коду, обрезаны и de novo собраны с использованием программы CLC bio clc_novo_assemble, и полученные контиги были проверены в пользовательских базах данных полноразмерных нуклеотидов IBV, чтобы найти ближайшую эталонную последовательность для каждый сегмент.Затем все считанные последовательности были сопоставлены с выбранными эталонными сегментами с помощью программы CLC bio clc_ref_assemble_long. В локусах, где данные последовательности Ion Torrent и Illumina согласовывались с вариацией (по сравнению с эталонной последовательностью), эталонная последовательность была обновлена, чтобы отразить разницу. Окончательное отображение всех чтений NGS в обновленные ссылочные последовательности было выполнено с помощью программы CLC bio clc_ref_assemble_long.

Клонирование геномных ампликонов в плазмиды обратной генетики.

Спасение IBV.

ОБСУЖДЕНИЕ

Рис. 5

В заключение, мы разработали и использовали универсальные методы геномной амплификации IBV с одной реакцией для производства NGS и рекомбинантных вирусов.Эта стратегия снижает затраты, экономит время и сохраняет исходные образцы, сохраняя при этом высокую чувствительность и универсальность. Полная интеграция этой технологии с NGS и плазмидами обратной генетики на основе рекомбинации доказала ее широкое применение и потенциал для оказания значительного влияния на исследования ИБК и производство вакцин.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим P. Blair, D. Bucher и D. Dwyer за предоставленные образцы вируса, использованные в этом исследовании. Мы также благодарим Питера Палезе и Адольфо Гарсиа-Састре за предоставление оригинальной плазмиды обратной генетики pDZ, которую мы модифицировали для создания наших плазмид обратной генетики IBV.

Это исследование было частично поддержано федеральными фондами Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальных институтов здравоохранения, Министерства здравоохранения и социальных служб, в соответствии с контрактом HHSN272200

7C. Мельбурнский Центр сотрудничества ВОЗ по справочной информации и исследованиям гриппа поддерживается Министерством здравоохранения Австралии.

B.Z., D.E.W. и X.L. имеют потенциальный конфликт интересов, поскольку они подали заявку на патент США на некоторые из описанных здесь технологий.

Собачий грипп | Американская ветеринарная медицинская ассоциация

Возбудитель

Собачий грипп (CI) или собачий грипп — очень заразная вирусная инфекция, поражающая собак и кошек. Вирусы гриппа принадлежат к семейству Orthomyxoviridae. Собачий грипп является вирусом гриппа типа А и далее идентифицируется на основе состава двух специфических белков в липидном внешнем слое капсида: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время в США идентифицированы два штамма вируса собачьего гриппа: h4N8 и h4N2.

Вирусы гриппа способны быстро меняться и давать новые штаммы, которые могут инфицировать разные виды. Оба штамма собачьего гриппа, идентифицированные в США, можно отнести к штаммам гриппа, которые, как известно, заражают не собак, а другие виды. В какой-то момент эти вирусы приобрели способность заражать собак и передаваться от собаки к собаке.

Собачий грипп h4N8 был впервые выявлен во Флориде в 2004 году у гончих борзых. Считается, что этот штамм произошел от штамма конского гриппа h4N8, который перешел с лошадей на собак.С момента обнаружения в 2004 году собачий грипп h4N8 был обнаружен у собак в большинстве штатов США и округе Колумбия.

Собачий грипп h4N2 был впервые выявлен в США в марте 2015 года после вспышки респираторного заболевания у собак в районе Чикаго. До этого сообщения о собачьем вирусе гриппа h4N2 были ограничены Южной Кореей, Китаем и Таиландом. Первоначально он был обнаружен у собак в Азии в 2006–2007 годах и, вероятно, возник в результате прямой передачи вируса птичьего гриппа собакам — возможно, из числа вирусов, циркулирующих на рынках живых птиц.

После первоначального диагноза в Чикаго в ряде штатов были зарегистрированы дополнительные случаи собачьего гриппа h4N2. В начале 2016 года группе кошек из приюта в Индиане был поставлен диагноз собачий грипп h4N2. Считается, что вирус передался им от зараженных собак.

В мае 2017 года собачий грипп h4N2 был диагностирован у собак во Флориде, Джорджии, Северной Каролине, Южной Каролине, Техасе, Кентукки, Теннесси, Миссури, Луизиане и Иллинойсе. Это был тот же штамм h4N2, который вызвал вспышку в 2015 году в Чикаго.

Нет никаких доказательств того, что какой-либо из штаммов собачьего гриппа (h4N8 или h4N2) может инфицировать людей.

Трансмиссия

Собачий грипп передается воздушно-капельным путем или аэрозолями, содержащими выделения из дыхательных путей при кашле, лае и чихании. Собаки, находящиеся в тесном контакте с инфицированными собаками в таких местах, как питомники, грумеры, детские сады и приюты, подвергаются повышенному риску заражения. Собачий грипп может передаваться косвенно через предметы (например, будки, миски для еды и воды, ошейники и поводки) или людей, которые контактировали с инфицированными собаками.Важно очищать и дезинфицировать предметы, которые контактировали с инфицированной собакой, чтобы не подвергнуть других собак воздействию вируса. Точно так же люди, которые контактировали с инфицированной собакой, должны мыть руки и чистить одежду, чтобы избежать распространения вируса.

Вирус может оставаться жизнеспособным (живым и способным инфицировать) на поверхностях до 48 часов, на одежде в течение 24 часов и на руках в течение 12 часов. Важно внедрить протоколы биобезопасности и процедуры дезинфекции, чтобы снизить риск передачи болезней.

h4N8 составляет от 1 до 5 дней, при этом клинические признаки в большинстве случаев проявляются через 2–3 дня после контакта. Собаки, инфицированные h4N2, могут начать проявлять респираторные симптомы через 2-8 дней после заражения. Собаки наиболее заразны в инкубационный период и выделяют вирус, даже если у них нет клинических признаков болезни. Некоторые собаки могут не проявлять никаких признаков болезни, но имеют субклиническую инфекцию и выделяют вирус.

Патология и клинические признаки

Вирус собачьего гриппа (CIV) инфицирует и размножается внутри клеток дыхательных путей от слизистой носа до концевых дыхательных путей.Воспалительная реакция на инфекцию приводит к риниту, трахеиту, бронхиту и бронхиолиту. Патологический процесс приводит к гибели эпителиальных клеток, выстилающих дыхательные пути, обнажая нижележащую базальную мембрану. Это предрасполагает дыхательные пути к вторичным бактериальным инфекциям, которые вызывают выделения из носа и кашель.

Практически все собаки, подвергшиеся воздействию вируса собачьего гриппа, становятся инфицированными, примерно у 80% из них развиваются клинические признаки заболевания.Примерно 20% инфицированных собак, у которых нет клинических признаков заболевания, все же могут выделять вирус и распространять инфекцию.

Как и другие вирусы гриппа млекопитающих, вирус собачьего гриппа вызывает у собак острую респираторную инфекцию. Для собачьего гриппа нет «сезона», и инфекции могут возникать в любое время года. Инфекция вируса гриппа собак часто напоминает инфекционный трахеобронхит собак («собачий кашель»), который вызывается одной или несколькими бактериальными или вирусными инфекциями, включая Bordetella bronchiseptica и вирус парагриппа.

У большинства инфицированных собак наблюдается легкая форма собачьего гриппа. Наиболее частым клиническим признаком является кашель, который сохраняется от 10 до 21 дня, несмотря на лечение антибиотиками и подавляющими кашель средствами. Больные собаки могут иметь мягкий влажный кашель или сухой кашель, аналогичный кашлю, вызываемому питомником. Также могут наблюдаться выделения из носа и / или глаз, чихание, летаргия и анорексия. У многих собак появляются гнойные выделения из носа и жар (104-105 ^o F). Выделения из носа обычно вызываются вторичными бактериальными инфекциями, включая Pasteur ella multocida и виды микоплазм.

У некоторых собак более тяжелое заболевание, и у них проявляются клинические признаки пневмонии, такие как сильная лихорадка (от 104 ° F до 106 ° F) и учащение дыхания и усилия. Рентгенография грудной клетки (рентген грудной клетки) может выявить уплотнение долей легких. Хотя большинство собак выздоравливают без происшествий, сообщалось о случаях смерти из-за h4N2.

У кошек, инфицированных h4N2, наблюдаются признаки заболевания верхних дыхательных путей, включая выделения из носа, заложенность носа, недомогание, чмокание губами и чрезмерное слюноотделение.

Диагноз

Грипп собак нельзя диагностировать только по клиническим признакам (кашель, чихание и выделения из носа), поскольку эти клинические признаки также присутствуют при других респираторных заболеваниях собак. Доступны тесты для диагностики и идентификации штаммов вируса собачьего гриппа. Тесты включают: выделение вируса, иммуноанализы для обнаружения вирусного антигена, ПЦР для обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты и серологию на антитела, специфичные к вирусу. ПЦР может быть самым надежным тестом для диагностики собачьего гриппа.Обратитесь в свою диагностическую лабораторию за рекомендациями относительно тестов и сбора образцов.

Лечение

Ветеринарная экспертиза необходима для определения вариантов лечения и наилучшего курса лечения. Лечение собачьего гриппа, как и большинства вирусных заболеваний, в основном является поддерживающим. Хорошее содержание и питание могут помочь собакам выработать эффективный иммунный ответ. Большинство собак выздоравливают от собачьего гриппа в течение 2-3 недель. Вторичные бактериальные инфекции, пневмония, обезвоживание или другие факторы здоровья (например,g., беременность, ранее существовавшее заболевание легких, иммуносупрессия, коллапс трахеи и т. д.) могут потребовать дополнительных диагностических и лечебных мероприятий, включая, помимо прочего:

• Противомикробные препараты для известных или предполагаемых вторичных бактериальных инфекций.
• Нестероидные противовоспалительные препараты, необходимые для уменьшения температуры и воспаления.
• Жидкости для коррекции обезвоживания или поддержания гидратации.

Модификации лечения следует вносить по мере необходимости, в зависимости от реакции на лечение, других факторов здоровья и других факторов, таких как соблюдение требований и возможности владельца / опекуна по уходу за животными.

Чтобы предотвратить передачу вируса, собак, инфицированных собачьим гриппом h4N2, а также других домашних собак следует изолировать на 4 недели.

Противовирусные препараты для лечения гриппа одобрены для использования только у людей. Мало что известно об их применении, эффективности и безопасности для собак. Ветеринары, которые используют одобренные лекарства способом, не соответствующим утвержденным инструкциям на этикетке (например, использование противовирусного лекарства, одобренного только для использования у людей), должны соблюдать федеральные правила использования сверхмаркированных лекарств Закона о разъяснении использования лекарственных препаратов для животных (AMDUCA).

Заболеваемость и смертность

Вирус собачьего гриппа не получил широкого распространения среди собак, и многие собаки никогда не подвергались воздействию этого вируса. Уровень заболеваемости (количество подвергшихся воздействию животных, у которых развивается болезнь) оценивается в 80%. Смертность (смертность) низкая; менее 10%. Смертельные случаи происходят в основном у собак с тяжелой формой заболевания.

На сегодняшний день не зарегистрировано ни одного смертельного случая у кошек, инфицированных собачьим гриппом.

Профилактика и контроль

Вирус собачьего гриппа может сохраняться в окружающей среде в течение примерно 2 дней и оставаться жизнеспособным на руках и одежде до 24 часов.В ветеринарных учреждениях, интернатах и ​​приютах вирус собачьего гриппа, по-видимому, легко уничтожается дезинфицирующими средствами, обычно используемыми в этих учреждениях, такими как соединения четвертичного аммония (например, хлорид бензалкония), альдегиды, пероксимоносульфат калия, фенолы и отбеливатель (1:30 разведение) растворов. Следует разработать протоколы очистки и дезинфекции, чтобы снизить риск передачи вируса через непрямой контакт с людьми или другими фомитами (например, клетки, миски, смотровые комнаты и т. Д.).

Все сотрудники должны мыть руки водой с мылом:

• По прибытии на объект
• До и после обращения с каждой собакой
• После контакта со слюной, мочой, фекалиями или кровью собак
• После очистки клеток
• Перед едой, в перерывах или выходе из учреждения
• До и после посещения туалета

Протоколы изоляции должны строго соблюдаться для собак с клиническими признаками респираторного заболевания.Собак, подвергшихся воздействию КИ или проявляющих респираторные симптомы, не следует доставлять в места, где присутствуют другие собаки, такие как учебные классы, шоу или мероприятия, дневной уход, а также интернаты и приюты до завершения периода изоляции.

Больных или подвергшихся воздействию собак следует изолировать, желательно в зоне с отдельной подачей воздуха. Рекомендуется период изоляции 4 недели. При обращении с больными животными используйте средства индивидуальной защиты (как минимум халат и перчатки), чтобы избежать загрязнения одежды.Очистите и продезинфицируйте всю одежду (включая обувь), оборудование, поверхности и руки после контакта с собаками с признаками респираторных заболеваний. Владельцы, чьи собаки кашляют или проявляют другие признаки респираторного заболевания, не должны участвовать в мероприятиях с другими собаками или приводить своих собак в помещения, где находятся другие собаки, во избежание заражения их вирусом.

Ветеринарные врачи должны внедрить протоколы биобезопасности для предотвращения передачи собачьего гриппа между собаками в клинике.Собаки с клиническими признаками респираторного заболевания не допускаются в зал ожидания. Клиентам, возможно, придется подождать в машине со своей собакой, пока персонал клиники не будет готов осмотреть собаку, не рискуя столкнуться с другими собаками. Собаки с подозрением на собачий грипп должны избегать главного входа, а входить и выходить из помещения через другую дверь. Зоны, где осматриваются и обрабатываются потенциально инфицированные собаки, а также все используемые инструменты должны быть тщательно очищены и продезинфицированы после выписки собаки.Персонал должен использовать средства индивидуальной защиты (как минимум перчатки и халат) при осмотре или уходе за собаками с подозрением на собачий грипп.

Вакцины доступны как от собачьего гриппа h4N8, так и от h4N2. Также доступна двухвалентная вакцина, обеспечивающая защиту от обоих штаммов. В настоящее время нет вакцины против гриппа собак, одобренной для использования у кошек. Вакцинация может снизить риск заражения собак собачьим гриппом. Вакцинация не может полностью предотвратить инфекцию, но может уменьшить тяжесть и продолжительность клинического заболевания.

Вакцина против гриппа собак — это вакцина для «образа жизни», и она не рекомендуется для каждой собаки. В целом вакцина предназначена для защиты собак, подверженных риску заражения вирусом собачьего гриппа, включая тех, которые участвуют в деятельности со многими другими собаками или содержатся в общественных помещениях, особенно там, где вирус широко распространен. К собакам, которым может быть полезна вакцинация против гриппа, относятся собаки, которые получают вакцину от кашля питомника ( Bordetella / parainfluenza), поскольку группы риска схожи.Владельцы собак должны проконсультироваться со своим ветеринаром, чтобы определить риск заражения своей собаки вирусом собачьего гриппа и подходит ли вакцинация для их собаки.

Дополнительная информация о собачьем гриппе

Ресурсы по гриппу собак (Центр продовольственной безопасности и общественного здравоохранения Университета штата Айова)

Ключевые факты о собачьем гриппе (Центры по контролю и профилактике заболеваний)

Часто задаваемые вопросы о собачьем гриппе для владельцев домашних животных и ветеринаров (2017) (Колледж ветеринарной медицины Университета Флориды)

Приютные организации: FAQ по собачьему гриппу (Колледж ветеринарной медицины Университета Флориды)

Информационный бюллетень о собачьем гриппе (Университет штата Айова)

Информационный бюллетень о собачьем гриппе h4N2 для ветеринаров (Колледж ветеринарной медицины Университета Флориды)

Вирус гриппа собак (Ветеринарная диагностическая лаборатория Корнельского университета)

Вспышка собачьего гриппа в 2015 г. в районе Чикаго (Ветеринарная диагностическая лаборатория Корнельского университета)

Собачий грипп.com (Merck Animal Health)

Список литературы

Meyer M. UF Ветеринары обнаружили у собак новое заболевание. Исследуйте: исследования в Университете Флориды ; 2006: 11. Доступно по адресу: http://www.research.ufl.edu/publications/explore/v11n2/story3.html. По состоянию на 22 апреля 2015 г.

Crawford C. Собачий грипп: часто задаваемые вопросы владельцев собак. Университет Флориды ; 2009.

Корнельский университет: Колледж ветеринарной медицины.Возникающие проблемы — Собачий грипп: Резюме теста на вирус собачьего гриппа у собак, не связанных с беговыми дорожками , Центр диагностики здоровья животных .

Crawford C. Собачий грипп: часто задаваемые вопросы ветеринаров. Университет Флориды ; 2009.

Государственный университет Айовы. Собачий грипп. Доступно по адресу: www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/canine_influenza.pdf. Доступ 19 августа 2009 г.

Корнельский университет: Колледж ветеринарной медицины.Возникающие проблемы — вирус собачьего гриппа. Центр диагностики здоровья животных ; 2006.

Как наука отвечает на эти вызовы

Пример анализа для определения способности ранее разработанных нейтрализующих антител против исходного вируса нейтрализовать вариант SARS-CoV-2.

Исследования in vitro исследуют только способность антител нейтрализовать варианты в лаборатории, а не более широкие эффекты других компонентов иммунного ответа, таких как активация Т-клеток.Т-клетки активируют различные части иммунной системы или напрямую убивают вторгающиеся вещества, такие как вирусы и бактерии, и, как было показано, играют ключевую роль в иммунном ответе на SARS-CoV-2. ^18-20 Для получения дополнительной информации о том, как оценивается иммунный ответ, вызванный вакцинами, щелкните здесь.

Также можно проанализировать, как вакцины действуют против новых вариантов, определяя эффективность вакцины в конкретной группе тех, кто заразился одним из новых вариантов SARS-CoV-2 в контексте клинических испытаний.

Как только исследователи поймут, как иммунный ответ, вызванный вакциной, коррелирует с эффективностью вакцины против новых вариантов, будет легче точно определить эффективность только с помощью анализов нейтрализации.

Стратегии преодоления утечки вакцин

Ускользание вакцины — это термин, используемый для описания процесса мутации вируса с образованием варианта, который ускользает от иммунного ответа, вызванного вакцинацией. Этот процесс редок, но его возникновение зависит от таких факторов, как терапевтические цели и частота вирусных мутаций. ²¹

Как объяснялось выше, в случае SARS-CoV-2 скорость мутации низкая; однако, поскольку вирус настолько широко распространен, появилось множество его вариантов. Новые варианты могут снизить способность антител нейтрализовать вирус у людей, которые ранее заразились или прошли вакцинацию против COVID-19. Фактически, постоянно наблюдается снижение нейтрализующей способности ранее разработанных антител против южноафриканского варианта. ^22,23

Тем не менее, вакцины позволяют продуцировать множество различных антител и Т-клеток против многочисленных частей белка-шипа, ^5,24 , и поэтому ожидается, что определенный уровень защиты все еще должен поддерживаться.Для обеспечения максимального уровня защиты были разработаны стратегии преодоления снижения эффективности вакцины:

• Схема введения вакцины может быть изменена для увеличения общего иммунного ответа и, в идеале, для обеспечения большей защиты от новых вариантов (например, может быть рассмотрена дополнительная доза бустерной вакцины)
• Возможна оптимизация исходной вакцины , например, разработка новой версии с обновленным спайковым белком; однако, хотя прямые изменения вакцины могут быть выполнены относительно быстро, потребуются дальнейшие шаги для обеспечения качества, безопасности и, возможно, эффективности новой вакцины (ов)

Чтобы определить, требуется ли какой-либо из этих подходов, собираются данные эпиднадзора за появляющимися вариантами, чтобы гарантировать использование наилучшей стратегии вакцинации.

Хотя кажется разумным ожидать, что со временем появятся новые варианты SARS-CoV-2, эксперты согласны с тем, что важно, чтобы нынешние вакцины продолжали вводить как можно большему количеству людей. Это связано с тем, что защита, обеспечиваемая вакцинами, выше, чем риск ускользания вакцины от потенциальных новых вариантов.

Следующие шаги

Данные свидетельствуют о том, что имеющиеся вакцины против COVID-19 могут по-прежнему вызывать защитный иммунный ответ против новых вариантов, выявленных на сегодняшний день, однако уровень эффективности, особенно против тяжелых заболеваний, еще не определен. ²⁵ Тесты для анализа всего иммунного ответа, включая Т-клеточный ответ, улучшат понимание ученых о влиянии вариантов на эффективность вакцины. В вакцину могут быть внесены изменения, направленные на новые варианты, и, вероятно, они потребуются, поскольку новые варианты начнут доминировать среди циркулирующих вирусов.

Сотрудничество между регулирующими органами и государственными инвестициями во всем мире будет иметь важное значение для достижения эффективного развертывания, если такие новые вакцины будут сочтены необходимыми в рамках наших постоянных усилий по прекращению пандемии.

полных геномных последовательностей высокопатогенного вируса птичьего гриппа H5N1 в образцах вскрытия человека выявляют генетическую изменчивость и адаптивные изменения роста в культурах клеток MDCK

Полные геномы высокопатогенного вируса птичьего гриппа H5N1 были идентифицированы в замороженных образцах вскрытия легких: трахеи , толстая кишка и кишечные фекалии пациента, умершего от болезни в 2006 году. Филогенетический анализ вирусных геномов показал, что эти вирусы принадлежали к кладе 1 и являлись реассортантами, полученными в результате реассортации вирусов внутри того же клада.Данные секвенирования образцов вскрытия выявили не менее 8 квазивидов вируса H5N1 во всех 4 типах образцов. Эти последовательности сравнивали с последовательностями, полученными из вирусных изолятов, выращенных в клетках почек собак Madin Darby ( MDCK). Изоляты вируса из трахеи, легких и фекалий показали 27 нуклеотидных замен, что привело к изменению 18 аминокислотных остатков. Однако изменений в аминокислотных остатках, определяющих вирулентность вируса, не произошло.Изменения чаще наблюдались в легких, особенно в генах HA и NA . Наше исследование показало, что адаптационные изменения для приспособленности вируса к выживанию в новом виде хозяина (клетки MDCK) могут включать многие гены, например, аминокислотную замену 177G или 177W, прилегающую к рецепторсвязывающим остаткам в глобулярной головке HA1 и замена M315I в PB2. Однако мутационные изменения около рецепторсвязывающего домена могут играть важную роль в определении клеточного тропизма и требуют дальнейшего изучения.

1. Введение

В настоящее время вирус гриппа A состоит из 18 подтипов гемагглютинина (HA) и 11 подтипов нейраминидазы (NA). Вирусы различных комбинаций HA и NA, т.е. между h2-h26 и N1-N9, обнаружены у видов птиц [1, 2], а h27N10 и h28N11 являются вирусами, подобными летучим мышам [2–4]. Подтипы, инфицирующие людей, включают вирусы h2N1, h3N2 (уже вымершие) и h4N2. Предпочтение рецепторов для вирусов птичьего гриппа (AI) и вирусов гриппа человека различно. Вирусы птиц предпочитают рецепторы эпителиальных клеток, содержащие α 2,3-галактозную сиаловую кислоту ( α 2,3 гал-SA).Напротив, вирусы человека предпочитают эпителиальные клетки, содержащие α 2,6-галактозную сиаловую кислоту ( α 2,6 гал-SA) [5]. Большинство вирусов AI имеют низкую патогенность и вызывают бессимптомную или легкую инфекцию у видов птиц, но некоторые штаммы H5 и H7 являются высокопатогенными. Иногда некоторые птичьи вирусы преодолевают видовой барьер и заражают человека. Смертность от вирусов сезонного гриппа у людей, как правило, минимальна, в то время как смертность от вирусов птичьего гриппа для людей достигает 33% для высокопатогенных вирусов гриппа птиц H5N1, которые впервые появились в Гонконге в 1997 г. [6, 7] , 53% во всем мире для вирусов H5N1 HPAI, которые повторно появились с 2003 г. [8], и 39% для вируса H7N9 [9].Таиланд впервые сообщил о вспышке гриппа H5N1 среди домашних птиц и людей в январе 2004 года. Последний случай заболевания среди людей был зарегистрирован в 2006 году, тогда как последняя вспышка среди домашних птиц была в 2008 году. Всего было зарегистрировано 25 случаев заболевания людей, 17 случаев смерти или 68% летальности [8].

Патология гриппа человека и H5N1 HPAI заметно различается. Инфекции вируса гриппа человека распространяются главным образом на дыхательные пути, тогда как инфекции вируса H5N1 HPAI распространяются за пределы дыхательных путей к органам дистального конца [10].Предыдущие исследователи продемонстрировали присутствие как геномной РНК, так и антигеномной РНК в различных органах, включая легкие, кишечник, селезенку, трахею, мозг, сердце, печень, почки и лимфатические узлы [11-15]. Вирус H5N1 никогда не выделялся из образцов человека за пределами дыхательных путей, за исключением тех, которые были включены в наше исследование. Более того, мы также объявили об обнаружении полногеномных последовательностей вируса H5N1 HPAI в тканях архивных органов мертвого пациента с помощью техники секвенирования следующего поколения (NGS) [16], но анализ последовательности еще не проводился.В этом исследовании аминокислотные последовательности различных вирусных генов из образцов аутопсии были сопоставлены с таковыми из вирусных изолятов, и были определены замены, которые могут быть связаны с адаптацией вируса к репликации в новых видах хозяев.

2. Материалы и методы

2.1. Этические вопросы

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом медицинского факультета больницы Сирирадж Университета Махидол, Таиланд.

2.2. Пациент с вирусом H5N1 и клинические образцы

В августе 2006 года 59-летний мужчина, проживавший в провинции Нонг Буа Лам Фу на северо-востоке Таиланда, был госпитализирован с тяжелой пневмонией, которая позже переросла в острый респираторный дистресс-синдром и полиорганную недостаточность.Несколько попыток диагностировать птичий грипп H5N1 с помощью определения генома потерпели неудачу. Тем не менее, его лечили по стандартной схеме осельтамивира на 16-й день после появления симптомов, когда был получен анамнез контактов с больными и мертвыми цыплятами. Он умер от болезни на 28-й день после начала. Ткани вскрытия и образцы кишечных фекалий собирали для диагностики заболевания путем обнаружения вирусного генома, выделения вируса в клетках MDCK и непрямого иммунофлуоресцентного анализа (IFA). Оставшиеся свежие ткани хранили замороженными при -80 ° C.

2.3. Лабораторное исследование

Каждую ткань (трахею, легкое, толстую кишку, селезенку и печень) промывали и обрабатывали индивидуально с помощью отдельных наборов инструментов. Обычную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией проводили с использованием протокола, описанного Poddar [17] и Всемирной организацией здравоохранения [18]. Однако результаты были неубедительными со всеми исследованными образцами тканей, включая образец кишечных фекалий. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA) проводили путем окрашивания мазков-слепков тканей моноклональным антителом к ​​нуклеопротеину гриппа A (Chemicon), и положительные результаты были получены с эпителиальными клетками трахеи и легких.

Образцы тканей (трахеи, легких, толстой кишки, селезенки и печени) измельчали ​​в среде для роста вирусов (VGM), содержащей минимальную необходимую среду Эрла (EMEM, ThermoFisher) без добавления фетальной бычьей сыворотки, а образцы кишечных фекалий суспендировали в ВГМ. Суспензии образцов центрифугировали, и супернатанты инокулировали на монослои клеток MDCK, поддерживаемые в VGM. Было выполнено три последовательных слепых пассажей, и выделение вируса было успешным с образцами трахеи, легких и фекалий.Эти изоляты вируса H5N1 были названы A / Thailand / NBL1 / 2006-L, A / Thailand / NBL1 / 2006-T и A / Thailand / NBL1 / 2006-F по происхождению образцов из легких, трахеи и фекалий соответственно. Изоляты вируса на пассаже 4 были подвергнуты полному секвенированию генома методом Сэнгера, и данные секвенирования были депонированы в базе данных GenBank (таблица 1).

2.4. Секвенирование нового поколения образцов для прямого вскрытия

NGS было проведено на образцах тканей после длительного хранения в течение почти 10 лет при -80 ° C. Тотальную РНК экстрагировали из образцов трахеи, легких, толстой кишки и фекалий с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) и очищали с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen).Экстрагированную РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием системы синтеза первой цепи SuperScript III (Invitrogen). Затем кДНК использовали в качестве матрицы для амплификации всех 8 сегментов вирусного генома гриппа с использованием Platinum Taq HiFi (Invitrogen). Полный геномный сегмент PB2, PB1, PA, HA, NP и NA (> 1 т.п.н.) был амплифицирован как перекрывающиеся фрагменты, а именно PB2a, PB2b, PB1a, PB1b, PAa, PAb, HAa, HAb, NPa, NPb, NAa и NAb соответственно. Геномные сегменты M и NS были амплифицированы как один сегмент.Нуклеотидные последовательности этих праймеров для секвенирования можно получить по запросу. Реакция ПЦР объемом 50 мкл л состояла из 5 мкл л 10-кратного буфера для ПЦР, 2 мкл мкл 50 мМ MgSO ₄ , 1,5 мкл л 10 мМ дНТФ, 2 мкл л каждый по 10 мкл, M прямого и обратного праймеров, 0,2 мкл л Platinum Taq HiFi, 5 мкл л кДНК и дистиллированная вода. ПЦР проводили в термоциклере GeneAmp PCR system 2400 (Applied Biosystems).Реакция состояла из 1 цикла выдержки при 94 ° C в течение 5 минут, за которым следовали 35 циклов амплификации (94 ° C в течение 15 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд и 68 ° C в течение 2 минут) и заключительный стадия наращивания при 68 ° C в течение 10 минут. Затем амплифицированные продукты ПЦР очищали с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen). Полногеномное секвенирование выполняли в три этапа: подготовка библиотеки, эмульсионная ПЦР (emPCR) и высокопроизводительное секвенирование с использованием платформы GS Junior (Roche Diagnostics). Вкратце, 500 нг каждого амплифицированного фрагмента ДНК, включая PB2a, PB2b, PB1a, PB1b, PAa, PAb, HAa, HAb, NPa, NPb, NAa, Nab, M и NS, были объединены вместе и лигированы к адаптерам с последующей эмульсионной ПЦР. и секвенирование.Четыре библиотеки ДНК с различными штрих-кодами, полученные из образцов трахеи, легких, толстой кишки и фекалий, были созданы с использованием набора GS DNA Rapid Library Preparation kit (Roche) в соответствии с протоколом производителя.

2,5. Анализ данных NGS

Исходные данные секвенирования были классифицированы по каждому образцу на основе последовательностей штрих-кода в библиотеках ДНК. Вторичный анализ данных был выполнен с использованием CLC Genomics Workbench версии 8.0.1 (http://www.clcbio.com/). Данные низкого качества () и последовательности адаптеров были обрезаны и удалены из считываний секвенирования.Пройденный фильтр (PF) reads () использовался для картирования и сопоставления с эталонным геномом гриппа A / Thailand / 1 (KAN-1) / 2004 (H5N1) (номер доступа GenBank AY555144-AY555151). Общее количество считываний каждого образца находилось в диапазоне от 100 000 до 200 000, а количество отображенных считываний варьировалось от 98% до 99%. Средняя длина считывания для всех образцов колебалась от 241 до 309 пар оснований. Вирусные последовательности, полученные из каждой ткани, были депонированы в GenBank под номерами доступа от MG668904 до MG668911 для толстой кишки, от MG668920 до MG668927 для трахеи, от MG668928 до MG668935 для легких и от MG668912 до MG668919 для образца фекалий, как показано в таблице 1.Необработанные чтения были депонированы в архиве чтения последовательностей под регистрационным номером BioProject PRJNA494792 [16]. Были исследованы нуклеотидные вариации и рассчитаны процентные доли минорных мутаций в каждом гене. Сигнатура генома, соответствующая относительной частоте аминокислотных остатков для каждого гена, была графически создана с использованием WebLogo (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) [19]. Предсказание мутационных положений в структуре белка HA было исследовано с использованием модели кода PDB: 3FKU [20] и проанализировано с использованием программы UCSF Chimera версии 1.13.1 [21].

2.6. Построение филогенетического дерева

Эталонные штаммы с известными генетически кладами были получены из ВОЗ (https://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/h5n1_nomenclature/en/) [22] и баз данных NCBI GenBank (https: // www. .ncbi.nlm.nih.gov). Конкатенированная полная кодирующая последовательность (CDS) из 8 сегментов (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M и NS) и отдельных сегментов вирусов H5N1, выделенных в Таиланде, была проанализирована филогенетически. Последовательности выравнивали с использованием множественного выравнивания последовательностей ClustalW в программе BioEdit версии 7.0.4.1, а филогенетическое дерево было построено с помощью программы MEGA 7.0 (http://megasoftware.net/) [23]. Эволюционные расстояния оценивались с использованием метода объединения соседей и алгоритма максимального совокупного правдоподобия. Надежность дерева объединения соседей оценивалась с помощью анализа начальной загрузки с использованием 1000 повторяющихся наборов данных. Поддерживающее значение начальной загрузки более 80% было показано на узлах каждого кластера.

2.7. Анализ давления отбора

Вирусы H5N1 и H5N6 человека, выделенные между 1997 и 2018 гг., Были проанализированы по всем кладам на соотношение несинонимичных (dN) и синонимичных (dS) замен (dN / dS) для каждого кодона с использованием оценочного отбора. для каждого кодона (HyPhy) в рамках модели метода Хасегава-Кишино-Яно в MEGA 7.0 [23].

3. Результаты

3.1. Гетерогенность геномов вируса гриппа H5N1 в различных тканевых органах

В этом исследовании с помощью NGS изучались геномы вируса гриппа H5N1 в четырех видах аутопсийных образцов: трахеи, легких, толстой кишки и кишечных фекалий. Результаты показали, что вирусный геном H5N1 был обнаружен во всех исследованных образцах. Глубокий анализ секвенирования всего генома в каждой ткани продемонстрировал квазивиды вируса. Выравнивание вирусных нуклеотидных последовательностей из этих 4 образцов показало 8 квазивидов в 6 сегментах генов, т.е.е., PB2, PB1, PA, HA, NP и NA, но не в M и NS. В сегменте PB2 присутствовали четыре положения смешанных нуклеотидных остатков. Смешивание A и G было обнаружено в 7 положениях, в то время как смешивание T и G было обнаружено в 1 положении (таблица 2 и рис. S1).