Роспотребнадзор структура: Роспотребнадзор

Речь не только об «опасных» странах. С такой рекомендацией сегодня выступила глава Роспотребнадзора, отметив, что под особым санитарным контролем пассажиры всех международных рейсов, прибывающих в Россию. А если отменить путешествие не получается, нужно соблюдать простые, но эффективные правила. Независимо от местонахождения.
Вы можете даже не знать, но за вашей температурой наблюдают. С помощью тепловизоров. С конца декабря в России проверку прошли уже более трех миллионов человек.

Между тем, в Роспотребнадзоре рекомендуют отложить поездки за границу. До лучших времен.
– Сегодня то время, когда не стоит выезжать из Российской Федерации, более 40 стран, на сегодняшнее утро это было 46,  заявили о том, что у них на территории диагностировано такое заболевание, как инфекция, вызванная новым коронавирусом, с разной интенсивностью распространения, разным объемом мероприятий по купированию ситуации, поэтому нужно оставаться в России, – выступила Анна Попова, руководитель Роспотребнадзора, главный государственный санитарный врач РФ.
Тревожнее всего ситуация, помимо Китая, по-прежнему в Иране, Южной Корее и Италии. При этом оснований для обязательного карантина россиян, приехавших из Италии, на данный момент нет.
– Сегодня мы не вводим обязательного карантина для всех, кто возвращается из Италии, совершенно обоснованно. Этому нет эпидемиологических оснований. Нужно обратиться по месту жительства в медицинское учреждение или по месту наблюдения, сказать, что вы вернулись оттуда, и вас должны взять под это самое наблюдение, – продолжила Анна Попова.
Большую работу проделали ученые. В России разработана своя тест-система по выявлению коронавируса. И если до сих пор диагностировать его можно было лишь в 15 лабораториях, теперь в 85. То есть такая возможность есть в каждом регионе.
– Количество тест-систем нарабатываемых достаточно, не только для РФ, но у нас есть возможность, и мы ее реализовали по обращению стран СНГ, ЕврАзЭС, мы поставляем текст-системы по их заявкам в эти страны и по поручению президента РФ мы отправляем тест-системы, также тест-системы были направлены в КНДР по запросу и в понедельник будут направлены в Монголию, – рассказала Анна Попова.
Также, по словам Поповой, по всей России подготовлено больше 350 так называемых обсерваторов, где можно поместить на карантин тех, у кого подозревают коронавирус или тех, кто контактировал с его носителями. В России новых случаев пока не выявлено. На улицах городов даже шутят.
– Мне кажется, можно не думать об этом просто. Стараться не думать и мыслить позитивно.
– И тогда коронавирус не пройдет?
– Обойдет меня стороной.
Сила мысли, может, и работает. Но сила чистых рук и медицинских масок куда верней. Менять их нужно, минимум, раз в три часа.

О центре

В настоящее время в состав ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО» входят:

• ФФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО в Ямальском районе»

• ФФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО в г. Губкинский»

• ФФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО в Надымском районе»

• ФФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО в гг. Ноябрьск, Муравленко»

• ФФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО в г. Новый Уренгой, Тазовском районе»

• ФФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО в Пуровском, Красноселькупском районах»

Возглавляет ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО» главный врач Харьков Виталий Викторович.

Задачами Центра является профессиональное и иное обеспечение деятельности Управления Роспотребнадзора по Ямало-Ненецкому автономному округу.

Ответственно и своевременно проводя работу по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения, Центр тесно взаимодействует с администрацией округа, органами местного самоуправления, другими федеральными органами и руководителями предприятий и учреждений различных форм собственности.

Центр имеет право осуществлять по договорам возмездного характера с гражданами, индивидуальными предпринимателями и юридическими лицами определенные приносящие доход исследования и экспертизы, не запрещенные законодательством Российской Федерации. Центр имеет право самостоятельно устанавливать цены на все виды производимых работ и оказываемых услуг. Учреждение предоставляет гарантированное качество лабораторных исследований. Универсальное оборудование позволяет выполнять широкий спектр исследований и экспертиз продукции любого плана. Все исследования проводятся прогрессивными методами, регламентированными нормативно-методическими документами Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Все лаборатории прошли аккредитацию и необходимую сертификацию, оснащены высокотехнологичной аппаратурой.

Высококвалифицированные специалисты Центра, более 70% которых имеют высшую и первую квалификационные категории, на высоком профессиональном уровне проводят санитарно-эпидемиологическую экспертизу размещения объектов, проектной документации, эксплуатации действующих объектов.

Новости — Правительство России

Брифинг посвящен текущему статусу эпидемии коронавируса, рекомендациям относительно новогодних праздников, вакцинации от коронавируса во время праздников и приостановленных полетов в Великобританию.

Брифинг руководителя Роспотребнадзора Анны Поповой

Вопрос: Г-жа Попова, первый вопрос, очевидно, касается ситуации с коронавирусом.Каков статус по состоянию на конец год?

Анна Попова: До новогодних праздников всего неделя. Для нас очень важно оставаться здоровым во время праздников.

Какие эпидемиологические показатели на конец года? Наша ежедневная заболеваемость лучше, чем в ряде стран. Суточная заболеваемость 18‒19. случаев на 100000 человек, что в три, четыре или пять раз ниже, чем в страны с высокой заболеваемостью и где количество ежедневных случаев рост вынуждает эти страны принимать чрезвычайные меры.

Заболеваемость ставка в нашей стране в настоящее время замедляется, и цифры стабильны. В В то же время ситуация варьируется от региона к региону. В некоторых регионах таких как Краснодарский край и Татарстан, суточная заболеваемость, рассчитанное как среднесуточное значение на 100 000 человек за неделю, составляет от 2 до 3. Есть и регионы с заболеваемостью более 60 лет. Таких не так много. регионов, но там ситуация другая и требует особых мер.

Во всем Ноябрь, количество регионов со средним темпом роста (что является одним из наши критерии оценки) более 1 процента, осталось от 44 до 50.К концу ноября было улучшение. Уровень распространенности или воспроизводство коэффициент (Rt), который показывает, сколько людей может быть потенциально инфицировано одним инфицированного человека до того, как он или она будет изолирован, снизилось до 1. В настоящее время это 1 из 77 регионов России, что означает, что дальнейшее распространение замедляется. вниз. Еще недавно таких регионов было от 15 до 20. Сейчас 77. в регионах Rt равно 1, что является еще одним показателем, показывающим, что эпидемиологическая ситуация в стране улучшается.

Вопрос: Г-жа Попова, напомните, пожалуйста, какие рекомендации люди следует следить, чтобы не заболеть на праздниках?

Анна Попова: Хочу отметить, что за любым статистика. И, к сожалению, эти люди болеют, а иногда и тяжело. больной. Основная цель до и во время праздников — не заключить договор. болезнь и избегать любых рисков, которые могут повлиять на ваше здоровье. Следовательно, мы имеем разработаны рекомендации, которые помогут людям оставаться в безопасности и не заразиться при различных обстоятельствах.Мы много работали над этими рекомендациями круглый год с весны, чтобы дать возможность различным отраслям экономики продолжить работу и провести различные мероприятия. Следуя этим правилам и рекомендации исключают риски для здоровья. Конечно, мы понимаем, что это невозможно, чтобы во время пандемии в группа. Но основная цель всех предлагаемых и разрабатываемых нами мер — это предотвратить дальнейшее распространение и убедиться, что заболеваемость в этой группе ограничена один больной или зараженный человек.

И мы видим, что следующие все наши правила тщательно помогают предотвратить распространение. Компании продолжают операционная. Мы завершили летнюю оздоровительную кампанию, когда более миллиона детей посетили летние курорты и не было ни одного случая болезни. На летних курортах вспышек не было, что тоже результат неукоснительного соблюдения наших правил.

Разработаны аналогичные правила для школьников. Впервые они были разработаны как рекомендации по организации учебный процесс, а не школьники как таковые.И следует отметить, что школьное обучение, которое возобновилось с 1 сентября (за некоторыми исключениями в особые обстоятельства, когда очные занятия были приостановлены), очевидно, оправдано и понятно. Ни в одном из этих случаев не было распространения инфекционных заболеваний в школах или на уроках. Это означает, что при следовании строго эти рекомендации (или кое-где санитарные правила) защитить людей от контакта с этим вирусом и заболевания.

Мы также разработали рекомендации на предстоящие праздники.Это не требования. Они будет интерпретироваться в каждом конкретном регионе в соответствии с местными эпидемиологическая ситуация. Но особо отмечу несколько моментов.

Что мы рекомендуем? Мы Рекомендуем ограничить количество участников выездных мероприятий до 50 человек. Это означает, что в собраниях на открытом воздухе не должно быть слишком много людей. Наша задача убедиться, что люди не могут заразиться вирусом друг от друга. Это цель этих рекомендаций.

Далее.Мы считаем, что это было бы максимально эффективно и безопасно проводить массовые мероприятия на открытом воздухе, а не в помещении. Катки и горки должны оставаться открытыми. Это также важно (и рекомендации включают этот совет), что эти развлекательные и спортивные центры работают таким образом, чтобы люди сохраняли социальную дистанцию, чтобы не зараженный. Поэтому количество людей, пользующихся катками и горками, должно быть достаточно маленьким, чтобы предотвратить близкий контакт. Задача организаторов — обеспечить безопасности и позвольте людям наслаждаться активным отдыхом, кататься на катках и слайды.Эти помещения должны оставаться открытыми, но с соблюдением правил техники безопасности. Шкафчик помещения или пункты проката оборудования не должны быть переполнены. Правильная организация процесс гарантирует безопасное и приятное времяпрепровождение на этих открытых площадках.

Ранее в этом году мы работали с бизнес-сообществом разработать рекомендации для всех туристических и эти рекомендации действуют по сей день. Но мы также считаю необходимым дать дополнительные рекомендации по курортный сезон.Я должен повторить, что правила предотвращения распространения вирус необходимо строго соблюдать при организации поездок и мероприятий. Маски необходимо носить там, где это необходимо. Люди должны поддерживать социальную дистанцию. Стирка руки и очистка кожи и поверхностей вокруг вас с помощью дезинфицирующих средств. важный. Любое путешествие увеличивает риски, поскольку мы меньше контролируем ситуации и самих себя из-за отвлекающих факторов. Поэтому очень важно следовать все меры, чтобы оставаться здоровым.

Отдельно стоит упомянуть общественный транспорт.У людей будет больше свободного времени для передвижения. Рекомендуем дезинфицировать поверхности в общественном транспорте чаще, чем обычно, потому что пассажир трафик будет выше. В общественном транспорте и в других местах обязательно надевать маски. общественные места.

Торговые центры и магазины привлечь больше людей до и во время праздников. Дополнительная ежедневная уборка и дезинфекция в течение дня и обязательно в конце рабочего дня являются обязательными на этих объектах.

Рекомендуем фудкорты закрывать для полной дезинфекции каждые три часа, потому что фуд-корты люди общаются без масок, и риск заражения, очевидно, выше.

Большое количество санаториев и отели будут открыты в праздничные дни. Рекомендуем организовать все праздников и особенно многолюдных мероприятий на открытом воздухе, чтобы снизить риск для здоровья гости.

Все средства размещения необходимо провести более тщательную очистку и дезинфекцию. После каждого выезда, помещения необходимо убирать с помощью парогенераторов и специального оборудования, которое сделать комнаты полностью безопасными для следующих гостей.

Очень важно отметить что требование о ношении масок в общественных местах остается в силе.Нет Рекомендация: это требование. Он был введен постановлением Главный санитарный врач в конце октября так и остается обязательным. Люди не требуется носить маски где угодно, но не в помещении, в общественном транспорте и в общественных местах Необходимо надевать маски для мероприятий.

Напомню также, что в нашей стране человека могут оштрафовать за то, что он не носит маску в общественных местах. Конечно, эти деньги могли быть полезнее где-нибудь еще и могли быть потрачены на подарки для близких.Ношение масок там, где это необходимо, также помогает людям оставаться здоровым. Поэтому, опять же, в России ношение масок в общественных местах, в помещении и в общественном транспорте — обязательно.

В целом меры, которые мы Предлагаю рекомендательные. Каждый субъект решит, следует ли им быть обязательным в зависимости от местной эпидемиологической ситуации. Опять же, ситуация варьируется от региона к региону. Но везде, где рекомендация становится требование, оно должно строго соблюдаться.

Итак, это то, для чего нужны новые или обновленные правила курортный сезон.

Вопрос: Попова г-жа, будет работа Изменится график работы лабораторий по тестированию на коронавирус в новогодние праздники?

Анна Попова: Очень важно, чтобы понимают, что медицинские тесты являются основным методом выявления пациентов, которые больны или являются источником инфекции, несмотря на отсутствие симптомов. я буду Хотел бы поднять в этой связи следующий вопрос. Праздники — это высокий риск период; следовательно, люди, страдающие каким-либо заболеванием или осложнением, должны оставаться дома и защищать себя и свою семью от возможных инфекционное заболевание.И, конечно же, им следует обратиться за медицинской помощью. А также тесты поскольку клинические симптомы, которые могут оценить только врачи, являются основными индикаторы сегодня. Все лаборатории Роспотребнадзора будут работать сверхурочно в течение праздников. Мы не только сохранили свое обычное рабочее время, но и расширили их, чтобы каждый мог сдать анализы в соответствии с медицинскими назначения, так что мы не пропустим ни одного случая.

Сегодня, Российская Федерация входит в тройку стран-лидеров по количество тестов на 100 000 населения.Естественно, мы сохраняем этот уровень, и мы стремимся увеличить количество тестов и количество людей которые прошли тестирование.

Сегодня, 962 лаборатории, в том числе 111 лабораторий Роспотребнадзора, 651 лаборатория в г. медицинских организаций и 200 коммерческих лабораторий, проводят ПЦР COVID-19 тесты. Они останутся открытыми, и это позволит гражданам России показываться даже во время праздников.

Это очень важно отметить, что совсем недавно нам потребовались эти лаборатории отправлять результаты анализов пациентам в течение 48 часов после получения результатов анализов. материалы.Большинство из них соответствуют этому требованию, и мы продолжаем достаточно жесткий контроль над этим процессом. За последние семь дней почти 99 процент тестов был завершен вовремя. Очевидно, некоторые из них не были завершено по графику. Следует иметь в виду, что 48-часовой период начинается сразу после того, как лаборатория получила образец для анализа, и заканчивается после пациент узнал окончательный результат.

Там также являются крайними сроками поставки тестовых образцов, и мы настаиваем на том, чтобы эти сроки были минимизирован; сегодня мы сотрудничаем со всеми, кто участвует в этом процессе.Однако некоторые регионы России действительно огромные, и многие из них имеют длину 3000 км, с их удаленными муниципалитетами. и сообщества, лишенные постоянной связи. Конечно, есть объективные причины здесь. К сожалению, мы также видим ряд нарушений. Хотя они составляют всего один процент, это довольно много. Виновные в за такие нарушения несут административную ответственность. Мы считаем это неприемлемый. Наши коллеги в регионах это понимают.

ср у нас есть телефонная служба для всех, кто просит объяснений, и мы справляемся со многими такие звонки. Люди жалуются на незаконные действия или задержку тестов в определенных лаборатории независимо от формы собственности. Телефонные номера размещены на сайтах региональных управлений Роспотребнадзора и у нас веб-сайт тоже.

А единый колл-центр Роспотребнадзора работает достаточно давно, и Считаю, что его телефонный номер давно известен многим: 8 (800) 555-49-43.

С января 2020 года наш колл-центр обработал почти 3,5 миллиона различных запросов, связанных с пандемией коронавируса. Это будет работать 24 часа в сутки в течение всего курортного сезона. Люди могут звонить в любое время и запросить помощь или потребовать, чтобы что-то было сделано в региональном уровень.

Если позволите, я хотел бы сказать несколько слов о ситуации, которая складывается с вечера субботы, 19 декабря, при обнаружении нового штамма вируса. Я считаю, что это важно.Этот Информация вызвала множество тревожных откликов и дискуссий. Вот обновленная информация о ситуации. Мы внимательно следим за публикациями наших коллеги в Великобритании и других странах Европейского Союза. Мы продолжаем вкладки о вирусной ситуации по всей Российской Федерации. Ссылка центр Исследовательского центра Вектор, внесенного в список Всемирного здравоохранения Организация как диагностический центр, отслеживает возбудителя нового коронавирусной инфекции и имеет все основания сказать, что обширное обследование вирусов во всех регионах России показывает, что данная мутация не обнаружена пока что нигде в России.

Мы точно знаем, что российские вакцины, которые иметь структуру, включающую консервативный и практически неизменный коронавирус белковые секции, также эффективны против этого штамма вируса, который сейчас так активно обсуждается в мире. И я могу только приветствовать тех, кто уже сделали прививки или планируют сделать это в новогоднюю ночь. Накануне или во время курортного сезона, потому что все центры вакцинации будут открыты. Считаю это решение вполне правильным. Российская Федерация в рейтинге среди тех немногих стран, которые предоставляют такую ​​возможность, и люди должны использовать этот шанс, несмотря ни на что.

Что касается нового штамма вируса, мы следуем ответ ЕС внимательно. Хотя последние несколько дней официальной позиции пока не озвучено. Мы следим за комментариями Всемирная организация здравоохранения и ее региональное отделение для Европа.

Сегодня проводят совещание по этому поводу. в Региональном бюро ВОЗ для Европы. Было принято решение приостановить авиасообщение с г. из Соединенного Королевства, пока ведется обсуждение, и пока коллеги ищут оптимальное решение.Эта превентивная мера направлена ​​на беречь здоровье народа Российской Федерации. Мы будем решать последующие действия после достижения полного понимания. А пока это мера остается в силе и способствует обеспечению безопасности населения России. Федерация.

Хочу отметить раньше К Новому году это здоровье, конечно же, лучший подарок. Этот год был довольно сложно, и очень важно, чтобы люди соблюдали все рекомендации и требования, о которых мы говорим почти 12 месяцев, чтобы оставаться здоровым.

Искренне желаю Мои дорогие соотечественники России с наступающим Новым годом, а также здоровья им, достаток и благополучие. Пожалуйста, будьте здоровы и поправляйте свое здоровье. С Новым Годом!

Совместная международная конференция ФАО и правительства России по безопасности пищевых продуктов и анализу рисков 18-19 мая 2017 г., Сочи, Россия

Российская Федерация и Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций (ФАО) совместно организуют международную конференцию под названием «Продовольствие. Безопасность и анализ рисков », которая состоится в Сочи, Россия, 18-19 мая 2017 года.С двумя организаторами, Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций (ФАО) и Роспотребнадзором, Федеральным агентством Российской Федерации по благосостоянию, правам потребителей и защите потребителей, конференция привлечет международную аудиторию и обсудит глобальные и региональные проблемы безопасности пищевых продуктов. Это международное совещание соберет более 350 делегатов, представляющих отраслевые правительственные учреждения, специализированные международные организации, частный сектор, ассоциации потребителей и научное сообщество.Конференция направлена ​​на обмен опытом и передовой практикой по оценке многогранных рисков для безопасности пищевых продуктов, усиление многостороннего диалога в области улучшения питания, расширение международного и межрегионального отраслевого сотрудничества и содействие партнерству между различными заинтересованными сторонами.

РЕГИСТРАЦИЯ ЗДЕСЬ

Основой для этой конференции является Повестка дня в области устойчивого развития до 2030 года , принятая в сентябре 2015 года, в которой поставлены цели по искоренению голода, обеспечению доступа к безопасной и питательной пище, искоренению всех форм недоедания, борьбе с инфекционными и неинфекционными заболеваниями.Достижение этих целей напрямую зависит от обеспечения безопасности пищевых продуктов. Как было подтверждено Второй Международной конференцией ФАО / ВОЗ по питанию (ICN2) , улучшение рациона и качества питания требует наличия соответствующих нормативных рамок и систем контроля для регулирования безопасности пищевых продуктов.

Повышение глобальной устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой серьезную угрозу для здоровья человека и животных. Это ставит под угрозу современную медицину и ветеринарию, а также безопасность наших продуктов питания и окружающей среды.Противомикробные препараты играют решающую роль в лечении болезней сельскохозяйственных животных (водных и наземных) и растений. Их использование необходимо для обеспечения продовольственной безопасности, благополучия людей и благополучия животных. Однако неправильное употребление этих препаратов, связанное с появлением и распространением устойчивых к противомикробным препаратам микроорганизмов, подвергает риску всех (FAO, 2016).

Объявленные цели совместно организованной конференции: 1) укрепление многостороннего международного сотрудничества в области безопасности пищевых продуктов, 2) улучшение питания на глобальном и региональном уровне, 3) реализация положений Повестки дня на период до 2030 года и рекомендаций ICN2, и 4) а Политическая декларация совещания высокого уровня Генеральной Ассамблеи ООН по устойчивости к противомикробным препаратам.

Проект программы включает такие темы, как:

• Глобальные риски для безопасности пищевых продуктов — настоящее время, 2020 и последующие годы;
• Принципы и современные подходы к оценке рисков безопасности пищевых продуктов;
• Стратегии оценки рисков для новых пищевых продуктов и технологий;
• Оценка рисков и управление рисками микробиологических загрязнителей в пищевых продуктах;
• Примеры передовой практики оценки рисков для химических загрязнителей пищевых продуктов;
• Международные стратегии оценки рисков на практике;
• Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП): оценка риска и возможные стратегии снижения риска;
• Фальсифицированные пищевые продукты: оценка риска для безопасности пищевых продуктов «неизвестно»;
• Информирование о рисках — стратегии и передовая практика;
• Социально-экономические аспекты безопасности пищевых продуктов: «достаточно питательные и безопасные продукты для всех»; и
• Нормативно-правовая база и международное сотрудничество в обеспечении безопасности пищевых продуктов.

Структура серораспространенности к вирусу SARS-COV-2 среди жителей Московской области в период эпидемии COVID-19

TY — JOUR

T1 — Структура серопространственности к SARS-COV- 2 вирус среди жителей Московской области в период эпидемии COVID-19

AU — Попова Анна Юрьевна

AU — Ежлова Елена Борисовна

AU — Мельникова Альбина А.

AU — Микаилова, Ольга М.

AU — Комбарова, Ю. Светлана

AU — Костина, Марина А.

AU — Алешкин, Андрей В.

AU — Лялина, Людмила В.

AU — Смирнов, Вячеслав С.

AU — Гвазава,

AU Кахабер Р.

AU — Козлов Антон В.

AU — Чапов Евгений В.

AU — Сычев Даниил Александрович

AU — Хаттатова Наталья В.

AU — Басов Артем А.

AU — Затевалов Александр Михайлович

AU — Новикова Лидия И.

AU — Бочкарева, Светлана Сергеевна

AU — Лиханская, Елена Ивановна

AU — Шарова, Алена А.

AU — Ломоносова, Валерия I.

AU — Тотолян, Арег А.

AU — , Сергей Ю

AU — Степанов Алексей В.

AU — Дмитриев Георгий Александрович

AU — Леонтьева Нина Ивановна

PY — 2020/1/1

Y1 — 2020/1/1

N2 — Пандемия заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 (далее COVID-19), была объявлена ​​ВОЗ в феврале 2020 года.В Московской области (МО) первый случай заболевания выявлен 7 марта 2020 года у женщины, приехавшей из Швейцарии. Через четыре недели начался стремительный подъем, пик которого пришелся на 20-ю неделю (11 мая 2020 г. — 17 мая 2020 г.), который сменился постепенным устойчивым снижением, продолжавшимся 13 недель. Цель. Определить уровень и структуру популяционного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 среди населения Московской области в период с 22 июня 2020 г. по 11 июля 2020 г. Пациенты и методы.Серологическое исследование серологической распространенности среди резидентов МР к COVID-19 проводилось с 22 июня 2020 года по 11 июля 2020 года в период устойчивого снижения заболеваемости. Работа проводилась в рамках первого этапа масштабной программы Роспотребнадзора по оценке популяционного иммунитета к вирусу COVID-19 среди населения Российской Федерации. Добровольцы для исследования отбирались методом анкетирования и рандомизации. В анализ включены результаты опроса 2688 человек.Количество волонтеров во всех возрастных группах было одинаковым. Содержание специфического IgG к нуклеокапсиду COVID-19 определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием тест-системы, изготовленной FBIS SRCAMB в соответствии с инструкциями производителя. Полученные результаты. Результаты исследования показали, что коллективный иммунитет всего населения Московской области составил 21,0%. Максимальный уровень популяционного иммунитета установлен у детей 14-17 лет (30,7%) и 1-6 лет (25.2%). Статистически значимых различий в уровне серологической распространенности между мужчинами и женщинами не было. В результате сероэпидемиологического исследования было показано, что в медицинском центре при наличии контактов с больными COVID-19 риск заражения увеличивается в 2,5 раза. После заражения COVID-19 антитела выявлялись в 78,7% случаев. У лиц с положительным результатом ранее полученного ПЦР-анализа антитела выявлялись в 82,8% случаев. Выявлена ​​высокая доля бессимптомной инфекции среди серопозитивных добровольцев, которая составила 83.4%.

AB — Пандемия заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 (далее COVID-19), была объявлена ​​ВОЗ в феврале 2020 года. В Московской области (МО) зарегистрирован первый случай заболевания. обнаружен 7 марта 2020 года у женщины, приехавшей из Швейцарии. Через четыре недели начался стремительный подъем, пик которого пришелся на 20-ю неделю (11 мая 2020 г. — 17 мая 2020 г.), который сменился постепенным устойчивым снижением, продолжавшимся 13 недель. Цель. Определить уровень и структуру популяционного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 среди населения Московской области в период с 22 июня 2020 г. по 11 июля 2020 г.Пациенты и методы. Серологическое исследование серологической распространенности среди резидентов МР к COVID-19 проводилось с 22 июня 2020 года по 11 июля 2020 года в период устойчивого снижения заболеваемости. Работа проводилась в рамках первого этапа масштабной программы Роспотребнадзора по оценке популяционного иммунитета к вирусу COVID-19 среди населения Российской Федерации. Добровольцы для исследования отбирались методом анкетирования и рандомизации. В анализ включены результаты опроса 2688 человек.Количество волонтеров во всех возрастных группах было одинаковым. Содержание специфического IgG к нуклеокапсиду COVID-19 определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием тест-системы, изготовленной FBIS SRCAMB в соответствии с инструкциями производителя. Полученные результаты. Результаты исследования показали, что коллективный иммунитет всего населения Московской области составил 21,0%. Максимальный уровень популяционного иммунитета установлен у детей 14-17 лет (30,7%) и 1-6 лет (25.2%). Статистически значимых различий в уровне серологической распространенности между мужчинами и женщинами не было. В результате сероэпидемиологического исследования было показано, что в медицинском центре при наличии контактов с больными COVID-19 риск заражения увеличивается в 2,5 раза. После заражения COVID-19 антитела выявлялись в 78,7% случаев. У лиц с положительным результатом ранее полученного ПЦР-анализа антитела выявлялись в 82,8% случаев. Выявлена ​​высокая доля бессимптомной инфекции среди серопозитивных добровольцев, которая составила 83.4%.

UR — http://www.scopus.com/inward/record.url?scp=85103300853&partnerID=8YFLogxK

U2 — 10.20953 / 1729-9225-2020-4-17-26

DO — 10.20953 / 1729- 9225-2020-4-17-26

M3 — Артикул

VL — 18

JO — Инфекционные Болезни

JF — Инфекционные Болезни

IS — 4

ER —

Связь между структурой -Штаммы вируса клещевого энцефалита и их патогенные свойства

Образец цитирования: Беликов С.И., Кондратов И.Г., Потапова Ю.В., Леонова Г.Н. (2014) Взаимосвязь между структурой штаммов вируса клещевого энцефалита и их патогенными свойствами.PLoS ONE 9 (4): e94946. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946

Редактор: Ульрике Гертруд Мундерлох, Миннесотский университет, США

Поступила: 2 декабря 2013 г .; Принята к печати: 20 марта 2014 г .; Опубликован: 16 апреля 2014 г.

Авторские права: © 2014 г. Беликов и др. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Работа поддержана проектом Международного научно-технического центра № 4006, проектами междисциплинарной интеграции Сибирского отделения Российской академии наук № 63 и 141 и государственным контрактом № П389. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) — одна из наиболее опасных нейровирусных инфекций человека; передача происходит через укусы клещей.Ареалы его распространения находятся в лесных зонах многих европейских стран, а также на севере Японии, Китая и Монголии. В России природные очаги инфекции распространены от Калининградской области на западе до острова Сахалин на востоке [1]. В период 1973–2003 гг. В Европе произошло 400% -ное увеличение заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ) [2], [3]. В 1990-е годы, когда уровень заболеваемости был высоким, КЭ был причиной не менее 11 000 случаев заболевания в России и примерно 3 000 случаев в остальной Европе [4], [5], [6], [7].В 2000-е годы заболеваемость КЭ постепенно снизилась; согласно официальной статистике, в 2009 году в России было зарегистрировано всего 1088 случаев (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (http://rospotrebnadzor.ru/documents/10156/a0a5f062-7498-4af7-b3f6-0a0d7d302c05).

ВКЭ является представителем вируса рода Flavivirus семейства Flaviviridae. Этот род включает около 80 видов, многие из которых являются патогенными для человека, например вирус Западного Нила, денге, желтая лихорадка, японский энцефалит и т. Д.[8]. Международная классификация флавивирусов делит ВКЭ на дальневосточный (FE), сибирский (SIB) и (западно) европейский (WE) подтипы [9]. Они были названы в соответствии с их преобладающим распространением в Евразии [4], [5], [10], [11], [12].

Клиническое течение КЭ на Дальнем Востоке признано более тяжелым, чем в других регионах Евразии [13]. Доминирующая энцефалитная форма заболевания отличается крайней степенью тяжести и летальностью. Основной характеристикой КЭ КЭ является быстрое проявление общих поражений центральной нервной системы, вызывающих очаговый или диффузный менингоэнцефалит с поражением ствола головного и спинного мозга.До 1990-х годов смертность иногда достигала 30% [14]. С тех пор сообщалось, что трансформация клинических проявлений инфекции на Дальнем Востоке снизила смертность до 13% и увеличила долю нефокальных форм КЭ [13]. Вероятно, это связано с появлением и распространением в ареале новых вариантов ВКЭ с мутациями, вызывающими субклинические формы заболевания [15].

Точная генетическая основа этих различий в форме и тяжести заболевания неясна.Ранее степень тяжести переменной была связана с подтипом вируса [16]. Позже выяснилось, что прямой связи между подтипом ВКЭ и тяжестью заболевания нет. Несоответствие подтипа вируса тяжести клинических проявлений заболевания особенно наблюдается на Дальнем Востоке России, где преобладает подтип FE при отсутствии SIB и WE TBEV. Однако здесь регистрируют разные формы заболевания: от энцефалических форм, часто приводящих к летальному исходу, до асимптотических и субклинических форм [13].Ранее многими исследователями было показано, что патогенные маркеры флавивирусов локализуются в гене белка оболочки E [17], [18], [19], [20]. Кроме того, мутации, расположенные в других частях вирусного генома, могут изменить патогенность вируса [21].

Как правило, с целью определения вирулентности и патогенности вирусных штаммов изучается их нейроинвазивность и нейровирулентность у мышей или изменения ростовых характеристик клеточной культуры. Однако нет четкой корреляции между вирулентностью штаммов у мышей и патогенностью штаммов у людей [22], [23], [24], [25].Следовательно, это требует определения и анализа полных нуклеотидных последовательностей штаммов, выделенных от пациентов с различной степенью тяжести заболевания, для обнаружения мутаций в геноме ВКЭ, которые влияют на патогенность штаммов у людей. Сравнение полных геномов может позволить определить ранее неизвестные участки генома, которые могут быть коррелированы с патогенезом.

В наших предыдущих исследованиях мы сравнили геномы нескольких штаммов, выделенных от пациентов с субклиническими формами заболевания, и указали на специфические мутации в штаммах с разной патогенностью [15].Тем не менее, необходимо проанализировать больше штаммов, чтобы повысить надежность этих результатов и исключить единичные спонтанные мутации, возникшие в процессе эволюции вируса. В этой работе мы проанализировали 34 полных генома штаммов FE-TBEV, которые вызывали заболевание различной степени тяжести у людей. В анализ включены полные геномы 11 патогенных штаммов человека, выделенных от пациентов с энцефалитной формой заболевания (Efd), 19 штаммов от пациентов с субклинической формой заболевания (Sfd), 4 штаммов Ffd с промежуточными характеристиками, вызывающими лихорадку. по сравнению с ранее опубликованными геномами штаммов Efd Sofjin, Glubinnoe и Senzhang и штамма с низкой вирулентностью Oshima 5-10, выделенного в Японии.Мы исследовали мутации в различных группах штаммов Efd и Sfd человека и попытались описать влияние индивидуальных аминокислотных замен в белках вируса на изменчивость патогенности штаммов TBEV.

Результаты

Сравнение нуклеотидных последовательностей

Длина нуклеотидных последовательностей геномов варьировала от 10 405 до 11 103 нуклеотидов (консервативная область содержала 10 376 нуклеотидов, и различия были обусловлены переменной длиной 3 ‘нетранслируемой области (UTR)).Более того, 8131 положение было постоянным во всех проанализированных штаммах ВКЭ. Мутации чаще всего располагались в позиции третьего кодона и обнаруживались в 2245 позициях генома (21,6%). Выровненные последовательности геномов, 3’-UTR и полипротеинов не показаны, но могут быть предоставлены по запросу. На рисунке S1 схематично представлены выровненные последовательности 3 ‘UTR. Сравнение полного генома и аминокислотных последовательностей отдельных вирусных белков из всех секвенированных образцов и ранее зарегистрированных штаммов с определенными типами патогенности для человека дается в форме матрицы (рисунок S2).Понятно, что полные геномы штаммов несколько различались, и не было четкой границы между штаммами Efd и Sfd. Мутации, определяющие патогенность штаммов, было сложно идентифицировать на фоне случайных замен нуклеотидов.

Филогенетический анализ.

Мы использовали оценку максимального правдоподобия для анализа дискретных данных для выполнения филогенетического анализа полных секвенированных геномов по сравнению с ранее сообщенными последовательностями генома подтипа FE и прототипа подтипа SIB (Васильченко) и WE (Neudoerfl) TBEV (рис. 1).Анализ показывает, что все секвенированные штаммы относятся к подтипу вируса FE и явно отличаются от штаммов подтипов SIB и WE.

Рис. 1. Филогенетическое дерево ML штаммов ВКЭ.

Дерево основано на полных геномах штаммов, вызывающих заболевания разной степени тяжести. Патогенные штаммы Efd показаны черным цветом, штаммы Sfd — зеленым, а штаммы с лихорадочной формой TBEV — красным. Штаммы-прототипы показаны синим цветом.Числа над или под ветвями указывают вероятности апостериорных узлов и значения начальной загрузки из анализа NJ.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g001

Патогенные штаммы Efd делятся на две ветви, что может быть связано с географической изоляцией ареалов видообразования предковых форм вируса. Действительно, штаммы кластера II включают штаммы, родственные штамму Sofjin, выделенному в России, Приморье, а штаммы кластера III включают штаммы, родственные штамму Senzhang, изолированному в северном Китае.Штаммы Sfd образуют отдельный кластер (I), но имеют общего предка со штаммами кластера II. Мы не обнаружили, что штаммы Sfd имеют общего предка со штаммами кластера III. Штаммы ВКЭ (Fdf), вызывающие лихорадочное заболевание, не образовывали особого отдельного кластера, за исключением штамма Шкотово-94, который составлял отдельную ветвь. Три других штамма, а именно Кипарис-94, Приморье-89 и Приморье-52, вызывают лихорадку и находятся в кластерах II и I. Аномальное расположение этих штаммов будет обсуждаться позже в разделе «Исключения».

Предсказание вторичных структур геномных 5 ‘и 3’ нетранслируемых областей и возможных мотивов образования РНК.

Геномная 5′-нетранслируемая область является консервативной и содержит 131 нуклеотид. Ни одна из позиций не коррелировала с изменениями патогенности штамма, а одиночные мутации в основном обнаруживались у патогенных штаммов в левой части фрагмента (рис. 2). Другими словами, мы не обнаружили положения, в котором замены достоверно различались между штаммами Efd и Sfd, но были одинаковыми в этих группах.Предсказанная структура 5′-UTR штамма Sofjin состоит из трех петель ствола: большая петля ствола (SLA), вторая петля короткого ствола (SLB) и третья петля ствола (SLC) со стартовым кодоном AUG для трансляции как части. стержня (Рисунок S3). Предыдущие исследования показали, что область SLA вируса денге является промотором, который распознается вирусной РНК-полимеразой RdRp [26]. Несмотря на некоторые незначительные различия в конформации 2D структур, нам не удалось выявить какой-либо корреляции между особенностями конформации РНК и патогенностью штамма.

Рисунок 2. Выровненные нуклеотидные последовательности 5′-UTR.

Патогенные штаммы Efd показаны черным, штаммы Sfd зеленым, а штаммы с лихорадочной формой ВКЭ показаны красным. Штаммы-прототипы показаны синим цветом. Нуклеотиды, идентичные последовательности штамма Sofjin, обозначены точками соответствующего цвета.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g002

Геномная 3′-UTR неоднородна по длине: от 31 до 728 нуклеотидов в разных штаммах, в зависимости от длины делеций (рисунок S1).Хотя о такой гетерогенности 3′-UTR сообщалось ранее [27], мы впервые описали варианты TBEV с обширными делециями, покрывающими почти всю 3′-UTR. Только патогенный штамм «Светлогорье» имел полноразмерный 3 ‘НТО. Штаммы Sfd Приморье-69, Приморье-202, Приморье-18 и штамм Осима 5-10 имели делецию трех нуклеотидов в положениях с 185 по 187 и одного нуклеотида в положении 399. Кроме того, патогенный штамм Приморье-87 имел делецию. две делеции, при этом три нуклеотида удалены из положений 185–187, и три — из положений 235–237.Другие проанализированные штаммы имели более обширные делеции в 3 ‘UTR; их положение и длина различаются в зависимости от деформации (Рисунок S1). Характерной особенностью 3’-UTR флавивирусов, передаваемых клещами, является делеция ~ 220 нуклеотидов от -325 до -545 п.н., обнаруженная во многих штаммах ВКЭ. Например, данная делеция ранее обнаруживалась у штаммов подтипа FE, выделенных в Китае (MDJ01 (JQ650522), MDJ-02 (JF316708), MDJ-03 (JF316708)), штаммов подтипа SIB (Заусаев (AF527415) и 178-79 (EF469661)) и подтипа WE HYPR (U39292).В то же время мы показали, что положение и размер этой делеции не сохраняются, но варьируются в разных штаммах (Рисунок S1). Таким образом, делеция расположена ближе к стоп-кодону у штаммов Sofjin, Kavalerovo и Glubinnoe (рисунок S1).

Первые вариантные штаммы, описанные с самой длинной делецией 3′-UTR из 697 нуклеотидов, охватывающей область от 9 до 705 п.н. (Рисунок S1), являются наиболее необычными. Эти штаммы содержат 9 нуклеотидов около стоп-кодона и 21 нуклеотид в концевой части 3′-UTR.Более того, точная последовательность 21-членного концевого фрагмента неизвестна, но ее можно определить по структуре праймера, используемого для амплификации РНК. Эта самая длинная делеция наблюдалась у шести штаммов Sfd: Приморье-208, Приморье-274, Приморье-828, Приморье-823 и Приморье-345, а также у двух штаммов Efd Приморье-52 и Приморье-739, расположенных в кластере патогенных штаммов. в филогенетическом дереве, которое вызвало субклиническое заболевание (рис. 1). Это предполагает, что самая длинная делеция в 3 ‘UTR может резко снизить патогенность.

Большинство штаммов, за исключением штаммов с обширными делециями, и двух штаммов, Спасск-72 и Приморье-437, лишенных концевой части, но с относительно протяженной 3′-UTR, имеют консервативные концевые части длиной 327 нуклеотидов. Этот консервативный регион содержит ряд мутаций, которые не коррелируют с патогенностью штаммов, и мутаций -C245T и -A302G, которые различаются между группами штаммов с разной патогенностью.

Предсказанная 2D структура 3 ‘UTR состоит из нескольких петель.Крайняя петля в диапазоне от -1 до -85 нуклеотидов (CR1) консервативна во всех штаммах. На рисунке S4 показан пример предсказанных 2D структур концевой части 3 ‘UTR для штамма Sfd Primorye-320 и патогенного штамма Svetlogorie. Очевидно, топология петель кардинально не отличается. Более того, мы показываем, что мутации -C245T и -A302G, которые различаются по группам штаммов с разной патогенностью, расположены вне стеблей и, вероятно, являются случайными и не влияют на патогенность штаммов.

Циклизация 5 ‘UTR и 3’ UTR раскрывает SLB в 5 ‘NTR (Рисунок S5) и часть петли (CR1) в 3’ UTR с образованием нового расширенного двухцепочечного фрагмента (Рисунок S5), известного как область AUG выше по течению (5 ‘UAR) [28]. Этот фрагмент расположен перед стартовым кодоном AUG и необходим для репликации вирусной РНК [28], [29], [30], [31].

В отличие от переносимых комарами флавивирусов, стартовый кодон расположен в SLC, который не участвует в формировании 5′-UAR и остается неизменным.Положения 109–128 5′-UTR были полностью консервативными во всех проанализированных штаммах, без нуклеотидных замен (рис. 2). Положения 3′-UTR от -64 до -84 также были консервативными во всех штаммах, независимо от их патогенности, за исключением штаммов, содержащих обширные делеции (рисунок S1).

Тем не менее штамм Спасск-72 сохранил патогенные свойства, несмотря на отсутствие мотивов циклизации.

Сравнение белков в группах штаммов ВКЭ

Аминокислотные последовательности полипротеинов более консервативны, чем нуклеотидные последовательности генома.Таким образом, наблюдаемая группа штаммов имела только 198 положений (<6,4%) с заменой по крайней мере одного аминокислотного остатка. Полипротеины патогенных штаммов TBEV (Efd) имели длину 3414 а.о., но штаммы Sfd имели делеции одной аминокислоты в положении 111 капсидного белка.

Поскольку большинство аминокислотных остатков в полипротеинах являются постоянными, для удобства мы удалили консервативные аминокислотные остатки из анализа и сохранили только те положения, в которых мы наблюдали хотя бы одну аминокислотную замену (Рисунок S6).Очевидно, что многие одиночные аминокислотные замены хаотично распределены по полипротеину. Однако существуют также замены аминокислотных остатков, специфичных для групп Efd и Sfd этих штаммов вируса.

В таблице 1 представлены 17 ключевых аминокислот, замены которых коррелируют с изменениями патогенности штаммов. В этот список включены только те аминокислоты, которые достоверно различаются в группах штаммов с различной патогенностью для человека. Из таблицы видно, что большинство замен аминокислотных остатков однозначно определяют положение штаммов в группах с переменной патогенностью, за исключением нескольких случайных замен в штаммах Sofjin, Primorje-89, Primorye-94 и Kiparis-94.Штаммы Шкотово-94, Осима и Приморье-69, расположенные на границе между штаммами Efd и Sfd, имели неполный набор замен ключевых аминокислот. В 8 из 10 белков ВКЭ мы обнаружили замены ключевых аминокислот; они не были обнаружены в неструктурных белках NS2A и NS4A. Замены в двух последних белках не коррелировали с изменениями патогенности штаммов.

Обсуждение

Мы секвенировали и проанализировали нуклеотидные последовательности полных геномов 34 штаммов FE TBEV, выделенных от пациентов с различной степенью тяжести заболевания.Подтип FE TBEV был выбран потому, что его штаммы обычно вызывают тяжелые заболевания у людей, что позволило нам собрать достаточное количество штаммов с диаметрально противоположной патогенностью у людей [13].

Тяжесть ВКЭ может зависеть как от характеристик человека-хозяина и состояния его иммунной системы, так и от специфики генома ВКЭ. В этом отчете мы не рассматривали состояние иммунной системы пациентов, место укуса клеща, время воздействия и другие факторы, которые могут повлиять на тяжесть заболевания, а вместо этого сосредоточились на особенностях генома Штаммы ВКЭ, выделенные от пациентов с различной степенью тяжести заболевания.Ранее мы предположили, что специфические мутации генома ВКЭ, приводящие к заменам аминокислот, могут определять различия в тяжести заболевания [25]. Это исследование подтверждает эту гипотезу, исследуя большее количество штаммов ВКЭ. Наше исследование было направлено на поиск взаимосвязи между мутациями, обнаруженными в полных геномах штаммов, и различиями в патогенности штаммов у людей.

Существует несколько причин для анализа полных геномов большого числа близкородственных штаммов ВКЭ.Спонтанные случайные одиночные мутации могут включаться в вирусную РНК во время репликации РНК-зависимыми РНК-полимеразами и не могут быть исправлены, поскольку RdRp не обладает 3′-экзонуклеазной активностью. Количество таких мутаций должно увеличиваться с увеличением числа пассажей, если исключить возможность элиминации мутантных вариантов вирусной РНК при последующих пассажах в другом организме того же вида. Есть опасения, что продолжительные пассажи ВКЭ у грудных мышей могли привести к адаптации вируса к мышам и вызвать некоторые мутации, которые не присутствовали в вирусах, выделенных из клеток человека [32].Этот сдвиг не оказал существенного влияния на настоящее исследование, поскольку мы исследовали множество штаммов и не принимали во внимание случайные одиночные мутации; более того, мы рассмотрели только существенные различия между двумя группами штаммов, вызывающих заболевание разной степени тяжести. Если специфическая замена может быть вызвана во время адаптации хозяина, логично предположить, что она не будет отличаться в двух группах штаммов Efd и Sfd, и мы не учитывали их в нашем анализе. Возможен и другой вариант, когда конкретная замена происходит в одной группе штаммов.Мы не можем идентифицировать такое изменение с помощью настоящего анализа, поэтому его можно принять за ключевую мутацию, которая влияет на патогенность штаммов. Дальнейшие исследования могли бы решить этот вопрос, используя обратную генетику, получая инфекционные клоны кДНК, вводя точечные мутации и оценивая нейровирулентность у обезьян для выявления ошибок.

Во-вторых, анализ штаммов только одного, а не нескольких подтипов исключает мутации, приобретенные штаммами разных подтипов в течение длительного периода эволюции, что может значительно усложнить анализ.Например, штамм Sofjin подтипа FE TBEV отличается от штамма Васильченко подтипа SIB 1486 мутациями в кодирующем белок домене, приводящими к 174 аминокислотным заменам. Количество доступных штаммов SIB значительно ниже, чем количество замен; следовательно, невозможно идентифицировать те замены, которые влияют на патогенность вируса.

Нейропатогенный потенциал ВКЭ включает два различных свойства вируса, т.е.е. нейроинвазивность и нейровирулентность [33]. В этом отчете мы будем использовать общее понятие «патогенность человека», основанное на различиях в степени тяжести заболевания. Следует отметить, что все проанализированные штаммы, независимо от патогенности человека, были нейроинвазивными и нейровирулентными у белых мышей [25].

В таблице 2 обобщены данные о времени и месте выделения штаммов, истории пассажа и тяжести клинических проявлений. На Рисунке S7 показана карта Приморья (Дальний Восток России) и места выделения штаммов.Очевидно, что большинство штаммов Sfd были изолированы вокруг Владивостока от людей, которые посещали лес с краткосрочными домашними целями или туризмом, а затем обращались в городские медицинские учреждения для профилактики и лечения клещевого энцефалита. Жители отдаленных районов обычно не обращаются за помощью на такие станции, а это значит, что у нас нет достоверных данных о циркулирующих штаммах Sfd в этих местах.

Анализ нуклеотидных последовательностей

Длина вирусной РНК анализируемых штаммов варьировала от 10 404 т.п.н. (Primorje-208) до 11 103 т.п.н. (Svetlogorie) в зависимости от размера делеции в 3′-NTR.На рисунке S2 показаны данные о сходстве аминокислотных и нуклеотидных последовательностей консервативных частей геномов. Очевидно, что нет четкой границы между штаммами вирусов, вызывающими разную степень тяжести заболевания. Значения синонимичных ( d _S ) и несинонимичных ( d _N ) скоростей замен, рассчитанные для полной кодирующей области генома с помощью codeml в пакете PAML [34], [35], были низкими. . Значения d _N / d _S (макс.) = 0.0615 и d _N / d _S (среднее) = 0,0416 указывает на отсутствие адаптивного отбора в анализируемой группе штаммов, что соответствует ранее опубликованным данным по другим флавивирусам [36], [37].

На филогенетическом дереве есть три четко видимых кластера (рис. 1). Кластер I в основном содержал штаммы Sfd и штамм Oshima, который был изолирован в Японии (его патогенность для человека не описана), тогда как кластеры II и III содержали патогенные штаммы Efd человека, включая прототип Sofjin [38], [39] и Senzhang [40], ранее выделенные на Дальнем Востоке России и Северо-Восточном Китае соответственно.Штаммы в кластерах II и I ВКЭ имеют общего предка, в то время как кластеры I штаммов Sfd являются более молодыми. Не было выявлено отдельной группы штаммов Ffd, способных вызывать фебрильную форму заболевания, за исключением штамма Шкотово-94, распределенного между II и I кластерами (рис. 1). Три других штамма, которые привели к лихорадке ВКЭ, относились либо к патогенным штаммам кластера II (Приморье-94), либо к штаммам Sfd кластера I (Кипарис-94 и Приморье-82). Особенности этих и некоторых других штаммов, положение которых в филогенетическом дереве не совпадало с тяжестью заболевания (Приморье-86, Приморье-90, Приморье-52 и Приморье-739), описаны в специальном разделе «Исключения».

Особенности последовательностей 5 ‘и 3’ UTR могут изменять патогенность ВКЭ [41], [42]. Участки генома, способные образовывать комплементарные комплексы между фрагментами 5 ‘UTR и 3’ UTR (так называемые домены циклизации), которые необходимы для репликации вирусной РНК, играют важную роль в репликации TBEV [26], [29] , [43], [44]. Фигуры S5 показывают, что вторичные структуры UTR штамма Efd Svetlogorie и штамма Sfd Primorye-18 оба имеют 3 ‘UTR полной длины. Понятно, что существенных отличий в конструкциях нет.Последовательности, образующие комплементарные комплексы между фрагментами 5′-UTR и 3’-UTR, сохраняются во всех штаммах, независимо от их патогенности. В последовательностях 3 ‘корового элемента проанализированных штаммов мы обнаружили несколько однонуклеотидных замен, три из которых (A426G, C483T и G532A / C) были разными у штаммов Efd и Sfd, но не влияют на двумерную упаковка 3 ‘UTR (Рисунок S4).

Таким образом, мутации, обнаруженные в последовательностях 5 ‘UTR и 3’ UTR штаммов Efd и Sfd, не коррелируют с патогенностью и, вероятно, являются случайными.Более того, мутации в 3 ‘UTR, включая те, которые различаются между штаммами Efd и Sfd, не влияют на патогенность и являются случайными. Однако возможно, что неидентифицированные специфические нуклеотидные последовательности в 3 ‘UTR могут влиять на положение и размер делеций, возникающих при передаче вируса от клещевых клеток к клеткам млекопитающих.

Одной из особенностей 3 ‘UTR в проанализированных штаммах является наличие протяженных делеций, которые различаются по положению и размеру у разных штаммов.Механизм возникновения этих делеций, их роль и значение для эволюции вирусной популяции неясны; следовательно, эта проблема требует детального обсуждения. Предыдущие исследования показали различную степень влияния искусственного введения протяженных делеций разной длины, начиная от стоп-кодона до корового элемента, на выживаемость и патогенность вирусных штаммов [45], [46].

Анализ наших данных также показывает, что расширенные делеции не оказывают значительного влияния на патогенность штамма и эффективность репликации вируса в клетках млекопитающих, если они не влияют на консервативную концевую часть 3 ‘UTR, составляющую приблизительно 325 нуклеотидов.Эта область 3 ‘UTR включает регуляторные элементы и последовательности, участвующие в циклизации вирусной РНК (рисунок S1). Если это предположение верно и наличие протяженных делеций в 3′-UTR не влияет на основной элемент и репликацию вируса, существование вариантов вируса с полноразмерной 3’-UTR в природе неясно, поскольку такие варианты должны быть удалены из вирусной популяции в течение нескольких циклов смены хозяина. Однако возможно, что это удаление не происходит, потому что удаляемый фрагмент генома в клетках млекопитающих важен для выживания TBEV в клетках клещей [10], [27], [47].

ВКЭ циркулирует в природе путем циклической передачи от клещей мелким млекопитающим с последующим возвращением к переносчику иксодовых клещей, где вирус распространяется и сохраняется в течение длительного периода. Этап выживания вируса в клетках млекопитающих необходим, но незначителен по времени [48], [49]. Фрагмент вирусного генома, удаленный в клетках млекопитающих, не может снова появиться в клетках клещей во время чередующихся циклов передачи вируса от клещей к млекопитающим и снова к клещам.Этот факт может указывать на то, что удаление фрагмента 3 ‘UTR не является количественным; следовательно, некоторая часть вирусной популяции в клетках млекопитающих имеет полноразмерную 3 ‘UTR. Возможно, только эта вирусная частица, содержащая полноразмерную РНК, может эффективно передаваться клещам, питающимся инфицированным животным. Варианты вируса, которые потеряли фрагмент 3 ‘UTR во время размножения в клетках млекопитающих, вероятно, не могут эффективно воспроизводиться в клетках клещей и, вероятно, не могут участвовать в циркуляции вируса в природе.

Исследования Labuda et al. подтвердите это предложение. Они показали, что ВКЭ наиболее эффективно передается от инфицированных клещей наивным клещам во время совместного кормления животным [50], [51]. Лабуда с соавторами показали, что виремия или систематическая инфекция не являются необходимыми для успешного переноса. Более того, они могут препятствовать передаче вируса. Наши предположения о структурно-опосредованном удалении 3′-UTR-фрагмента, затронутого неизвестными ферментами клеток млекопитающих, и невозможности передачи вирусных частиц с удаленным 3′-UTR-фрагментом в популяции клещей, хорошо согласуются с этими данными.Механизм удаления фрагмента и связь между размером и расположением делеций с нуклеотидными последовательностями фрагментов неизвестны. Возможно, что скорость удаления фрагмента 3 ‘UTR из вирусного генома зависит от типа клетки и минимальна в дендритных клетках, которые являются основными мишенями вируса [52]. Labuda et al. не изучали структуру 3 ‘UTR в своей работе по передаче вируса между клещами, питающимися совместно; поэтому было бы интересно повторить эти исследования с идентификацией делеций в 3 ‘UTR и возможного влияния делеций на передачу вируса в популяции клещей.

Конечный коровой элемент с высококонсервативными нуклеотидными последовательностями ранее был обнаружен во всех проанализированных штаммах ВКЭ. Этот консервативный сайт был указан во многих публикациях [27]. Весь основной элемент был предопределен для формирования четко определенной вторичной структуры в зависимости от последовательностей соседних вариабельных элементов генома [53]. Большинство проанализированных штаммов имеют концевой консервативный коровый элемент длиной около 325 нуклеотидов, за исключением трех штаммов Efd и шести Sfd, у которых отсутствует коровой элемент.Ранее Mandl et al. показали, что мутантные варианты вируса с делецией, покрывающей коровый элемент, нежизнеспособны [45]. В нашем исследовании выживаемость штаммов с удаленными коровыми элементами, по-видимому, определялась неполным (неколичественным) удалением фрагмента 3 ‘UTR. Такая смесь вариантов с полноразмерными и удаленными 3′-UTR способна выжить у позвоночных, но наш метод анализа последовательности 3’-UTR может не точно определять количество различных вариантов вируса.

Мы идентифицировали аналогичные штаммы с расширенной делецией в группе штаммов Sfd (Приморье-208, Приморье-274, Приморье-345, Приморье-437, Приморье-823 и Приморье-828) и в группе штаммов Efd (Приморье- 52 и Приморье-739). Последние два штамма вызывали субклиническую форму заболевания; следовательно, обширная делеция в 3 ‘UTR резко снижает патогенность штаммов у людей. Мы предполагаем, что обширная делеция в 3 ‘UTR в штаммах Primorye-739 и Primorye-52, вероятно, произошла на начальных стадиях инфекции у пациентов, что привело к снижению патогенности вируса и субклиническому течению заболевания. .

Штамм Спасск-72, который расположен в кластере патогенных штаммов и имеет необычную протяженную делецию в 3′-UTR, включая основной элемент, был изолирован от пациента со смертельным энцефалитом. Это может быть связано с содержанием в организме человека значительного количества вариантов вируса с полноразмерной 3 ‘UTR, чего мы не наблюдали.

К сожалению, наш метод секвенирования генома не подходит для количественного определения соотношения полноразмерных и удаленных вариантов вируса; следовательно, необходимо разработать новый подход к анализу изменчивости 3 ‘UTR во время передачи TBEV от клещей к различным клеткам млекопитающих.Возможно, что недавно описанный подход, основанный на использовании реакции клонирования с удлинением кольцевой полимеразы (CPEC), может быть адаптирован [54].

Анализ аминокислотных последовательностей

Цикл репликации вируса включает несколько стадий, то есть прикрепление вируса к поверхности клетки-мишени, репликацию РНК, а также синтез и процессинг вирусного белка и сборку вирусных частиц [55].

Аминокислотные замены в различных частях полипротеина могут влиять на разные стадии репликации вируса и патогенность штамма, но точные механизмы этого влияния неизвестны.Роль каждой аминокислоты также неясна. Большинство аминокислотных замен, обнаруженных в вирусной популяции, могут быть случайными и (или) определяться адаптацией вируса к различным средам, что означает, что они не могут повлиять на патогенность штаммов. Мы обнаружили 198 позиций с заменами аминокислот в полипротеине длиной 3414 а.о. (Рисунок S6). Замены в большинстве положений были специфичными для небольших групп штаммов, которые характеризуют эволюцию вирусной популяции, а не коррелируют с изменениями вирулентности штаммов.Однако 17 аминокислотных замен различались между группами штаммов Efd и Sfd (таблица 1). Таблица 1 показывает, что как структурные, так и неструктурные белки имели специфические аминокислотные замены, а фигура 3 показывает положение конкретных ключевых аминокислотных замен в полипротеине.

Рисунок 3. Третичная структура протеазы NS3.

Кристаллическая структура протеазы Западного Нила (код PDB 3e90) была взята в качестве шаблона для моделирования гомологии. (A) Третичная структура NS3 / NS2B для патогенного штамма Дальнегорск.(B) Третичная структура NS3 / NS2B для штамма Sfd Приморье-270. Стрелки указывают замену ключевых аминокислот. Активный центр обозначен прямоугольником, а его аминокислотные остатки показаны красными атомами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g003

Ниже более подробно описаны функция каждого белка и возможная роль ключевых аминокислотных замен.

Вирусные частицы всех флавивирусов имеют нуклеокапсид, окруженный двухслойной липидной мембраной, внутри которой находятся два фиксированных структурных белка, поверхностный белок E (приблизительно 54 кДа) и мембранный белок-предшественник prM (приблизительно 27 кДа) [8 ].

Отщепление капсидного белка от полипротеина происходит в два этапа:

— На первой стадии расщепление C-prM сигналами хозяина образует мембраносвязанный протеин C с сигнальным пептидом (C _int ).

— Вторая стадия — это расщепление мембраносвязанной формы белка C _int вирусной протеазой, комплексом NS2A / NS3, с образованием зрелого капсидного белка [56]. Однако предыдущее исследование показало, что расщепление связи C-prM происходит неэффективно в отсутствие вирусной протеазы и первоначально отщепляет сигнальный пептид от C _int [57].

Несмотря на эти разные гипотезы, эффективная сборка вирусных частиц требует строгого баланса каталитической активности двух протеаз, то есть сигналазы и вирусной протеазы [58]. Нуклеокапсид способен интегрироваться в почку, образованную поверхностными белками prM и E в мембране эндоплазматического ретикулума. При накоплении 180 prM и белков E этот зачаток отделяется от родительской мембраны, и незрелая вирусная частица транспортируется из клетки через сеть транс-Гольджи.В отсутствие нуклеокапсида белки prM и E с частью мембраны могут эффективно формировать небольшие бескапсидные субвирусные частицы (SVP) [59]. Недавние исследования ВКЭ показали, что введение определенных делеций и аминокислотных замен в протеин C нарушает сборку инфекционных частиц, что приводит к образованию многих неинфекционных субвирусных частиц [53], [60], [61].

Структурный протеин C изучаемых штаммов является наиболее нестабильным, т. Е. Он имеет три ключевые аминокислотные замены и делецию одной аминокислоты в позиции 111 у штаммов Sfd с длиной белка 116 а.о. несут в этом положении аминокислотные остатки Leu, Val, Met или Ile (Таблица 1).Эта делеция расположена в сигнальном пептиде, рядом с сайтом расщепления сигналазой. Кроме того, сигнальный пептид содержит замену D100N в трансмембранном домене. Обе эти замены могут определять положение и эффективность процессинга (т.е. они содержатся в сайте расщепления сигнального пептида). Расчеты наиболее вероятных сайтов расщепления показали, что делеция аминокислоты не изменяет положение сайта расщепления сигнальной C-prM, но может влиять на скорость процессинга, поскольку рассчитанное вероятное расщепление в штаммах Sfd значительно ниже, чем в патогенных. штаммы (Рисунок S8).Наиболее значительное снижение значений оценки сайта расщепления наблюдалось для гипотетического варианта, имеющего делецию в положении 111, но не содержащего компенсаторную замену D100N (Таблица S1).

Кроме того, мы наблюдали две специфические замены (Q32R и K69R) в капсидном белке штаммов Sfd, которые могут влиять на плотность упаковки капсидного белка (рис. S9), но вряд ли они окажут значительное влияние на патогенность штаммов. Другая замена, K64N, которая была обнаружена не только во всех штаммах Sfd, но и в шести штаммах кластера III на филогенетическом дереве, также может считаться не влияющей на патогенность штамма.

Другие структурные белки prM и E оба содержат специфические замены (A151V и V463A, соответственно), которые расположены в трансмембранных доменах и различаются между штаммами Efd и Sfd (Таблица 1). Эти аминокислотные замены консервативны и не оказывают значительного влияния на конформацию белков (рис. S10) или патогенность штаммов. Единичные случайные замены в белке prM находятся вне участков процессинга белка фурином; следовательно, они не важны для функции белка.В протеине E мы также обнаружили единичные консервативные аминокислотные замены и замены в четырех небольших группах штаммов Efd и Sfd (Рисунок S6). Эти замены могут влиять на иммуногенные свойства вируса, но они не коррелируют с патогенностью штаммов.

Таким образом, только один белок из группы структурных белков имел аминокислотные замены, которые коррелировали с группами Efd и Sfd и могли влиять на патогенность штаммов. Замены в трансмембранном домене капсидного белка могут влиять на патогенность штамма на стадии почкования за счет образования бескапсидных субвирусных частиц.Структурные белки prM и E не имели замен, которые могли повлиять на патогенность анализируемых штаммов; поэтому прикрепление вирусных частиц к клеткам или проникновение вируса в клетки, вероятно, не будет существенно влиять на патогенность вирусных штаммов.

Неструктурный белок NS1 представляет собой высококонсервативный гликопротеин с 12 инвариантными остатками цистеина. В отличие от других неструктурных белков, NS1 секретируется и накапливается в сыворотке инфицированных субъектов [62].В инфицированной клетке NS1 служит кофактором для репликации вирусной РНК ([63] и ссылки там) и существует в виде димера [64], [65]. Секретируемый NS1 образует олигомерные состояния, вплоть до уровня гексамера [66], и участвует в активации комплемента [67], генерации аутоиммунных антител и разрушении эндотелиальных клеток [68]; однако точная функция секретируемого NS1 неясна [69]. В белке NS1 проанализированных штаммов мы обнаружили несколько одиночных аминокислотных замен и замен в двух небольших группах штаммов Efd и Sfd, которые не коррелировали с изменениями патогенности.Мы также обнаружили ключевую замену, S141G, которая, очевидно, различалась между группами штаммов с различной патогенностью (рисунок S6). Нет данных о влиянии этой аминокислоты на свойства белка NS1; следовательно, мы не можем оценить роль этой замены в патогенезе ВКЭ.

Неструктурный белок NS2A представляет собой небольшой мембраносвязанный белок, который участвует в репликации РНК, связываясь с 3′-UTR с белками репликативного комплекса [70].Кроме того, NS2A ингибирует индукцию клеточного альфа / бета-интерферона [71], [72], [73] и участвует в сборке вирусных частиц [74,74]. Исследуемые штаммы содержали в этом белке несколько аминокислотных замен, которые не коррелировали с изменением патогенности штаммов.

Неструктурный белок NS2B представляет собой небольшой мембраносвязанный белок, который образует комплекс с вирусным белком NS3, который обладает каталитической активностью протеазы. Замены в гидрофильной части белка влияют на каталитическую активность комплекса [75].Анализируемые штаммы Sfd имели замену (F108V), расположенную в трансмембранном домене (фиг. S10), которая не оказывала значительного влияния на конформацию белка и патогенность штаммов.

Неструктурный белок NS3 представляет собой растворимый белок массой 70 кДа с активностью протеазы, геликазы, NTPазы и 5′-концевой РНК-трифосфатазы [76], [77], [78]. N-концевые остатки были идентифицированы как домен сериновой протеиназы семейства трипсинов, содержащий остатки His-54, Asp-78 и Ser-138 в активном центре [79], [80].Штаммы Sfd обладали двумя ключевыми заменами, R16K и S45F в белке NS3, расположенном в протеазном домене, но вне активного центра. Молекулярно-динамическое моделирование показало, что изменения в конформации комплекса NS3 / NS2B в штаммах Sfd могут препятствовать образованию комплекса полипротеин / протеаза и снижать скорость гидролиза полипротеина [81] (Рисунок 4). Биологические свойства штамма Скотово-94 подтверждают эти расчеты. Патогенные свойства этого штамма снижены по сравнению с патогенными штаммами, так как штамм Скотово-94 вызывает лихорадочную форму заболевания.Этот штамм содержит 15 ключевых аминокислот, специфичных для патогенных штаммов, но не содержит замен R16K и S45F в белке NS3, специфичном для штаммов Sfd (Таблица 1). Возможно, что штамм Скотово-94 вызвал лихорадочное заболевание из-за наличия этих замен в протеазе. Скотово-94 имеет пониженную патогенность; однако это снижение менее значимо, чем у типичных штаммов Sfd.

Рисунок 4. Третичные структуры РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp).

(A) Третичная структура RdRp для патогенного штамма Дальнегорск. (B) Третичная структура RdRp для штамма Sfd Приморье-270. В обеих моделях различные субдомены окрашены следующим образом: синий — пальцы, зеленый — ладонь и розовый — большой палец. Замены аминокислотных остатков в обеих моделях обозначены красными атомами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094946.g004

Неструктурный белок NS4A представляет собой мембранный белок с четырьмя трансмембранными доменами.Более того, C-концевой сайт, обозначенный как 2K-фрагмент, служит сигнальной последовательностью для транслокации белка NS4B в просвет эндоплазматического ретикулума ([82], [83] и ссылки в них). Исследуемые штаммы имели несколько незначительных мутаций, которые не коррелировали с патогенностью.

NS4B является крупнейшим из малых гидрофобных белков вируса и имеет 252 аминокислоты и 5 гидрофобных областей с четырьмя трансмембранными доменами (рис. S10). NS4B, как известно, взаимодействует с геликазным доменом NS3 [84] и может служить антагонистом интерферона ([85]; см. Обзор [86]).Штаммы Sfd обладали тремя ключевыми заменами в NS4B, две из которых, M95V и V179A, расположены в трансмембранных доменах 2 и 3, в то время как замена A213V расположена в гидрофильной области между трансмембранными доменами 3 и 4 (Рисунок S10). Функции этих замен неизвестны, поэтому неясно, влияют ли они на патогенность этих штаммов.

Белок NS5 является самым крупным (900 аминокислотных остатков) и наиболее консервативным среди флавивирусов. Он обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной и метилтрансферазной активностями [86], [87], [88].Недавно сообщалось, что NS5 ингибирует продукцию интерферона [89], [90], [91], [92].

Белок NS5 штаммов Sfd содержал ключевые замены S634T, R677K, I692V и A724S, которые могут влиять на патогенность ВКЭ. Эти замены расположены в домене РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) NS5 (Рисунок 5, Рисунок S11). Замена A724S расположена в мотиве E РНК-зависимой полимеразы, рядом с важным функциональным доменом, который отвечает за связывание ионов цинка (Zn ² ) [36], в то время как другие три замены, S634T, R677K и I693V , сохраняются.Замена I692V расположена в консервативном домене флавивируса LNDMAKTRKDI, как и в вирусе Повассан, который не является патогенным для человека. Другие аминокислотные замены были расположены вне консервативных доменов на ладони NS5 и были геометрически аппроксимированы (рис. 5). Комбинация нескольких замен может влиять на активность полимеразы и может влиять на патогенность штаммов. Ключевые замены, обнаруженные в настоящем исследовании, вероятно, влияют на ингибирование стимулированной интерфероном передачи сигналов JAK-STAT, поскольку домен ингибирования JAK-STAT расположен между остатками 355 и 735 в домене RdRP [93].

Аминокислотные замены в белке NS5 могут влиять на нейровирулентность штаммов не только за счет изменения эффективности репликации вирусной РНК или ингибирования продукции интерферона, но также через взаимодействие с некоторыми клеточными белками, которые могут влиять на патогенные свойства ВКЭ. Так, в недавно опубликованной статье [94] на основе замены участков генома штамма OHFV на гомологичные участки ВКЭ указано, что наибольшее влияние (89,9%) на проявление неврологического заболевания у мышей оказывают гибридные штаммы, содержащие участок генома, кодирующий белок NS5 ВКЭ.Область, кодирующая белок NS3, влияет в меньшей степени (45,5%) [94]. Более того, было показано, что C-концевой участок белка, включающий замену 4 аминокислот 879RYS881 и 891E, характерен для OHFV; 879KFK881 и 891D, характерные для ВКЭ, имеют наибольшее влияние на нейровирулентность у мышей. Авторы предположили, что KFK-D мотив TBEV влияет на рост аксонов [94]. Примечательно, что замена сайта (нуклеотиды 9488–10295 или аминокислотные остатки 608–877) значительно снизила вирулентность, поскольку у большинства инфицированных мышей не было никаких признаков заболевания.

Все проанализированные штаммы ВКЭ содержали мотивы KFK-D в белке NS5 (за исключением нескольких штаммов, имеющих замены K / R) и вызывали неврологические заболевания у белых мышей, но имели различную нейровирулентность для людей. Эти факты подтверждают наши предыдущие данные об отсутствии однозначной корреляции между нейровирулентностью штаммов у мышей и человека [25]. Замены ключевых аминокислот, которые различаются у штаммов Efd и Sfd (а.о. 634–724), расположены в средней части белка NS5.Они могут снизить вирулентность за счет влияния на эффективность репликации [94]. Эти данные позволяют сделать вывод о возможном влиянии ключевых замен в белке NS5 на тяжесть заболевания, несмотря на отсутствие однозначной корреляции между нейровирулентностью штаммов TBEV у мышей и людей, а также то, что спектр аминокислотных замен может варьироваться. Также необходимо указать, каким образом белок NS3 может влиять на развитие неврологических симптомов.

Исключения

Мы показали, что положение штамма на филогенетическом дереве и наличие определенных ключевых аминокислотных замен хорошо коррелируют с патогенностью штаммов ВКЭ.Как правило, штаммы кластера I выделяли от лиц с субклиническим течением заболевания, а штаммы кластера II и III вызывали тяжелую летальную форму энцефалита. Однако из этого правила было несколько исключений, некоторые из которых можно объяснить более детальным изучением.

Самыми строгими исключениями из этого правила являются штаммы Primorje-86 и Primorje-90, которые являются штаммами Sfd на основании их молекулярных характеристик, но были изолированы от людей, которым в 1986 и 1990 годах был поставлен посмертный диагноз «энцефалит».У нас нет возможности объяснить это несоответствие, кроме предположений о неточности диагноза или наличии тяжелого иммунодефицита или других сопутствующих заболеваний, которые могут вызвать неблагоприятный исход на фоне инфицирования штаммами Sfd TBEV.

Штаммы «Приморье-52» и «Приморье-739» вызвали субклиническую форму заболевания, несмотря на то, что они расположены во II и III кластерах филогенетического дерева и содержат ключевые аминокислоты, специфичные для патогенных штаммов Efd.Причиной этого несоответствия может быть наличие самой длинной делеции в 3′-UTR, включая весь основной элемент, что препятствует эффективному размножению вируса в клетках человека. Таким образом, это исключение подтверждает наше предположение о том, что удаление самого длинного фрагмента в 3 ‘UTR может значительно снизить патогенность штаммов ВКЭ.

Другим исключением являются штаммы, вызывающие лихорадочную форму заболевания, которая приводит к выздоровлению пациентов и может рассматриваться как ослабленная форма энцефалита.Штамм Шкотово образует отдельную ветвь филогенетического древа между штаммами Efd и Sfd и отличается от штаммов Efd наличием в вирусной протеазе NS3 ключевых аминокислот 16K и 45F, характерных для штаммов Sfd. Это указывает на то, что замены 16K и 45F в вирусной протеазе NS3 могут снизить патогенность этих штаммов.

Штамм Ffd Primorye-94 имел замену V179A в NS4B, которая специфична для штаммов Sfd, но ее роль в снижении патогенности штаммов неизвестна.Кроме того, этот штамм имеет множество других уникальных аминокислотных замен: V141I в протеине E, K47R в протеине NS1, L69F, M161I и R228K в NS2B, A68V и L143I в NS3 и A92V в NS4A. Вероятно, что комбинация этого набора замен снижает патогенность штамма, но прямых доказательств влияния этих изменений на патогенность нет.

Штаммы Приморье-82 и Кипарис-94 представляют собой штаммы Sfd, но с повышенной вирулентностью, так как они вызывают лихорадочную форму заболевания.Каждый штамм имеет несколько одиночных аминокислотных замен в разных сайтах полипротеина (Рисунок S6). В то же время оба штамма показали уникальную замену D809N, локализованную в домене большого пальца NS5. Необходимы дополнительные исследования с использованием методов обратной генетики для оценки роли замены D809N в изменении патогенности штаммов; это следует оценивать с помощью теста безопасности обезьян на нейровирулентность [95].

Материалы и методы

Заявление об этике

Эксперименты на мышах проводились в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных согласно Постановлению Минздрава СССР No.1189 от 10.10.1983 г. Эксперименты проводились согласно Правилам Минздрава СССР № 755 от 12.09.1977 и № 701 от 27.07.1978 по гуманному обращению с животными. Все экспериментальные методики одобрены и выполнены в соответствии с требованиями НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (г. Владивосток) по содержанию и использованию животных (протокол №1 от 30.01.2008).

Изоляция вируса

Выделение штаммов ВКЭ проводили, как описано ранее [25].Вкратце, для выделения штаммов Efd использовали материалы аутопсии (мозг) умерших пациентов, а для штаммов Sfd и Ffd для выделения вируса использовали свежую кровь из вены. Все штаммы были выделены внутримозговыми инъекциями двухдневным инбредным мышам, каждая из которых содержала 10 мкл 10% суспензии для биопробы. Мониторинг клинических проявлений инфекции осуществлялся путем ежедневного наблюдения за болезнью животных в течение 2–3 недель. В проход были включены мозги умерших мышей.

Экстракция РНК и получение кДНК

экстрагировали из 100 мкл 10% суспензии мозга или плазмы в PBS с использованием Trizol LS (Life Science, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Затем РНК осаждали, дважды промывали 1 мл 80% этанола и сушили на воздухе в течение 5 мин. Осадок РНК ресуспендировали в 50 мкл свежей воды Milli-Q и как можно скорее использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскриптазы. Чтобы получить кДНК обратной транскрипцией, смесь 5 мкл РНК, 50 пМ гексануклеотидных праймеров, 200 мМ каждого NTP, 5 мМ MgCl ₂ , 200 ед. MMLV RT (Promega, Madison, WI) и Milli-Q воду (до 50 мкл) инкубировали при 42 ° C в течение 30 мин.Образцы кДНК для транспортировки смешивали с равными объемами изопропанола и хранили в виде суспензии.

Усиление

пары олигонуклеотидных праймеров для амплификации были разработаны на основе ранее опубликованных последовательностей для штаммов Sofjin, Senzhang, 205, Glubinnoe и Aina и оптимизированы для создания 38 перекрывающихся фрагментов для смысловых и антисмысловых штаммов со средней длиной около 1000 пар оснований (Таблица S2 ). Для усиления каждого фрагмента смесь 0.5 мкл кДНК, 50 пМ соответствующих смысловых и антисмысловых праймеров для ПЦР, 25 мкл 2 × PCR Mix (Fermentas, Литва) и свежая вода Milli-Q (до общего объема 50 мкл) инкубировали при 95 ° C. в течение 1 мин, а затем использовали в реакции секвенирования цикла (25 циклов 96 ° C в течение 5 секунд, 57 ° C в течение 5 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд). Ампликоны анализировали электрофорезом в 1 × ТАЕ буфере на 0,75% агарозном геле (Promega, США). Полосы вырезали из геля под УФ-трансиллюминатором, и ДНК элюировали из геля методом замораживания-оттаивания [96].Количество элюированной ДНК анализировали с помощью Nano View (GE Healthcare, США).

Секвенирование фрагментов ПЦР

Для каждой реакции секвенирования приблизительно от 50 до 100 нг очищенной дцДНК смешивали с 3,2 пмоль одного из праймеров и с реакционной смесью, содержащей четыре меченных красителем дидезоксинуклеотидных терминатора (BigDye V 3.1, Life Science, США). Используемые параметры секвенирования цикла были такими, как описано в протоколе производителя (25 циклов при 96 ° C в течение 30 с, 50 ​​° C в течение 60 с и 60 ° C в течение 4 минут).Продукты реакции осаждали этанол-ацетатом, как описано в рекомендациях производителя. Осадок ресуспендировали в 16 мкл реагента для подавления темплатов, нагревали в течение 2 минут при 95 ° C и хранили на льду до загрузки в секвенатор Applied Biosystems Prism 3100.

Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности

Перекрывающиеся последовательности нуклеиновых кислот объединяли для анализа и редактировали с помощью пакета программ ( BioEdit v.7.2.0 редактор выравнивания последовательностей) (http: // www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html). Нуклеотидная последовательность была переведена в аминокислотную последовательность онлайн на портале ресурсов по биоинформатике (http://web.expasy.org/translate/). Нуклеотидные и транслированные аминокислотные последовательности штаммов были депонированы в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) под номерами доступа, указанными в таблице 2.

полных геномов TBEV и предсказанные аминокислотные последовательности сравнивали онлайн на mafft.cbrc.jp/alignment server / программой MAFFT версии 7 со штаммом Sofjin-HO в качестве прототипа вируса TBE.

Филогенетические анализы

Филогенетический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полных геномов анализируемых штаммов вирусов и ранее сообщенных последовательностей генома штаммов ВКЭ дальневосточных подтипов (Sofjin — AB062064, Oshima 5-10 — AB062063, Глубинное — DQ862460 и Senzhang — AY182009), штамм Васильченко в качестве штамма-прототипа сибирского подтипа и Neudoerfl в качестве штамма-прототипа западного подтипа проводили с использованием метода максимального правдоподобия (ML).Филогенетическое дерево оценивали с использованием метода ML TreeFinder [97]. Наиболее подходящая эволюционная модель была определена с использованием jModelTest версии 0.1 [98], и была General Time Reversible (GTR) с моделью гамма-распределения гетерогенности скорости между сайтами и долей инвариантных сайтов (GTR + C + I). Предполагаемые деревья были визуализированы с помощью онлайн-версии FigTree 1.12 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)

Скорости синонимичных (dS) и несинонимичных (dN) замен были рассчитаны с помощью CodeML в пакете PAML [99], [100]

Анализ вторичной структуры UTR

для UTR вирусной РНК было выполнено с использованием программы mfold, доступной по адресу http: // mfold.rna.albany.edu [101]. РНК-гибриды из первых 240 нуклеотидов, включая 5′-UTR, часть гена капсидного белка и полноразмерную 3′-UTR, использовали для предсказания мотивов вторичной структуры и идентификации возможных мотивов циклизации в РНК. Анализ вторичной структуры возможных мотивов циклизации был выполнен для всех 34 последовательностей TBEV.

Гомологическое моделирование

Третичные структуры протеазы TBEV NS2B-NS3, капсидного протеина C и RdRP для штаммов Дальнегорск и Приморье-270 моделировались программой Nest пакета Jackal [105], [106].

протеаза NS2B / NS3

Кристаллическая структура протеазы Западного Нила (код PDB 3e90) была взята в качестве шаблона для моделирования гомологии, поскольку эта модель имеет высокое разрешение (2,45 Å), а идентичность последовательностей между мишенью и шаблоном превышает 25% [107 ].

Капсидный белок C

Кристаллическая структура капсидного протеина C вируса Западного Нила подтипа Kunjin (код PDB 1sfk) была взята в качестве шаблона для моделирования гомологии [108].

RdRP

Кристаллическая структура каталитического домена РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса денге (RdRP) с разрешением 1.85 Å (код PDB 2j7u) был выбран в качестве шаблона [109].

Моделирование молекулярной динамики

Моделирование молекулярной динамики (МД) проводилось с использованием программного обеспечения Amber версии 11. Силовое поле Amber 99 применялось к комплексам [110]. Каждый белковый комплекс гидратировался на 9 Å по модели воды с простой точкой заряда [111], применяя триклинный периодический ящик с пороговой точкой 8 Å для суммирования несвязанных взаимодействий в реальном пространстве. Противоионы, Na + или Cl-, были добавлены путем замены молекул воды в каждой системе, чтобы нейтрализовать систему.Впоследствии было применено 1000 итераций, чтобы минимизировать энергию системы. Положение атомов основной цепи было ограничено в течение первых 100 пс с силовой константой 2,0 ккал / Å ² , чтобы позволить регулирование молекул растворителя. После этого было выполнено моделирование свободной молекулярной динамики с использованием ансамбля NPT (изотермино-изобарический) с шагом по времени 2 фс. Температура поддерживалась постоянной на уровне 300 К. Схема управления давлением Берендсена использовалась для поддержания давления около 1 бара во время моделирования с временем релаксации 2 пс и параметром сжимаемости по умолчанию для воды, равным 44.6 × 10 ⁻⁶ бар ⁻¹ . Система считалась уравновешенной через 1 нс. МД-моделирование без ограничений проводили в течение 20 нс для обоих комплексов NS2b / NS3, в течение 5 нс для обоих комплексов капсидного протеина С и в течение 5 нс для обоих комплексов RdRP.

Российская делегация покинула конференц-зал Парламентской ассамблеи ОБСЕ

«Русский Делегация больше не будет присутствовать на сессии ПА ОБСЕ в Вене.Ассамблея включила в повестку дня еще одно вопиющее антироссийское заявление. предсказуемо инициирован нашими сердитыми соседями из Украины. Постановление нарушено регламента, так как для принятия документа необходимо 2/3 голосов всех депутатов Собрания, а не тех парламентариев, которые в данный момент находились в зале », — подчеркнул Петр Толстой. Толстой
Петр Олегович .

Он добавил, что «Любое заявление, нарушающее правила, не имеет юридической силы. Не будет во внимание и даже не будет обсуждаться ».

Петр Толстой напомнил еще один прецедент, когда экс-председатель Ассамблеи Георгий Церетели грубо нарушил правила. Российские парламентарии тоже тогда вышел из конференц-зала.

«На этот раз там также не повод продолжать нашу работу на заседании организации, игнорирующей правила процедуры и здравый смысл », — сказал заместитель Председателя ГД.

Ситуация вокруг Беларуси

«Мы протестуем против этого. форум возмездия, который ПА ОБСЕ начала против Беларуси. ПА ОБСЕ участники обсуждают ситуацию в Беларуси, а представители этого государства не были допущены к участию в заседании, так как было принято решение об отказе в выдаче визы по запросу Польши. «Обвиняемым» не была предоставлена ​​возможность выступить участники пленарного заседания, с которого начался этот отвратительный политизированный процесс, им даже нельзя говорить что-то дистанционно », — сказал Петр Толстой.

Он сказал, что «Такая ситуация только подрывает доверие к этой крупной международной организации, и делает свои решения незаконными ».

Ранее зампред ГД называл решение не допускать представителя Беларуси к участию Сессия ПА ОБСЕ «беспрецедентный скандал».

EMA обзор регданвимаба для COVID-19 в поддержку национальных решений о раннем использовании

EMA проводит обзор моноклонального антитела Регданвимаб (CT-P59) компании Celltrion для поддержки национальных властей, которые могут принять решение об использовании этого лекарства от COVID-19 до получения разрешения.

Этот обзор дополняет текущий непрерывный обзор регданвимаба для лечения подтвержденного COVID-19 у пациентов, которым не требуется дополнительная кислородная терапия и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19 и / или госпитализации.

Комитет по лекарствам для человека (CHMP) EMA рассмотрит данные о том, насколько хорошо это лекарство предотвращает развитие COVID-19 в тяжелой форме или сокращает количество госпитализаций и госпитализаций в отделения интенсивной терапии.

Несмотря на то, что перед возможной подачей заявки на получение регистрационного удостоверения продолжается более всеобъемлющий непрерывный обзор, эта процедура предоставит национальным властям общее мнение экспертов ЕС, которые могут принять основанные на фактах решения о раннем использовании лекарства, например.грамм. в программах сострадательного использования.

EMA сообщит о результатах проверки после ее завершения.

Подробнее о лекарстве

Регданвимаб — моноклональное антитело с активностью против COVID-19. Моноклональные антитела — это тип белка, который был разработан для прикрепления к определенной структуре (называемой антигеном). Регданвимаб был разработан для присоединения к шиповому белку SARS-CoV-2, вируса, вызывающего COVID-19. Когда он прикрепляется к белку-шипу, способность вируса проникать в клетки организма снижается.Ожидается, что это снизит потребность в госпитализации пациентов с COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести.

Подробнее о процедуре

Исполнительный директор EMA запросил пересмотр в соответствии со статьей 5 (3) Регламента 726/2004 после предварительных обсуждений с целевой группой EMA по пандемии COVID-19 (COVID-ETF), которая объединяет экспертов со всей Европы. сеть регулирования лекарственных средств.

Обзор проводится Комитетом EMA по лекарственным средствам для человека (CHMP), который отвечает за вопросы, касающиеся лекарств для человека.Комитет предоставит научное заключение в кратчайшие сроки.

Обзор проводится параллельно с непрерывным обзором перед возможной подачей заявки на разрешение, если данных об эффективности, безопасности и качестве достаточно.