Санпин 3472: Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 07.06.2017 N 83 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 3.5.2.3472-17 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и проведению дезинсекционных мероприятий в борьбе с членистоногими, имеющими эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение» (вместе с «СанПиН 3.5.2.3472-17. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы…») (Зарегистрировано в Минюсте России 27.09.2017 N 48345)

Разное

Содержание

О введении в действие СанПиН 3.5.2.3472-17

Управление Роспотребнадзора по Кировской области информирует, в соответствии с введенными в действие с 9 октября 2017 года санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 3.5.2.3472-17 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и проведению дезинсекционных мероприятий в борьбе с членистоногими, имеющими эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение» (далее СанПиН 3.5.2.3472-17),  органы исполнительной власти субъектов Российской Федерации, органы местного самоуправления, а также организации и ИП должны обеспечивать организацию и проведение дезинсекционных мероприятий по уничтожению и (или) снижению численности, созданию неблагоприятной среды обитания для членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение. В приложениях СанПиН 3.5.2.3472-17  приведен перечень членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение и требования к проведению дезинсекции в отношении отдельных видов членистоногих.

 

Новыми правилами установлено, что дезинсекция в обязательном порядке должна проводиться в производственных, жилых и общественных зданиях, помещениях, сооружениях, на транспорте, на территориях городских и сельских поселений, прилегающих к ним участках открытой природы. Борьба с насекомыми должна вестись непосредственно в зоне природных очагов заражения, т.е. в лесах, на искусственно озеленённых территориях и др. участках открытой природы.

Дезинсекционные работы должны затронуть все дикие и искусственные водоемы, т.е. места естественного обитания насекомых, а также пройти в очагах инфекционных болезней, где имеются все условия для возникновения, поддержания или распространения возбудителей заболеваний.

Соблюдение санитарных правил является обязательным для граждан, индивидуальных предпринимателей и юридических лиц.

Юридические лица и индивидуальные предприниматели должны обеспечивать предварительные санитарно-эпидемиологические обследования объекта с целью определения наличия членистоногих и их видов, которые планово должны проводиться  не менее 2 раз в месяц; в местах общего пользования многоквартирных домов и общежитий – 1 раз в месяц.

Обследования, а так же выполнение дезинсекции на объектах проводится обученным персоналом по вопросам дезинфектологии или организациями, имеющими лицензию на медицинскую деятельность,

Организациями, осуществляющими проектирование объектов, их строительство, ремонт и реконструкцию, а так же компаниям, которые проводят инженерно-строительные, санитарно-технические и санитарно-гигиенические мероприятия, необходимо исключить возможность доступа синантропных членистоногих в эти строения, к пище и воде, а также необходимо провести комплекс мероприятий препятствующих расселению болезнетворных вредителей.

Граждане имеют право самостоятельно осуществлять дезинсекцию собственных жилых помещений, в том числе садовых домиков, надворных построек, дворовых территорий дезинсекционными средствами, разрешенными для применения гражданами в быту.

Дезинсекция по СанПиН 3.5.2.3472-17

В санитарных правилах СанПиН 3.5.2.3472-17 прописаны основные требования к проведению мероприятий по дезинсекции.  Дезинсекция – это комплекс мероприятий по уничтожению насекомых, имеющих санитарно-гигиеническое значение. К ним относятся тараканы, клопы, муравьи, блохи, клещи, осы, шершни, мухи, огневки, комары и другие.

Методы истребительной дезинсекции
Метод Описание Возможные риски применения
Физический Липкие поверхности и приманки, ловушки, пылесос, температурное воздействие, ультрафиолет. Метод эффективен только в отношении взрослых особей.
Биологический Борьба с насекомыми-вредителями при помощи их природных врагов. Рыбы-ларвифаги (гамбузия, малек белого амура, верховка), бактерии, грибы, вирусы, нематоды. Практическое применение разработок по использованию паразитов экономически не оправдано. Не выдерживает конкуренции с химическим методом.
Генетический Выведение бесплодных особей насекомых. Массовая стерилизация и выпуск бесплодных самцов в естественную среду обитания – очень дорогостоящий и сложный процесс.
Химический
Долгое время остается самым популярным методом  дезинсекции. Получил название благодаря использованию химических веществ.
В открытой продаже находится огромное количество препаратов низкого качества.

 

На рынке дезинсекции работают компании-однодневки и недобросовестные дезинфекторы, называющие себя профессионалами.

Классификации инсектицидов

С учетом стадии жизненного цикла насекомых, против которых используется препарат

По способу попадания в организм насекомых

  • Контактные  –  попадают в организм через кожные покровы
  • Кишечные – попадают через органы пищеварения
  • Фумигантные – попадают через органы дыхания
  • Системные  — через кровь человека или животного

ГОСТ 12.1.007-76 выделяет 4 группы опасности инсектицидов

Класс опасности Особенности применения
Чрезвычайно опасные (особо токсичные) Нельзя применять в медицинской дезинсекции
Высокоопасные (высокотоксичные) Нельзя применять в быту, детских учреждениях, больницах, заведениях общественного питания
Умеренно опасные (среднетоксичные) Можно применять в помещениях любого назначения  только обученным персоналом
Малоопасные (малотоксичные) Используются без ограничения

К объектам, на которых должны проводиться мероприятия по дезинсекции, относятся:
  • Объекты для постоянного проживания и временного пребывания людей: многоквартирные дома, частные владения, общежития, отели, гостиницы, хостелы

  • Спортивные, культурные учреждения и другие места общественного пользования

  • Оздоровительные учреждения: санатории, курорты, базы отдыха, детские лагеря

  • Образовательные учреждения: сады, школы, учреждения дополнительного образования, училища, техникумы,  институты

  • Предприятия пищевой и перерабатывающей промышленности

  • Заведения общественного питания: столовые, кафе, бары, буфеты, рестораны, пиццерии, закусочные

  • Торговые предприятия: магазины, склады

  • Предприятия промышленности

Контроль эффективности мероприятий по дезинсекции

Как часто необходимо проводить контроль эффективности?
Класс опасности Особенности применения
Чрезвычайно опасные (особо токсичные) Нельзя применять в медицинской дезинсекции
Высокоопасные (высокотоксичные) Нельзя применять в быту, детских учреждениях, больницах, заведениях общественного питания
Умеренно опасные (среднетоксичные) Можно применять в помещениях любого назначения  только обученным персоналом
Малоопасные (малотоксичные) Используются без ограничения

Когда объект считается освобожденным от насекомых?

При обработке от мух, клопов, бабочниц  — в помещениях не зарегистрирована численность насекомых более 1 месяца;

При обработке от тараканов, блох, клещей — в помещениях не зарегистрирована численность насекомых более 2 месяцев;

При обработке от муравьев — в помещениях не зарегистрирована численность насекомых более 3 месяцев.

Услуги дезинсекции от службы «ЭКО СЭС»

Наша служба работает в полном соответствии с действующим санитарным законодательством. Услуги дезинсекции включают в себя:

  • предварительная оценка степени заселенности объекта и выбор тактики проведения мероприятий по дезинсекции;
  • проведение профилактических либо истребительных работ с использованием лицензированных препаратов и оборудования;
  • составление рекомендаций по дальнейшей защите объекта;
  • выполнение гарантийных обязательств;
  • консультирование и дальнейшее сопровождение.
Смотреть видео отзывы Читать отзывы

О введении в действие СанПиН 3.5.2.3472-17 – Орловский район

Уважаемые руководители и индивидуальные предприниматели!

Управление Роспотребнадзора по Кировской области информирует, в соответствии с введенными в действие с 9 октября 2017 года санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 3.5.2.3472-17 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и проведению дезинсекционных мероприятий в борьбе с членистоногими, имеющими эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение» (далее СанПиН 3.5.2.3472-17), органы исполнительной власти субъектов Российской Федерации, органы местного самоуправления, а также организации и ИП должны обеспечивать организацию и проведение дезинсекционных мероприятий по уничтожению и (или) снижению численности, созданию неблагоприятной среды обитания для членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение. В приложениях СанПиН 3.5.2.3472-17 приведен перечень членистоногих, имеющих эпидемиологическое и санитарно-гигиеническое значение и требования к проведению дезинсекции в отношении отдельных видов членистоногих.

Новыми правилами установлено, что дезинсекция в обязательном порядке должна проводиться в производственных, жилых и общественных зданиях, помещениях, сооружениях, на транспорте, на территориях городских и сельских поселений, прилегающих к ним участках открытой природы. Борьба с насекомыми должна вестись непосредственно в зоне природных очагов заражения, т.е. в лесах, на искусственно озеленённых территориях и др. участках открытой природы.

Дезинсекционные работы должны затронуть все дикие и искусственные водоемы, т.е. места естественного обитания насекомых, а также пройти в очагах инфекционных болезней, где имеются все условия для возникновения, поддержания или распространения возбудителей заболеваний.

Соблюдение санитарных правил является обязательным для граждан, индивидуальных предпринимателей и юридических лиц.

Юридические лица и индивидуальные предприниматели должны обеспечивать предварительные санитарно-эпидемиологические обследования объекта с целью определения наличия членистоногих и их видов, которые планово должны проводиться не менее 2 раз в месяц; в местах общего пользования многоквартирных домов и общежитий – 1 раз в месяц.

Обследования, а так же выполнение дезинсекции на объектах проводится обученным персоналом по вопросам дезинфектологии или организациями, имеющими лицензию на медицинскую деятельность,

Организациями, осуществляющими проектирование объектов, их строительство, ремонт и реконструкцию, а так же компаниям, которые проводят инженерно­строительные, санитарно-технические и санитарно-гигиенические мероприятия, необходимо исключить возможность доступа синантропных членистоногих в эти строения, к пище и воде, а также необходимо провести комплекс мероприятий препятствующих расселению болезнетворных вредителей.

Граждане имеют право самостоятельно осуществлять дезинсекцию собственных жилых помещений, в том числе садовых домиков, надворных построек, дворовых территорий дезинсекционными средствами, разрешенными для применения гражданами в быту.

 

Приложение:  СанПиН 3.5.2.3472-17

 

Санитарно-гигиенических показателей условий труда и показателей здоровья рабочих шелкопрядильного производства

Кобылова Г.А.

Бухарский государственный медицинский институт, Бухара, Узбекистан

Для корреспонденции: Кобылова Г. А., Бухарский государственный медицинский институт, Бухара, Узбекистан.

© 2020 Автор (ы). Опубликовано Scientific & Academic Publishing.

Эта работа находится под лицензией Creative Commons Attribution International License (CC BY).
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Аннотация

В статье предлагаются санитарно-гигиенические показатели и состояние здоровья рабочих шелкопрядильного производства Bukhara Brilliant Silk и способы улучшения здоровья рабочих на этом производстве.Изучить санитарно-гигиенические показатели и состояние здоровья рабочих шелкопрядильного производства Bukhara Brilliant Silk и влияние вредных факторов на здоровье рабочих этого производства.

Ключевые слова: Шелкопрядильная продукция, Влажность, Освещение, Медицинское обследование, Группы здоровья

Цитируйте эту статью: Кобылова Г.A., Санитарно-гигиенические показатели условий труда и показатели здоровья рабочих на шелкопрядильном производстве, Американский журнал медицины и медицинских наук , Vol. 10 No. 11, 2020, pp. 842-847. DOI: 10.5923 / j.ajmms.20201011.03.

1. Введение

Шелководство в Узбекистане — одна из древнейших отраслей сельского хозяйства. Он предоставляет текстильное сырье — шелковую нить, которая высоко ценится благодаря особым качествам, определяющим тенденции использования шелка в быту и технике.Узбекистан, производящий около 67% коконов, собираемых в стране, занимает четвертое место в мире по производству после Китая, Индии и Японии. В настоящее время происходит переход от рыночных отношений, совершенствуются формы производства в сельском хозяйстве, в том числе в шелководстве. В шелковой промышленности страны были проведены масштабные структурные преобразования, направленные на дальнейшее углубление экономических реформ, создание благоприятных условий для привлечения иностранных инвестиций, создание новых и модернизацию существующих производств, увеличение объемов и расширение номенклатуры готовой продукции. востребована и конкурентоспособна на мировом рынке.
Одной из основных задач медицины является охрана здоровья работников, работающих с вредными факторами, снижение заболеваний, приводящих к временной потере или длительной нетрудоспособности. Охрана здоровья работников — по значимости и решению важнейшая социально-гигиеническая проблема. В основном это имеет социально-экономическое значение, потому что на основе здоровых и способных работников повышается работоспособность общества. Профессиональные заболевания развиваются под воздействием вредных факторов, которые формируются у опытных рабочих в наиболее благополучном, активно трудоспособном возрасте.
Первичные и периодические медицинские осмотры проводятся на основании приказа Министерства здравоохранения Республики Узбекистан № 200 от 10 июля 2012 года. Ответственность за качество их проведения, раннее выявление профессиональных заболеваний несет руководитель соответствующего предприятия. Изучение санитарно-гигиенических показателей и состояния здоровья рабочих шелкопрядильного производства «Бухарский бриллиант шелк» и влияния вредных факторов на здоровье рабочих этого производства.

2. Материалы и методы исследования

Методологической основой исследования является материалистический подход к изучению проблемы, а также Указы Президента Республики Узбекистан, постановления Правительства об улучшении материального и материального благосостояния. льготы, а также другие положения и инструкции по экономическим вопросам развития шелководства.
Для изучения санитарно-гигиенических показателей использовались санитарно-гигиенические исследования, в результате которых были получены следующие показатели.
Таблица 1. Показатели температурных данных цехов шелкопрядильного производства «Бухара Бриллиант Шелк»
На основании СанПин 0324-16 «Санитарно-гигиенические нормативы микроклимата производственных помещений. ”, Температура воздуха на рабочих местах измерялась в теплое время года над машиной, в 1 м ближе к машине и в 10 м от машины. По результатам измерений были получены следующие данные: в сортировочном цехе до работы, во время работы и после работы температура в производственных помещениях составляла от 22 ° С.От 5 до 24,5 ° С, так как оптимальная температура этих помещений по СанПин 0324-16 допускается 22-24 ° С, а на постоянных рабочих местах допустима верхняя граница до 29 ° С. В перемоточном цехе эти данные составляли от 24,2 до 25,7 ° C. В цехе наматывания коконов температура в помещении составляла от 22,7 до 25,5 ° С. В цехе промывки коконов, красящем цехе и цехах обработки комнатная температура на постоянных рабочих местах от 31 до 37,2 ° С. Наибольшее повышение температуры рабочих мест наблюдалось в цехе мойки коконов с 36 до 37 ° C.
Таблица 2. Показатели влажности этих цехов шелкопрядильного производства в Бухаре Brilliant Silk
На основании СанПин 0324-16 «Санитарно-гигиенические нормативы микроклимата производственных помещений. ”, Измерения относительной влажности воздуха рабочих мест в теплое время года проводились над машиной, в 1 м ближе к машине и в 10 м от машины. По результатам измерений были получены следующие данные: в сортировочном цехе до работы, во время работы и после работы температура в производственных помещениях составляла от 51 до 54.5%, так как оптимальная влажность этих помещений по СанПин 0324-16 допускается 40-60%, а на постоянных рабочих местах допустима верхняя граница до 45%. В перемоточном цехе эти показатели составили от 51,7 до 53,7%. В цехе намотки коконов влажность помещений колебалась от 55,7 до 65,2%, наибольшая влажность наблюдалась при работе на станке — 65,2%. В цехе мойки коконов эти данные доходили от 70 до 87%, что наблюдалось во все периоды работы, в цехе окраски и цехах обработки влажность помещений на постоянных рабочих местах составляет от 70 до 73%, что свидетельствует о высокой влажности воздуха. повышение влажности воздуха во все периоды работы.
Таблица 3. Запыленность этих цехов шелкопрядного производства в «Бухарский бриллиант шелк»
На основании СанПин 12.1.005-88 замеры запыленности воздуха рабочих мест в теплое время года делали над станком, ближе 1 м к станку и 10 м от станка. По результатам измерений были получены следующие данные: в сортировочном цехе до работы, во время работы и после работы запыленность производственных помещений колебалась от 0.От 6 до 4,4 мг / м3, так как ПДК в этих помещениях по СанПин 12.1.005-88 допускается до 6 мг / м3. В перемоточном цехе эти данные составляли от 0,7 до 2,9 мг / м3. В цехе намотки коконов запыленность помещений составляла от 0,9 до 3,4 мг / м3. В цехе промывки коконов запыленность в рабочем помещении наблюдалась от 0,9 до 2,9 мг / м3. В красильном цехе эти данные составляли от 0,9 до 2,6 мг / м3. В цехе обработки запыленность помещений колебалась от 0.От 9 до 3,1 мг / м3.
Таблица 4. Показатели загазованности этих цехов шелкопрядильного производства в «Бухарском бриллиантовом шелке»
На основании СанПин 12.1.005-88 проведены измерения загрязнение воздуха на рабочих местах в теплое время года над машиной, на 1 м ближе к машине и в 10 м от машины. По результатам измерений были получены следующие данные: в сортировочном цехе до работы, во время работы и после работы запыленность производственных помещений колебалась от 0.От 77 до 4,05 мг / м3, так как ПДК газоносности этих помещений по СанПин 12.1.005-88 допускается до 20 мг / м3. В перемоточном цехе эти данные составляли от 0,89 до 5,82 мг / м3. В цехе намотки коконов газосодержание помещения составляло от 0,87 до 5,78 мг / м3. В цехе промывки коконов загазованность в рабочем помещении наблюдалась от 0,79 до 2,45 мг / м3. В красильном цехе эти данные колебались от 0,77 до 2,46 мг / м3. В цехе обработки загазованность помещений колебалась от 0.От 76 до 4,73 мг / м3.
Таблица 5. Показатели освещенности этих цехов в шелкопрядном производстве в «Бухарский бриллиант шелк»
На основании СанПин 2.01.05 «Естественное и искусственное освещение» произведены замеры освещения рабочих мест в теплое время года над станком, ближе 1 м к станку и 10 м от станка. По результатам измерений были получены следующие данные: в сортировочном цехе до работы, во время работы и после работы освещенность в производственных помещениях составляла от 215 до 302.5 лк, так как оптимальная освещенность этих помещений по СанПин 2.01.05 составляет 200 лк. В перемоточном цехе эти показатели составляли от 222,5 до 230 люкс. В цехе намотки коконов освещенность помещений составляла от 240 до 290 лк, в цехе мойки коконов эти данные доходили от 235 до 279 лк, в цехе окраски освещенность составляла от 240 до 285 лк, цеха обработки, освещенность помещений на рабочих местах от 222,5 до 275 лк …
Таблица 6. Шумовые показатели этих цехов шелкопрядильного производства в «Бухара Бриллиант Шелк»
На основании СанПин 0325-16 «Санитарные нормы допустимых уровней шума на рабочих местах» шум на рабочих местах измерялся в теплом помещении. сезон над машиной, на 1 м ближе к машине и в 10 м от машины. По результатам измерений получены следующие данные: в сортировочном цехе до работы, во время работы и после работы уровень шума в производственных помещениях достигает 55.7 дБ, так как на постоянных рабочих местах в производственных помещениях на территории предприятий допускается до 80 дБ согласно СанПин 0324516. В перемоточном цехе эти показатели достигаются до 66,7 дБ. В цехе намотки коконов эти данные достигаются до 60,7 дБ; в цехе мойки коконов эти данные достигаются до 59,25 дБ, в цехе окраски эти данные достигаются до 58,2 дБ в цехе обработки, эти данные достигаются до 67 дБ.
Применен метод непрерывного наблюдения путем прохождения периодического медицинского осмотра на основании приказа №200 пункт 4.8. Исходя из этого, работники данного производства 1 раз в 2 года должны были проходить периодический медицинский осмотр. Согласно плану, медицинскому освидетельствованию подверглись всего 200 сотрудников, из них 150 — женщины, медицинское обследование прошли 198 сотрудников, что составляет 99%, обследование прошли 148 женщин, что составляет 98,6%. На основании приказа № 200 подлежащие периодическому медицинскому осмотру должны были пройти четыре специалиста — терапевт, офтальмолог, дерматовенеролог и ториноларинголог.Также этим работникам предстояло пройти рентгенологическое обследование и данные лейкоцитарного анализа крови. Известно, что врачи, работающие в территориальных лечебно-профилактических учреждениях, не являются врачами по профпатологии, это в основном врачи общей практики. Поэтому при периодических медицинских осмотрах допускаются многие недостатки, то есть специалисты, участвующие в этих медицинских осмотрах, не могут правильно оценить санитарно-гигиеническое состояние рабочего места. В результате они не могут глубоко проанализировать развивающиеся в организме профессиональные заболевания и определить факторы риска, приводящие к этим заболеваниям.Также не так широко используются лабораторные и инструментальные исследования при медицинских обследованиях. Исходя из изложенного, в качестве инновационной разработки к исследованию было применено прохождение работников данного предприятия через ультразвуковое исследование внутренних органов. Узкие специалисты вышеперечисленных специалистов Бухарского медицинского института на основании договора, заключенного между институтом и шелкопрядильным производством, а также медицинский персонал этого предприятия, начальник отдела гигиены труда г. В периодическом медицинском осмотре участвовали областной ЦГСЭН, участковый комитет этого предприятия и представитель предприятия.Также изучалась временная нетрудоспособность работников этого производства. Под инвалидностью следует понимать состояние, вызванное болезнью, травмой, ее последствиями или другими причинами, когда невозможно выполнять профессиональную работу полностью или частично, в течение ограниченного времени или постоянно. Временная нетрудоспособность — это состояние организма человека, вызванное болезнью, травмой и другими причинами, при котором функциональные расстройства сопровождаются невозможностью выполнения профессиональной работы в нормальных условиях труда в течение определенного периода времени, т.е.е. они обратимы. Установление факта временной нетрудоспособности — это лечебное мероприятие, так как оно направлено на устранение неблагоприятных факторов и означает начало лечения. При определении трудоспособности необходимо учитывать как медицинские, так и социальные критерии. Медицинские критерии включают своевременный полный клинический диагноз с учетом выраженности морфологических изменений, тяжести и характера заболевания, наличия декомпенсации и ее стадии, осложнений, определение клинического ближайшего и отдаленного прогноза.Социальные критерии отражают все, что связано с профессиональной деятельностью пациента: особенности преобладающего стресса (физического или нервно-психического), организацию, частоту и ритм работы, нагрузку на отдельные органы и системы, наличие неблагоприятных условий труда и производственной деятельности. опасности. Установление факта нетрудоспособности имеет большое юридическое значение, поскольку гарантирует гражданину соответствующие права: в случае временной нетрудоспособности на освобождение от работы и получение пособия за счет обязательного государственного социального страхования, а также в случае потери трудоспособности. , выйти на пенсию за счет средств пенсионного фонда Республики Узбекистан.Были изучены случаи временной нетрудоспособности работников данного предприятия за 2019 год и получены следующие данные: в 2019 году выявлено 55 случаев временной нетрудоспособности. Эти случаи временной нетрудоспособности основаны на следующих диагнозах:
Острый гастрит-1 случай
1. Вегетососудистая дистония — 3 случая
2. Хронический дуоденит — 1 случай
3. Острый фарингит — 5 случаев, из них 1 случай стационарного лечения
4. Острый калькулезный холецистит — 1 случай стационарного лечения
5 .Острые респираторные вирусные инфекции — 8 случаев
6. Псориаз — 1 случай
7. Острый бронхит — 3 случая, из них 1 случай стационарного лечения
8. Острый риносинусит — 1 случай
9. Фолликулярный тонзиллит — 1 случай
10. Фиброаденома левой груди — 1 случай
11. Ожог — 2 случая
12. Хронический холецистит — 1 случай
13. Периостит — 3 случая
14. Острый назофарингит — 3 случая
15. Случай ангиоспастической цефалгии-1
16.Синусит-1 случай
17. Флегмона-1 случай
18. Остеохондроз-1 случай
19. Тяжелая преэклампсия, срочные роды — 1 случай, стационарное лечение
20. Миозит-1 случай
21. Ишемическая болезнь сердца , стенокардия — 1 случай
22. Гипертоническая болезнь — 2 случая
23. Хронический церебральный арахноидит — 3 случая
24. Перелом левой стопы — 2 случая, из них 1 стационарное лечение
25. Перелом ключицы -1 стационарное лечение
26.Риск аборта — 1 случай
27. Пиелонефрит — 1 случай
28. Смешанный тип нейроциркуляторной дистонии — 1 случай
29. Отпуск по беременности и родам — ​​4 случая

3. Результаты исследований

Из обследовано 198 сотрудников, лиц с подозрением на профессиональное отравление или профзаболевание не выявлено. По результатам медицинских осмотров все работники шелкопрядильного производства разделены на 3 группы здоровья:
1 группа — Здоровые.Работники без жалоб на здоровье. Также никаких хронических заболеваний не выявлено, а при обследовании функции органов и систем в норме. При осмотре их было 54 сотрудника, что составило 27,27%
2 группа — практически здоровы. Обследование таких работников не выявляет острых и хронических заболеваний, но есть изменения в органах и системах. Эта группа рабочих имела долгую историю работы. Из них 129 сотрудников — 65,15%
3 группа — у которых выявлена ​​начальная стадия заболевания или рабочие с хроническими заболеваниями — 15 человек — 7 человек.5%
По данным рентгенологического исследования выявлено 6 случаев бронхита, что составляет 3%, 1 случай хронического бронхита — 0,5%. При терапевтическом обследовании выявлена ​​смешанная нейроциркуляторная дистония у 9 рабочих, что составляет 4,5%, гипертоническая болезнь 1 степени — у 13 рабочих — 6,5%, гипертония 2 степени — у 5 рабочих — 2,5%. При обследовании офтальмолога представлены следующие данные: хронический дакриоцистит у 2 рабочих — 1%, аллергический конъюнктивит у 6 рабочих — 3%, аномалии рефракции у 5 рабочих — 3%, миопия у 1 рабочего — 0.5%, спазм аккомодации у 2 рабочих -1%. Дерматовенеролог обнаружил себорейный дерматит у 1 рабочего, что составляет 0,5%, псориаз у 1 рабочего, что составляет 0,6%. По результатам осмотра оториноларинголога получены следующие данные: острый ларингит у 6 рабочих — 3%, фронтит у 1 рабочего — 0,6%, искривление носовой перегородки у 2 рабочих — 1%.
По окончании периодического медицинского осмотра заполнен акт из Приложения № 8 на основании Приказа № 200 от 10 июля 2012 года.
По результатам изучения санитарно-гигиенических данных условий труда выявлено, что наибольшая температура рабочих мест наблюдалась в красильном цехе на уровне 31-37,2 градуса, при этом допустимая температура на постоянных рабочих местах должна быть до 29 градусов. Повышение влажности наблюдалось в цехах перемотки — 51,53,7%, намотки коконов 55,7-65,2%, в цехе промывки коконов 70-87%, в цехе обработки 70-73%, т.к. на рабочих местах допускается до 45%, а оптимальная влажность этих помещений по СанПин 0324-16 — 40-60%.Рекомендуется составить комплексный план мероприятий по снижению температуры и влажности на постоянных рабочих местах, по улучшению условий труда. По данным временной нетрудоспособности и периодического медицинского осмотра в вышеуказанных группах с хроническими заболеваниями в период компенсации и декомпенсации рекомендуется лечение в амбулаторных и стационарных условиях, проведение комплексного комплекса профилактических мероприятий.

Каталожные номера



[1] Алимов С.М., Алимова М.А. Вопросы гигиены труда при переработке шелкопряда // Молодой ученый. — 2017. — №50. — С. 114-116. — URL https://moluch.ru/archive/184/47220/.
[2] Постановление Президента № 3472 от 12 января 2018 г. «О мерах по организации деятельности Ассоциации« Узбекипаксаноат »от 29 марта 2018 г.
[3] Санитарные нормы и правила для предприятий шелководства и шелкоперерабатывающей промышленности Республики Узбекистан 16.12. 2002.
[4] Славинская Н.В., Г.З. Ибрагимова, А. Искандаров, М.А. Камалова Актуальные проблемы гигиены труда женщин в условиях современного земледелия // Журн. Теор. и клиники. медицина. — 2012. — №4. — С. 61–63. — Рез. узб., англ. — Библиография.
[5] Славинская Н.В., Ибрагимова Г.З., Камалова М.А. [и др.] Динамика психоэмоционального состояния женщин, работающих на канавном производстве // Журн. Теор. и клин. медицина.- 2013. — № 5. — С. 67–69. — Рез. узб., англ. — Библиография: 8 названий.

Минтай жареный технологическая карта для школы. Рыба жареная (TTK3472)

Количество еды на порцию 255 г со сливочным маслом или 280 г с соусом: рыба — 148-238 г (по нормам сборника рецептов), пшеничная мука — 6 г, масло растительное или сало растительное — 6 г , сливочное масло — 7 г или соус — 50 г, гарнир — 150 г.

Сушеную рыбу целиком или ее порции посыпают солью и перцем, панируют в муке, кладут на предварительно нагретую жиром сковороду или противень кожей вниз и обжаривают с обеих сторон до образования хрустящей золотистой корочки в течение 5-10 минут при 140 ° C. –160 ° С.Рыбу обжаривают в духовке до полной готовности в течение 5–7 минут при температуре 250 ° С. Общее время запекания составляет 10–20 минут. По окончании обжарки рыбу внутри нагревают до 85–90 ° С. Готовность рыбы определяется наличием на ее поверхности мелких пузырьков воздуха. Жареную рыбу отпускают сразу после термической обработки.

На разогретое порционное блюдо или тарелку кладут гарнир: жареный или отварной картофель или пюре, рядом — жареную рыбу, залитую топленым маслом.Отдельно к рыбе подают томатный, красный, сметанный или майонезный с корнишонами. Украшают блюдо петрушкой, иногда дольками лимона. Жареную рыбу также украшают тушеной капустой, гречневой кашей, жареными кабачками, баклажанами, помидорами.

Рыба во фритюре

Количество продуктов на порцию 330 г с соусом или 305 г с майонезом: судак — 192 г, сом — 198 г, или морской окунь — 192 г, или навага — 111 г , или скумбрия — 107 г, мука пшеничная — 6 г, яйцо — 1/7 шт., сухарики — 15 г, жир — 10 г, масло сливочное — 7 г, гарнир — 150 г, томатный соус — 75 г или майонезный соус — 50 г.

Готовый полуфабрикат (рыба целиком или порциями) помещают во фритюр, нагревают до температуры 160-180 ° С. Рыбу опускают шумовкой осторожно, чтобы не было разбрызгивания жира, и жарят на 5-10 минут до образования золотистой корочки на поверхности, затем вынуть, дать жиру стечь, выложить на сковороду и обжарить в духовке.

На отдыхе на разогретое порционное блюдо или тарелку кладут гарнир: жареный картофель из отварного, либо картошку фри, рядом кладут рыбу, которую заливают топленым маслом, украшают долькой лимона и глубоким петрушка жареная.В соуснике подают майонезный соус с корнишонами или томатный соус.

Рыба, обжаренная в тесте

Количество продуктов на порцию 225 г: судак — 140 г, лимонная кислота — 0,2 г, масло растительное — 4 г, петрушка — 2 г, мука пшеничная — 30 г, яйцо — 3 / 4 шт., Молоко — 30, жир — 15 г, соус — 75 г.

После маринования кусочки рыбы накалывают вилкой или поварской иглой, опускают в кляр, затем обмакивают в кипящем жире, обжаривают 3- 5 минут. Готовая обжаренная рыба всплывает на поверхность фритюра, вынимается шумовкой, перекладывается на дуршлаг для слива жира.

Рыбу кладут на блюдо или тарелку, накрытые бумажной салфеткой, по 6-8 штук, придавая им форму пирамиды. Блюдо украшено дольками петрушки и лимона. Подается отдельно майонезный соус с корнишонами или томатный соус. Рыбу также можно подавать с картофелем фри. При приготовлении жидкого теста вместо молока используется вода или пиво. Иногда рыбу нарезают кубиками.

Рыба должна быть хорошо прожаренной, но все же сочной. Тесто пористое и пышное, светло-золотистого цвета.Для жареной рыбы темный цвет жареной рыбы — недопустимый дефект.

Маршрутизация

Рыба жареная

Номер рецепта 240

Сом пятнистый (пестрый)

99

89

Капитан Фиш

108

95

Окунь

102

89

Треска

101

89

Щука, кроме моря

101

95

Пшеничная мука

5

5

Растительное масло

5

5

Жареная рыба

75

Гарнир (рецепты 331,333,334, 335,338)

150

Соус (рецепты No.364 383) или сливочное масло (или столовый маргарин)

50

5

Выход: с жиром

230

Соус

275

* Разделочная рыба (потрошеная и обезглавленная)

Кухонная техника.

Порции рыбы, нарезанные кусочками с кожей и ребрышками, посыпать солью, перцем, панированные в муке, выложить на противень или разогретую жиром сковороду, обжарить с двух сторон до золотистого цвета и приготовить в печь.

Гарниры: отварной картофель, картофельное пюре или овощи, отварные с жиром.

Соусы: красный базовый, томатный, томатный с овощами.

Маршрутизация

Картофельное пюре

Сборник рецептов блюд и кулинарных изделий: учебник для начала профессионального образования / Н.Е. Харченко. — 3-е изд., Стер.-М .: Издательский центр «Академия», 2008.

Номер рецепта 333

Наименование сырья и продукции

Брутто, г

Нетто, г

Картофель

1140

855

Молоко

158

150 *

Столовый маргарин или масло

Выход

1000

* масса кипяченого молока.При отсутствии молока вы можете увеличить скорость вставки жира на 10 г.

Кухонная техника

Очищенный картофель отваривают в воде с солью до готовности, воду сливают, картофель сушат. Вареный горячий картофель протираем через измельчитель или сито. Температура пюре должна быть не ниже 80, иначе пюре будет вязким, что резко ухудшит его вкус и внешний вид … В горячее пюре добавляют топленое масло и кипяченое молоко, непрерывно помешивая.Смесь взбивают до получения однородной пышной массы.

Пюре порционное, на поверхность наносится узор, присыпается зеленью или сваренными вкрутую рублеными яйцами. Масло может поставляться отдельно.

Маршрутизация

Красный соус (основной)

Сборник рецептов блюд и кулинарных изделий: учебник для начала профессионального образования / Н.Е. Харченко. — 3-е изд., Стер.-М .: Издательский центр «Академия», 2008.

Номер рецепта 364

Кухонная техника

Нарезанный лук и морковь обжаривают с жиром, добавляют томатное пюре и продолжают тушение еще 10-15 минут.

Обжарить в просеянной пшеничной муке при температуре 150-160 ° С, периодически помешивая в посуде или противне в духовке (слоем не более 4 см) до получения светло-коричневого цвета.

Охлажденный до 70-80 муки бульон разбавляют теплым бульоном в соотношении 1: 4, тщательно перемешивают и вносят в кипящий коричневый бульон, затем обжаренные в томатном пюре овощи варят при слабом кипении 45-60 минут. В конце добавляем соль, сахар, черный перец горошком, лавровый лист. Процедить соус, втирая в него отварные овощи, и довести до кипения ..

Основной красный соус используется для приготовления производных соусов. При использовании соуса как самостоятельного блюда его заправляют столовым маргарином (30 г).

Маршрутизация

Бульон коричневый

Сборник рецептов блюд и кулинарных изделий: учебник для начала профессионального образования / Н.Е. Харченко. — 3-е изд., Стер.-М .: Издательский центр «Академия», 2008.

Номер рецепта 362

Петрушка (корень)

Или сельдерей (корень)

16

18

12

12

Выход

1000

* кости говядины, баранины, телятины, свинины, птицы и дичи (рябчик, тетерев, куропатка, глухарь).

Кухонная техника

Сырые кости, вымытые и нарезанные на кусочки длиной 5-7 см, обжариваются на противне и в духовке при температуре 160-170 с добавлением моркови, петрушки, лука, нарезаны кусочками любой формы. .

Кости ягненка, телятины, свинины, птицы и дичи обжаривают 30-40 минут, говяжьи кости 1-1,5 часа, переворачивая. Когда кости становятся светло-коричневыми, жарку прекращают и сливают жир, выделившийся из костей.

Обжаренные кости с запеченными корнями и луком помещают в казан, заливают горячей водой и варят 5-6 часов при слабом кипении, периодически удаляя жир и пену.

Для улучшения его качества в подрумяненный бульон можно добавлять мясной сок, полученный после обжарки мясных продуктов. Для этого на противне, на котором жарили мясные изделия, наливаем немного мясного бульона или воды и провариваем 2-3 минуты. Готовый бульон процеживают.


Рыбу всех пород жарят основным способом, в большом количестве жира (во фритюре) и на открытом огне.

Рыбка жареная целиком, осетровые — звеньями и порциями без кожи, нарезанные из ошпаренных звеньев без хрящей.

Рыба чешуйчатая и без чешуи нарезается порциями из филе с кожей и костями, из филе с кожей без костей, для жарки в жире — из филе без кожи и костей.
Иногда рыбу массой до 1,5 кг жарят кусками, вырезанными из неламинированной тушки (круглой).
Перед панировкой кожа на порционных кусках разрезается в двух-трех местах, чтобы рыба не деформировалась при жарке.

При жарке основного блюда
рыбу посыпают солью, перцем, панируют в муке, в красной или белой панировке.
Нагрейте жир на сковороде или противне до 150 ° C.
Рыба обжаривается сначала с одной стороны, а затем с другой.
Жареная рыба доводится до готовности в духовке.
При жарке температура внутри кусков повышается до 75-85 ° C.
Время жарки 10-20 минут.

На гарнир к жареной рыбе чаще всего подают жареный картофель, пюре, рассыпчатую кашу, реже — тушеные и вареные овощи.
Дополнительный гарнир — маринованные огурцы и помидоры.
Карась, линь, лещ, окунь и плотва подаются с гречневой кашей.
Украсить блюдо петрушкой или укропом.
Долька лимона кладется на рыбу.
Жареная рыба может быть подана

Если она подается без соуса, ее поливают кусочком сливочного или зеленого масла.
Можно также сбрызнуть рыбу топленым маслом и лимонным соком.
Чаще всего чешуйчатую и бесчешуйную рыбу отпускают с соусом — томатным, красным, томатным с овощами, томатным с экстрактом или майонезом; служить отдельно.
Карась, линь, окунь, лещ и плотва подаются со сметанным соусом, а лосось и осетрина — с томатным соусом или майонезом с корнишонами.

Рыба жареная по-ленинградски.
Треска, судак, сом, камбала обжариваются и подаются на порционной сковороде; Вокруг рыбы кладут жареный картофель (кружочками), а сверху — обжаренный лук, нарезанный кольцами.

Рыба жареная с лимоном (миньер).
Масло растопить, добавить сок лимона или раствор лимонной кислоты, петрушку, соль, довести до кипения и полить рыбу, обжаренную основным способом.
Картофель для гарнира.

Рыба жареная в жире (во фритюре).

Рыба во фритюре называется «жареной рыбой».
Чаще всего используют судака, навагу, осетровую рыбу, палтуса, треску, сома.
Рыба нарезается на филе без кожи и костей, нарезается на порционные части, панирована в муке, лезоне и белой панировке и обжарена в жире, нагретом до 180-190 ° С; время жарки 8-12 мин.
Вынуть обжаренную рыбу, дать стечь жиру и обжарить в духовке 5-7 минут.

Гарнир — жареный картофель (отварной) или картофель, обжаренный в жире (фри), петрушка (фри) и долька лимона.
Томатный соус, майонез или майонез с корнишоном и т. Д. Подаются отдельно.

Судак с зеленым маслом (кольбер).
Приготовленный полуфабрикат в виде восьмерки или лука обжаривают во фритюре, доводят до готовности в духовке на 5-7 минут.
Жареную рыбу украшают картофелем фри, на рыбу кладут кружок зеленого масла, украшают укропом и долькой лимона.
Томатный, томатный соусы с белым вином или майонезом подаются отдельно.

Рыба жареная в тесте (орлы).

После маринования кусочки рыбы стряхивают с петрушки, обмакивают в тесто (кляр) и обжаривают во фритюре 3-5 минут. Для теста (панировочного теста) желтки яиц растирают с солью, разбавляют молоком, всыпают муку, хорошо вымешивают, добавляя растительное масло.
Непосредственно перед жаркой в ​​тесто добавляют хорошо взбитые белки.
Жареную рыбу кладут на разогретое блюдо пирамидальной формы, рядом кладут петрушку (картофель фри) и дольку лимона.
Майонезный соус с корнишонами или томатный соус подают отдельно.

Рыба, обжаренная на открытом огне (рыба на гриле).
Жареный судак, сиг и другая рыба в панировке не маринуют, а смачивают в топленом масле и панируют в белой панировке.
Свежая сельдь, лосось, сиг, нельма, белая рыба нарезаются порциями и замариновываются, а затем обжариваются без панировки.
Рыбу кладут на решетку из металлических прутьев, нагревают на раскаленных углях и натирают свиным жиром.
Куски рыбы обжариваются сначала с одной стороны, затем с другой, при этом на кусках рыбы получаются темные, сильно прожаренные полосы.
Гарнир — картофель жареный или отварной.
Продукты без покрытия поливают топленым маслом, а майонез с корнишонами или томатным соусом подают к рыбе в панировке.
Ломтик лимона кладется на кусочки рыбы или сбоку.
В настоящее время широко используются грили, в которых рыбу жарят с помощью инфракрасных излучателей на шпажках или решетках.

Рыба жареная на вертеле.
Осетровая рыба жарится на вертеле.
Для этого его разрезают на порции (без кожи и хрящей), которые присыпают солью, перцем, нанизывают на шпажки и обжаривают на раскаленных углях или на гриле.
Во время жарки рыба смачивается растительным маслом.
Украсить рыбу зеленью или луком, лимоном, нарезанным дольками, свежими помидорами (целиком) и жареным картофелем.
Лук нарезать кольцами, а зеленый — кусочками длиной 4-5 см.

Настоящая техническая маршрутизация разработана в соответствии с ГОСТ 31987-2012 и распространяется на блюдо из жареной рыбы, производимое предприятием Кейтеринг.

  1. ТРЕБОВАНИЯ К СЫРЬЯМ

Пищевое сырье, продукты питания и полуфабрикаты, используемые для приготовления пищи, должны соответствовать требованиям действующих нормативных документов, иметь сопроводительные документы, подтверждающие их безопасность и качество (сертификат соответствия, санитарно-эпидемиологическое заключение, сертификат безопасности и качества и др. .)

3. РЕЦЕПТ

Наименование сырья и полуфабрикатов \ Gross \ Net

я II III
БРУТ БРУТ БРУТ
ЗАТЕМ О ЗАТЕМ О ЗАТЕМ О
Пятнистый сом 207 149 165 119 124 89
(пестрый) *
или рыбный капитан 296 160 235 127 176 95
или карты 281 149 225 119 168 89
или путассу *, или треску * 194 149 155 119 116 89
или ставрида океанская 296 145 237 116 176 86
или морской окунь * 204 149 163 119 122 89
Из полуфабрикатов:
Пятнистый сом 166 149 132 119 99 89
(пестрая)
или рыбный капитан 182 160 144 127 108 95
или морской окунь 171 149 137 119 102 89
или код 169 149 135 119 101 89
или щука (кроме моря) 171 145 136 116 101 86
Пшеничная мука 7 7 6 6 5 5
Масло растительное 8 8 6 6 5 5
Рыбная масса жареная 125 100 75
Гарнир ПФ
150 150 150
Соус ПФ 75 50
или масло или 10 10 7 7 5 5
маргарин столовый
Лимонный 8 7
Выход: с жиром 292 257 230
с соусом 257 275

Ставки закладок указаны для пятнистого (пестрого) сома, путассу, морского окуня, потрошеной безголовой трески.

4. ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС

Порции рыбы, нарезанные из филе с кожей и ребрышками, посыпать солью, перцем, панированные в муке, выложить на противень или разогретую жиром сковороду, обжарить с двух сторон. до золотистого цвета и доводим до готовности в духовке.

Гарниры — картофель отварной, пюре, картофель жареный, овощи отварные с жиром.

Соусы — базовый красный, томатный, томатный с овощами.

  1. ТРЕБОВАНИЯ К ПРОЕКТИРОВАНИЮ, ВНЕДРЕНИЮ И ХРАНЕНИЮ

Сервировка: Блюдо готовится по заказу потребителя, используется по рецепту основного блюда.Срок годности и реализация согласно СанПин2.3.2.1324-03, СанПин2.3.6.1079-01 Примечание: технологическая карта составлена ​​на основании акта разработки.

  1. ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ

6.1 Органолептические показатели качества:

Внешний вид — характеристика данного блюда.

Цвет — Типичный для продуктов, входящих в состав продукта.

Вкус и запах — Типичный для продуктов, входящих в состав продукта, без посторонних привкусов и запахов.

6.2 Микробиологические и физико-химические показатели:

По микробиологическим и физико-химическим показателям эта посуда соответствует требованиям технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевых продуктов» (ТР ТС 021/2011)

ТЕХНИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ КАРТА № Рыба жареная в духовке

  1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Данная технико-технологическая карта разработана в соответствии с ГОСТ 31987-2012 и распространяется на блюдо из рыбы жареной в печи, производимой предприятием общественного питания.

  1. ТРЕБОВАНИЯ К СЫРЬЯМ

Пищевое сырье, пищевые продукты и полуфабрикаты, используемые для приготовления пищи, должны соответствовать требованиям действующих нормативных документов, иметь сопроводительные документы, подтверждающие их безопасность и качество (сертификат соответствия, санитарно-эпидемиологическое заключение, сертификат безопасности и качества, и др.)

3. РЕЦЕПТ

Название продукта Масса, г Химический состав Энергетическая ценность, ккал
Брутто Нетто B F Есть
Камбала дальневосточная 128 83/88
Азово-Черноморская камбала 131,6 84/89
Камбала крепкая 127 84/89
или скумбрия дальневосточная 94 83/88
Пшеничная мука 5 5
Масло растительное 5 5
Рыбная масса жареная
Сливочное масло 5 5

Выход: с маслом 75

* — в знаменателе — масса полуфабриката

4.ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС

Порции рыбы, нарезанные филе с кожей и ребрышками, посыпать солью, панированные в муке, выложить на противень или сковороду, предварительно подогретую маслом, обжарить с двух сторон до румяной корочки сначала на плите. , а затем доводили до готовности в духовке. Продолжительность жарки рыбы 15-20 минут.

  1. ТРЕБОВАНИЯ К ПРОЕКТИРОВАНИЮ, ВНЕДРЕНИЮ И ХРАНЕНИЮ

Сервировка: Блюдо готовится по заказу потребителя, используется по рецепту основного блюда.Срок годности и реализация согласно СанПин2.3.2.1324-03, СанПин2.3.6.1079-01 Примечание: технологическая карта составлена ​​на основании акта разработки.

Температура сервировки 65 ° С.

Гарниры: картофель отварной, пюре.

  1. ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ

6.1 Органолептические показатели качества:

Одна штука на порцию. Рыба прожарилась, сохранила форму, золотистая корочка не густая. Цвет, вкус и запах соответствуют типу рыбы.Гарнир укладывается на бок. На пюре есть рисунок.

6.2 Микробиологические и физико-химические показатели:

По микробиологическим и физико-химическим показателям эта посуда соответствует требованиям технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевых продуктов» (ТР ТС 021/2011)

  1. ПИЩЕВАЯ И ЭНЕРГЕТИКА ЗНАЧЕНИЕ

Белки, г Жиры, г Углеводы, г Калорийность, ккал (кДж)

6,79 85,93

Инженер-технолог.

(PDF) Индукция апоптоза, аутофагии и ферроптоза с помощью Thymus vulgaris и экстракта Arctium lappa в клеточных линиях лейкемии и множественной миеломы

Molecules 2020,25, 5016 17 из 18

40.

Ikeda, A .; Nemoto, K .; Yoshida, C .; Miyata, S .; Mori, J .; Soejima, S .; Yokosuka, A .; Mimaki, Y .;

Ohizumi, Y .; Дегава, М. Подавляющее действие нобилетина, полиметоксифлавоноида цитрусовых, который подавляет экспрессию взаимодействующего с тиоредоксином белка

, на индуцированный туникамицином апоптоз в клетках нейробластомы человека

SK-N-SH.Neurosci. Lett. 2013, 549, 135–139. [CrossRef]

41.

Wang, J.-S .; Ren, T.-N .; Xi, T. Урсоловая кислота индуцирует апоптоз, подавляя экспрессию FoxM1 в

клетках рака груди человека MCF-7. Med. Онкол. 2012,29, 10–15. [CrossRef]

42.

Kim, K.H .; Seo, H.S .; Choi, H.S .; Choi, I .; Shin, Y.C .; Ко, С.-Г. Индукция апоптотической гибели клеток урсоловой кислотой

через путь митохондриальной смерти и путь внешнего рецептора смерти в клетках MDA-MB-231.

Arch. Pharmacol. Res. 2011,34, 1363. [CrossRef] [PubMed]

43.

Shen, S .; Zhang, Y .; Zhang, R .; Tu, X .; Гонг, X. Урсоловая кислота индуцирует аутофагию в клетках U87MG посредством стресса эндоплазматического ретикулума, зависимого от

АФК. Chem. Биол. Взаимодействовать. 2014, 218, 28–41. [CrossRef] [PubMed]

44.

Cmoch, P .; Пакульский, З .; Swaczynov

á

, J .; Стрнад, М. Синтез сапонинов лупанового типа, содержащих маннозил

,

и 3,6-разветвленные триманнозильные остатки, и их оценка в качестве противораковых агентов.Углеводы. Res.

2008

,

343, 995–1003. [CrossRef]

45.

Aratanechemuge, Y .; Hibasami, H .; Санпин, К .; Katsuzaki, H .; Имаи, К .; Комия Т. Индукция апоптоза

лупеолом, выделенным из мокумена (Gossampinus malabarica L. Merr) в клетках промиелотического лейкоза человека HL-60.

Онкол. Реп. 2004, 11, 289–292. [CrossRef]

46.

Redfern, J .; Kinninmonth, M .; Burdass, D .; Верран, Дж. Использование экстракции этанолом Сокслета для производства и испытания

растительного материала (эфирных масел) на их антимикробные свойства.J. Microbiol. Биол. Educ.

2014

, 15, 45.

[CrossRef]

47.

Leich, E .; Weissbach, S .; Klein, H .; Grieb, T .; Пищимаров, Дж .; Stühmer, T .; Chatterjee, M .; Steinbrunn, T .;

Langer, C .; Eilers, M. На множественную миелому влияют множественные и гетерогенные соматические мутации в

сигнальных молекулах адгезии и рецепторной тирозинкиназы. Рак крови J. 2013,3, e102. [CrossRef]

48.

E erth, T .; Зауэрбрей, А.; Ольбрих, А .; Gebhart, E .; Rauch, P .; Weber, H.O .; Hengstler, J.G .; Halatsch, M.-E .;

Вольм, М .; Тью, К. Молекулярные механизмы действия артесуната в линиях опухолевых клеток. Мол. Pharmacol.

2003

,

64, 382–394. [CrossRef]

49.

Özenver, N .; Saeed, M .; Демирезер, Л.О .; Эерт, Т. Алоэ-эмодин как лекарство-кандидат для лечения рака.

Oncotarget 2018,9, 17770. [CrossRef]

50.

Hegazy, M.-E.F .; Абдельфатах, С.; Hamed, A.R .; Mohamed, T.A .; Elshamy, A.A .; Салех, I.A .; Reda, E.H .;

Abdel-Azim, N.S .; Shams, K.A .; Сакр, М. Цитотоксичность экстрактов 40 египетских растений, воздействующих на механизмы

устойчивых к лекарствам раковых клеток. Phytomedicine 2019,59, 152771. [CrossRef]

51.

Mbaveng, A.T .; Bitchagno, G.T .; Куэте, В .; Tane, P .; Эерт, Т. Цитотоксичность ungeremine в отношении

многофакторных лекарственных устойчивых раковых клеток и индукция апоптоза, ферроптоза, некроптоза и аутофагии.

Phytomedicine 2019,60, 152832. [CrossRef]

52.

Abdelfatah, S .; Böckers, M .; Asensio, M .; Kadioglu, O .; Klinger, A .; Fleischer, E .; Эерт, Т. Изопетазин

и S-изопетазин как новые ингибиторы Р-гликопротеина против раковых клеток с множественной лекарственной устойчивостью. Phytomedicine

2020, 153196. [CrossRef]

53.

Kuete, V .; Мбавенг, A.T .; Sandjo, L.P .; Зейно, М .; Эерт, Т. Цитотоксичность и механизм действия встречающегося в природе

нафтохинона, 2-ацетил-7-метоксинафто [2, 3-b] фуран-4, 9-хинона в отношении многофакторных

устойчивых к лекарствам раковых клеток.Фитомедицина 2017 г., 33, 62–68. [CrossRef]

54.

Mbaveng, A.T .; Fotso, G.W .; Ngnintedo, D .; Куэте, В .; Ngadjui, B.T .; Keumedjio, F .; Andrae-Marobela, K .;

Эерт, Т. Цитотоксичность эпунктанона и четырех других фитохимических веществ, выделенных из лекарственных растений

Garcinia epunctata и Ptycholobium contortum, по отношению к многофакторным лекарственно-устойчивым раковым клеткам. Фитомедицина

2018,48, 112–119. [CrossRef]

55.

Adem, F.A.; Мбавенг, A.T .; Куэте, В .; Heydenreich, M .; Ндакала, А .; Ирунгу, Б .; Yenesew, A .; E erth, T.

Цитотоксичность изофлавонов и бифлавоноидов из Ormocarpum kirkii по отношению к многофакторному лекарственному устойчивому

раку. Phytomedicine 2019,58, 152853. [CrossRef]

56.

Nakata, S .; Yoshida, T .; Хоринака, М .; Shiraishi, T .; Wakada, M .; Sakai, T. Ингибиторы гистон-деацетилазы

активируют рецептор смерти 5 / TRAIL-R2 и повышают чувствительность апоптоза, индуцированного TRAIL / APO2-L, в клетках злокачественных опухолей человека

.Онкоген 2004,23, 6261–6271. [CrossRef]

Индукция апоптоза, аутофагии и ферроптоза с помощью Thymus vulgaris и экстракта Arctium lappa в клеточных линиях лейкемии и множественной миеломы

Молекулы. 2020 ноя; 25 (21): 5016.

Aveen N. Adham

1 Кафедра фармакогнозии, Фармацевтический колледж, Медицинский университет Хавлера, Эрбиль 44001, Курдистан, Ирак; [email protected]

2 Кафедра фармацевтической биологии, Институт фармацевтических и биомедицинских наук, Университет Йоханнеса Гутенберга, Staudinger Weg 5, 55128 Майнц, Германия; изд.zniam-inu @ yzagehom

Мохамед Эламир Ф. Хегази

2 Кафедра фармацевтической биологии, Институт фармацевтических и биомедицинских наук, Университет Йоханнеса Гутенберга, Штаудингер Вег 5, 55128 Майнц, Германия; [email protected]

3 Департамент химии лекарственных растений, Национальный исследовательский центр, ул. Эль-Бохоут 33, Докки, Гиза 12622, Египет

Алаадин М. Накишбанди

1 Департамент фармакогнозии, Фармацевтический колледж Медицинского университета Хавлера, Эрбиль 44001, Курдистан, Ирак; [email protected]

Thomas Efferth

2 Отделение фармацевтической биологии, Институт фармацевтических и биомедицинских наук, Университет Йоханнеса Гутенберга, Staudinger Weg 5, 55128 Майнц, Германия; [email protected]

Роберто Фабиани, академический редактор

1 Кафедра фармакогнозии, Фармацевтический колледж, Медицинский университет Хавлера, Эрбиль 44001, Курдистан, Ирак; [email protected] 2 Отделение фармацевтической биологии, Институт фармацевтических и биомедицинских наук, Университет Йоханнеса Гутенберга, Staudinger Weg 5, 55128 Майнц, Германия; изд.zniam-inu @ yzagehom

3 Департамент химии лекарственных растений, Национальный исследовательский центр, ул. Эль-Бохоут 33, Докки, Гиза 12622, Египет

Поступила в редакцию 24 сентября 2020 г .; Принято 2020 28 октября.

Лицензиат MDPI, Базель, Швейцария. Эта статья представляет собой статью в открытом доступе, распространяемую в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Эта статья цитировалась другими статьями в PMC. .

Abstract

Thymus vulgaris и Arctium lappa использовались в качестве народного средства в регионе Иракского Курдистана для лечения различных проблем со здоровьем.Целью настоящего исследования является изучение цитотоксичности T. vulgaris и A. lappa в клеточных линиях лейкемии и множественной миеломы (ММ) и определение способа гибели клеток, вызванного наиболее сильными цитотоксическими фракциями обоих растений. в мм. Анализ резазурина использовали для оценки цитотоксической и ферроптозной активности, апоптоза и модуляции в фазе клеточного цикла исследовали с помощью двойного окрашивания аннексином V-FITC / PI и анализов остановки клеточного цикла. Кроме того, мы использовали вестерн-блоттинг для определения гибели клеток аутофагии. n -Гексан, хлороформ, этилацетат и бутанол фракции T. vulgaris и A. lappa проявили цитотоксичность в клеточных линиях CCRF-CEM и CEM / ADR 5000 в диапазоне концентраций 0,001–100 мкг / мл с потенциальным потенциалом. активность выявляется по фракциям хлороформа и этилацетата. NCI-H929 продемонстрировал выраженную чувствительность к фракциям хлороформа T. vulgaris (TCF) и A. lappa (ACF) со значениями IC 50 6,49 ± 1,48 и 21,9 ± 0.69 мкг / мл соответственно. TCF индуцировал апоптоз в клетках NCI-H929 с более высоким соотношением (71%) по сравнению с ACF (50%) при 4 × IC 50 . ACF продемонстрировал более сильную аутофагическую активность, чем TCF. TCF и ACF индуцировали остановку клеточного цикла и ферроптоз. Апигенин и нобилетин были идентифицированы в TCF, в то время как нобилетин, урсоловая кислота и лупеол были основными соединениями, идентифицированными в ACF. T. vulgaris и A. lappa могут рассматриваться как потенциальные кандидаты в растительные лекарственные средства, которые останавливают пролиферацию раковых клеток за счет индукции апоптоза, аутофагии и ферроптоза.

Ключевые слова: апоптоз, сложноцветные, аутофагия, гибель клеток, ламиевые, ферроптоз, множественная миелома, фитотерапия

1. Введение

Гематологические злокачественные новообразования — это разновидности рака, которые возникают в кроветворной ткани или костном мозге. лимфатической системы и включают лейкоз, лимфому и множественную миелому (ММ) [1]. ММ — один из наиболее распространенных типов гематологического рака, на который в мире приходится около 10% всех гематологических злокачественных новообразований.ММ характеризуется накоплением атипичных плазматических клеток в костном мозге, связанным с аномальной выработкой моноклональных иммуноглобулинов, что вызывает почечные осложнения, гиперкальциемию, сильную боль и разрушение в костях, а также анемию. Заболевание чаще встречается у мужчин, чем у женщин, и чаще у пожилых людей [2]. Лейкоз — еще одно опасное для жизни гематологическое злокачественное новообразование, характеризующееся аномальным повышением количества лейкоцитов в крови и костном мозге в результате сочетания факторов окружающей среды и генетических факторов [3].Лейкоз встречается у взрослых в возрасте старше 55 лет, но является наиболее распространенным раком у детей младше 15 лет. Среди наиболее распространенных типов лейкемии — острый лимфобластный лейкоз и острый миелоидный лейкоз с пятилетней выживаемостью 68,2 и 26,9% соответственно [4]. Лекарственные растения привлекают большое внимание как источник новых онкологических терапевтических средств из-за их биоактивных химических ингредиентов с потенциальной эффективностью и минимальными профилями токсичности [5].

Thymus vulgaris — многолетнее растение семейства мятных Lamiaceae с приятным запахом, широко известное как тимьян.Курдское название растения — Джатре. Растение растет на грубых грубых почвах и солнечном климате. Он произрастает в Азии, Европе, Америке и Африке [6], и с древних времен использовался в качестве приправы, духов и благовоний [7]. Растение известно своим содержанием эфирных масел, таких как (тимол, карвакрол, β-мирцен, γ-терпинен, линалоол, терпинен-4-ол, п-цимен), флавоноиды (апигенин, тимонин, лютеолин-7- O -глюкуронид, лютеолин-7- O -рутинозид, эриодиктиол-7- O -рутинозид, нобилетин, цирсилинеол и 8-метоксицирсилинеол), хиноны (арбутин) и феноловая кислота (кофейная кислота и розовая кислота) [ ].Тимьян обладает различными биологическими активностями, включая противовирусную, противовоспалительную, антиоксидантную, противораковую, инсектицидную, противодиабетическую и противоспазматическую [9]. T. vulgaris обладает гепатопротекторным действием против ацетаминофен-индуцированного некроза печени у мышей [10]. Согласно многочисленным исследованиям, T. vulgaris подавлял жизнеспособность различных линий опухолевых клеток в зависимости от концентрации, таких как рак молочной железы, плоскоклеточный рак полости рта, лейкоз, карцинома простаты, эпителиальная карцинома шейки матки и карцинома легких [11, 12].Было показано, что модель клеток рака прямой кишки человека HCT116 предотвращает скорость пролиферации клеток и стимулирует апоптоз, связанный с повышенной активностью каспазы-3/7 [13].

Arctium lappa — двухлетнее съедобное цветущее растение семейства сложноцветных, широко известное как лопух. Курдское название завода — Бнаватом. Он встречается в лесах и лесах, но в основном вдоль дорог, пустырей и рек. Он культивируется в регионе Хавраман, на юге Курдистана, в Ираке как лекарственное растение [14]. A. lappa произрастает в Европе и Азии и быстро распространился по Северной Америке благодаря первым европейским поселенцам [15]. Корни A. lappa содержат различные биологически активные вторичные метаболиты, такие как лигнаны (арктигенин, арктиин и диарктигенин), полифенолы (кофейная кислота, 4-о-глюкозид кофейной кислоты, хлорогеновая кислота, кверцитрин, кверцетин, кверцетин-3- ). O -глюкуронид, нобилетин, п-кумаровая кислота, биаханин А и тангеретин), танин и терпеноиды (лупеол, урсоловая и олеаноловая кислоты) [16].Эти ингредиенты известны своей активностью по улавливанию свободных радикалов, противораковым, антиметастатическим, противоаллергическим, противовоспалительным, антигепатотоксическим и противовирусным действием [17]. Tian, ​​X. et al., Сообщили о нейрозащитном эффекте этилацетатного экстракта корней A. lappa против индуцированного H 2 O 2 повреждения клеток в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y [18]. Исследование действия A. lappa на раковые клетки человека показало, что при обработке клеток различными экстрактами экстракты дихлорметана проявляли активность, особенно в отношении клеточных линий лейкемии K562, MCF-7 молочной железы и почек 786-0 с ингибированием роста опухоли. в 3.62, 41,1 и 60,32 мкг / мл соответственно [19].

T. vulgaris и A. lappa относятся к числу широко используемых традиционных лекарств в Ираке для лечения заболеваний, связанных с раком или которые могут привести к раку, таких как кожные заболевания, заболевания крови, воспалительные заболевания, иммунные расстройства и инфекционные заболевания [14,20]. Существует мало научных данных о цитотоксической активности T. vulgaris и A. lappa по отношению к клеточным линиям ММ.Таким образом, цель настоящего исследования заключалась в оценке цитотоксичности экстрактов T. vulgaris и A. lappa против различных клеточных линий MM, выяснения механизмов гибели клеток и идентификации биоактивных соединений, присутствующих в наиболее эффективных экстракты.

2. Результаты

2.1. Цитотоксичность T. vulgaris и A. lappa.

Бутанол и этилацетатные экстракты показали наилучшие выходы экстракции среди четырех типов экстрактов у обоих растений, за которыми следовали экстракты n -гексан и хлороформ ().

Таблица 1

Доля различных экстрактов растворителем T. vulgaris и A. lappa.

Растения Растворители Урожайность ( w / w %) Цвет Консистенция
T. vulgaris n -Гексан 21,172 Темно-зеленый Жирный, полутвердый
Хлороформ 2.663 Темно-зеленый Твердый
Этилацетат 28,236 Бледно-желтый Твердый
Бутанол 41,507 Темно-красный Желейный
A. lappa n -Гексан 1,828 Желтовато-зеленый Жирный, полутвердый
Хлороформ 0,454 Красновато-коричневый Твердый
Этилацетат 4.217 Красновато-коричневый Твердый
Бутанол 12,756 Темно-красный Мармелад

Результаты анализа резазурина показали, что все фракции проявляли цитотоксическую активность в ингибирующей концентрации 50 (IC ) варьируются от 2,13 ± 3,77 мкг / мл (фракция хлороформа (CF) в клетках CCRF-CEM) до 94,35 ± 4,60 мкг / мл (фракция бутанола (BF) в клетках CEM / ADR5000). Среди протестированных фракций хлороформ и этилацетат показали наивысшую цитотоксическую активность против обеих клеточных линий ().Клетки CEM / ADR5000 с множественной лекарственной устойчивостью выявили только низкие степени перекрестной устойчивости к этилацетатной фракции (EF), CF и BF у T. vulgaris и n -гексановой фракции (HF), CF и BF A. lappa (диапазон степеней устойчивости от 1,88 до 5,71) и не были перекрестно устойчивыми к HF T. vulgaris и EF A. lappa (степени устойчивости: 1,08 и 1,18). Для сравнения, клетки CEM / ADR5000 демонстрируют высокий уровень перекрестной устойчивости к его селекционному агенту, доксорубицину, более 1000, и высокий уровень перекрестной устойчивости к другим противоопухолевым препаратам природного происхождения (другим антрациклинам, алкалоидам барвинка, таксанам и эпиодофиллотоксинам). ) [21].

Таблица 2

Цитотоксичность различных фракций T. vulgaris и A. lappa по отношению к клеточным линиям лейкемии, как определено с помощью анализа резазурина.

T. vulgaris A. lappa
Фракции CCRF-CEM CEM / ADR5000 CCRF-CEM CEM / ADR5000
IC 50 (мкг / мл ± стандартное отклонение) IC 50 (мкг / мл ± стандартное отклонение) D.R. IC 50 (мкг / мл ± стандартное отклонение) IC 50 (мкг / мл ± стандартное отклонение) D.R.
HF 31,51 ± 1,63 34,02 ± 0,84 1,08 29,72 ± 1,10 55,93 ± 0,68 1,88
CF 2,13 ± 3,77 4,00 ± 0,15 1,88 6,75 ± 0,95 14,95 ± 3,28 2,21
EF 4.35 ± 1,18 24,85 ± 2,60 5,71 25,38 ± 3,29 29,80 ± 2,32 1,17
БФ 28,64 ± 0,35 94,35 ± 4,60 3,29 30,67 ± 2,09 93,48 ± 4,89 3,05

Обе фракции дополнительно исследовали на 9 линиях клеток MM (). Фракция хлороформа Thymus (TCF) и фракция хлороформа Arctium (ACF) продемонстрировали наибольшую ингибирующую активность по сравнению с этилацетатной фракцией Thymus (TEF) и этилацетатной фракцией Arctium (AEF) против всех исследованных линий раковых клеток MM. , особенно клетки NCI-H929 для TCF (IC 50 : 6.49 ± 1,48 мкг / мл) и RPMI-8226 для ACF (IC 50 : 18,26 ± 0,26 мкг / мл).

Таблица 3

Цитотоксичность хлороформных и этилацетатных фракций T. vulgaris и A. lappa по отношению к клеточным линиям MM, как определено с помощью анализа резазурина.

МОЛП-8
Клеточная линия MM T. vulgaris A. lappa
IC 50 (мкг / мл ± стандартное отклонение) IC 50 (мкг / мл ± стандартное отклонение)
CF EF CF EF
56
13.45 ± 3,49 41,63 ± 0,53 39,51 ± 2,30 56,92 ± 1,00
NCI-H929 6,49 ± 1,48 25,55 ± 3,78 21,9 ± 0,69 35,01 ± 0,94
РПМИ-8226 27,14 ± 0,01 30,17 ± 0,17 18,26 ± 0,26 > 100
КМС-12БМ 15,28 ± 4,90 31,78 ± 3,46 22.3 ± 0,18 81,2 ± 1,78
КМС-11 17,26 ± 2,48 35,15 ± 1,93 31,95 ± 2,37 65,04 ± 1,89
Л-363 11,28 ± 4,64 25,61 ± 2,21 46,97 ± 3,66 35,62 ± 0,43
JJN-3 13,88 ± 1,19 30,11 ± 1,69 25,99 ± 0,70 48,00 ± 4,41
АМО-И 14.02 ± 2,64 35,07 ± 3,23 29,11 ± 1,04 35,02 ± 0,59
ОПМ-2 6,91 ± 3,70 26,06 ± 0,78 35,63 ± 4,079 45,96 ± 2,49

По сравнению с клеточными линиями лейкемии и ММ, эти экстракты не проявляли цитотоксичности в отношении доброкачественных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) до 100 мкг / мл (A). TEF показал самую низкую активность в MOLP-8 (IC 50 : 41.63 ± 0,53 мкг / мл) и AEF не продемонстрировали очевидного цитотоксического эффекта до 100 мкг / мл в клетках RPMI-8226 после 72 ч инкубации.

Цитотоксичность хлороформных фракций T. vulgaris (TCF) и A. lappa (ACF) по отношению к клеткам NCI-H929 и мононуклеарам периферической крови (PBMC), как определено с помощью анализа резазурина. ( A ): цитотоксичность по отношению к нормальным PBMC. ( B ): Ингибиторы ферроптоза (ферростатин-1 и дефероксамин) снижали цитотоксичность экстрактов, что указывает на роль гибели клеток ферроптоза.Контроль: клетка NCI-H929 без ингибиторов ферроптоза.

Данные в таблице b демонстрируют влияние ингибиторов ферроптоза. И ферростатин-1, и дефероксамин сводили на нет цитотоксическую активность TCF и ACF до наивысшей испытанной концентрации (100 мкг / мл).

2.2. Апоптоз через образование внутриклеточных АФК и нарушение ММП

Окрашивание аннексином V-FITC / PI использовали для определения того, участвует ли апоптоз как способ гибели клеток в ингибировании роста клеток NCI-H929, вызванного TCF и ACF.Как показано на фиг.4, обработка клеток NCI-H929 TCF индуцировала поздний апоптоз (66% и 71% против 6% и 5% для необработанных клеток). С другой стороны, воздействие ACF также вызывало поздний апоптоз (40% и 50% против 6% и 5% для необработанных клеток) и поздний некроз (13% и 17% против 4% и 6% для необработанных клеток). Для визуализации морфологических особенностей апоптотической гибели клеток мы выполнили 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) окрашивание после инокуляции клеток NCI-H929 с 1 и 2 × IC 50 TCF и ACF в течение 48 часов.показали четкие апоптотические особенности, такие как образование апоптотических телец, конденсация хроматина, фрагментация ядер, а также сокращение клеток.

Индукция апоптоза в клеточных линиях NCI-H929. Анализ аннексина V / PI клеток NCI-H929, инкубированных с 0,5, 1, 2, 4 × IC 50 фракций хлороформа ( A ) — T. vulgaris (TCF) и ( B ) — A. lappa (ACF) на 48 и 72 ч. Морфологию клеток NCI-H929 наблюдали под флуоресцентным микроскопом с использованием красителя 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI).Желтые стрелки, относящиеся к апоптотическим признакам, наблюдались в клетках, обработанных A -TCF и B -ACF, по сравнению с необработанными клетками. Контроль: клетка NCI-H929 без обработки.

Чтобы выяснить, коррелирует ли апоптоз, вызванный TCF и ACF, с образованием активных форм кислорода (ROS) и разрушением митохондриального мембранного потенциала (MMP), мы оценили уровень ROS и целостность MMP. После воздействия на клетки NCI-H929 0,5, 1, 2, 4 × IC 50 концентраций TCF и ACF, окрашенных диацетатом 2 ‘, 7’-дихлоргидрофлуоресцеина (h3DCFH-DA), мы наблюдали явное повышение уровней ROS у обработанных клетки по сравнению с необработанными клетками.Как показано на фиг.1, образование ROS увеличивалось в 7,8, 9,5 и 4,6 раза после 1 ч обработки TCF, ACF или перекисью водорода H 2 O 2 (в качестве положительного контроля) соответственно.

Внутриклеточная продукция активных форм кислорода в клетках NCI-H929. Результаты после 1 ч инкубации с 0,5, 1, 2, 4 × IC 50 фракций хлороформа T. vulgaris (TCF) и A. lappa (ACF), окрашенных диацетатом 2 ‘, 7’-дихлородигидрофлуоресцеина (h3DCFH-DA) и анализировали проточной цитометрией.Контроль: клетка NCI-H929 без обработки.

На потерю ММП указывает уменьшение отношения интенсивности красной / зеленой флуоресценции. показывает добавление TCF и ACF при 0,5, 1, 2, 4 × IC 50, , а также валиномицина (положительный контроль) в течение 24 часов, сниженное отношение красной (агрегаты JC-1) к зеленой (JC- 1) флуоресценции в зависимости от дозы и минимальное соотношение, выявленное при воздействии TCF (4 × IC 50 : 0,19%), за которым следует валиномицин (20 мкМ: 0.2%) и ACF (4 × IC 50 : 0,61%) по сравнению с необработанными клетками NCI-H929 (70,42%). Эти данные показывают, что апоптоз, стимулируемый T. vulgaris и A. lappa , был связан с генерацией ROS и нарушением целостности MMP.

Нарушение митохондриального мембранного потенциала (MMP) в клетках NCI-H929 при воздействии 0,5, 1, 2, 4 × IC 50 фракций хлороформа T. vulgaris (TCF) и A. lappa (ACF) в течение 24 часов, окрашивали 5,5 ‘, 6,6′-тетрахлор-1,1′, 3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианином йодидом (JC-1) и анализировали проточной цитометрией.Отношение красной (агрегат JC-1) / зеленой (мономер JC-1) флуоресценции использовали для демонстрации влияния TCF, ACF и валиномицина на целостность MMP. Контроль: клетка NCI-H929 без обработки.

2.3. Влияние TCF и ACF на распределение клеточного цикла.

Клетки NCI-H929 обрабатывали различными концентрациями TCF и ACF в течение 24, 48 и 72 часов, окрашивали йодидом пропидия (PI) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Результаты для TCF показывают, что клетки накапливаются в (апоптотической) суб-G0 / G1-фазе (14.4%, 16% и 48,4% по сравнению с 10%, 12% и 9,25% для необработанных клеток) через 24, 48 и 72 часа соответственно. Кроме того, клетки, арестованные в G2 / M-фазе (20% и 26% по сравнению с 18% и 20% для необработанных клеток) через 24 и 48 часов, соответственно, с соответствующим уменьшением доли клеток, арестованных в G0 / G1-фаза (57,5%, 42% и 24,4% против 60,7%, 55% и 59% для необработанных клеток). Кроме того, воздействие ACF на клетки NCI-H929 приводило к остановке клеток в суб-G0 / G1-фазе (13%, 26% и 42%).8% по сравнению с 10%, 12% и 13% для необработанных клеток) после инкубации в течение 24, 48 и 72 часов, соответственно, и фазы G2 / M (25,1% и 19% против 20% и 17%). % для необработанных клеток) через 48 и 72 ч соответственно с соответствующим уменьшением соотношения клеток в фазе G0 / G1 (59%, 33% и 28,7% против 60,7%, 55% и 58% для необработанные клетки).

Индукция нарушения клеточного цикла в клеточных линиях NCI-H929, обработанных 0,5, 1, 2, 4 × IC 50 хлороформных фракций T. vulgaris (TCF) и A.lappa (ACF) через 24, 48 и 72 ч, окрашивали йодидом пропидия (PI) и анализировали методом проточной цитометрии. Контроль: клетка NCI-H929 без обработки.

2.4. TCF и ACF влияют на экспрессию Beclin-1 и LC3B-II

После обработки клеток NCI-H929 TCF или ACF (1, 2 или 4 × IC 50 ) в течение 24 часов результаты показали: повышенная экспрессия Beclin-1 и LC3B-II по сравнению с необработанным контролем.

Экспрессия Beclin-1 и LC3B-II в человеческих клетках NCI-H929, обработанных 1, 2, 4 × IC 50 хлороформных фракций T.vulgaris (TCF) и A. lappa (ACF) в течение 24 часов был обнаружен с помощью вестерн-блоттинга. Относительная экспрессия белков Beclin-1 и LC3B-II была нормализована до β-актина. Контроль: клетка NCI-H929 без обработки.

2,5. Фитохимическое исследование TCF и ACF.

Анализ жидкостной хроматографии, электрораспылительной ионизации и масс-спектрометра (LC-ESI / MS) для TCF и ACF показал присутствие 5–20 компонентов во фракциях хлороформа каждого растения. На хроматограмме TCF обнаружено, что пиков нет.1 и 2 были предсказаны как апигенин и нобилетин, в то время как на хроматограмме ACF пики № 2, 3 и 4 предполагали, что это нобилетин, урсоловая кислота и лупеол. Эти соединения были идентифицированы путем сравнения наших значений m / z , МС / МС спектров и химической формулы путем одновременной инъекции с аутентичными стандартными соединениями и сравнения их значений времени удерживания.

ЖХ-ЭСИ / МС хроматограммы экстрактов T. vulgaris и A. lappa . ( A ) -Стандартные соединения.(1) апигенин, (2) нобилетин, (3) урсоловая кислота и (4) лупеол. ( B ) — T. vulgaris фракция хлороформа (TCF) и ( C ) — A. lappa фракция хлороформа (ACF).

3. Обсуждение

Ранее сообщалось о цитотоксической активности T. vulgaris и A. lappa в отношении различных линий раковых клеток [11,12,19]. Несколько отчетов предоставили доказательства активности против клеточных линий, полученных из солидных опухолей, но было доступно очень мало данных об их активности на клеточных линиях MM.В нашем исследовании четыре фракции T. vulgaris и A. lappa с различной полярностью были скринированы с использованием анализа восстановления резазурина против чувствительных к лекарствам CCRF-CEM и мультирезистентных P-гликопротеин-сверхэкспрессирующих клеток CEM / ADR5000. Все фракции показали цитотоксическую активность против обеих клеточных линий со значением IC 50 от 2,13 ± 3,77 до 94,35 ± 4,60 мкМ / мл. Доксорубицин проявлял цитотоксическую активность против чувствительных и устойчивых фенотипов лейкозных клеток, таких как клетки CCRF-CEM и CEM / ADR5000 с IC 50 : 0.02 ± 0,00 и 122,96 ± 10,94 мкМ / мл [22]. CEM / ADR5000 были более чувствительны к экстрактам T. vulgaris и A. lappa , чем к доксорубицину. По данным Американского национального института рака, экстракты растений со значениями IC 50 <30 мкг / мл после 72-часовой инкубации могут рассматриваться как разумно сильная цитотоксическая активность [23]. Фракции хлороформа и этилацетата обоих растений соответствовали требуемым критериям для значений IC 50 в диапазоне от 2,13 до 29.80 мкг / мл для клеток CCRF-CEM и CEM / ADR5000. Таким образом, клеточные линии лейкемии были высокочувствительны к полуполярным соединениям, присутствующим во фракциях хлороформа и этилацетата, по сравнению с полярными и неполярными соединениями [24]. В другом отчете экстракты T. vulgaris показали дозозависимое снижение жизнеспособности лейкозных клеток THP-1 со значением IC 50 , равным 156,9 мкг / мл, в то время как токсичность по отношению к нормальным PBMC человека была намного меньше (IC 50 : 334,5 мкг / мл) [11]. В нашем анализе TCF и TEF выявили самую высокую цитотоксичность в отношении клеток NCI-H929 со значениями 6 IC 50 .49 ± 1,48 мкг / мл и 25,55 ± 3,78 мкг / мл соответственно. Доксорубицин предотвращает развитие клеточных линий ММ человека, таких как RPMI 8226, U266 и NCI-H929, посредством индукции апоптоза [25]. Гибель клеток обычно происходит в результате апоптоза, некроза, ферроптоза, аутофагии, пироптоза, митотической катастрофы и так далее. Апоптоз, также известный как запрограммированная гибель клеток, характерная форма гибели клеток, находится под контролем, зависит от энергии и не сопровождается воспалением [26]. TCF подавлял рост клеток, индуцировал апоптоз (поздний апоптоз), в основном сопровождаемый нарушением целостности ММП, влиял на фазу клеточного цикла, особенно на суб-G0 / G1, дозозависимым образом в клеточных линиях NCI-H929, и незначительно влиял на фазу G2 / M в различных концентрациях.Эти результаты согласуются с предыдущими сообщениями, предполагающими, что полифенольные экстракты из T. vulgaris подавляли жизнеспособность клеток и способствовали апоптозу в клетках нейробластомы, например, клеточных линиях SH-SY5Y и SK-N-BE (2) -C в дозах 62,5 и 125 мкг / мл [27]. Кроме того, этанольный экстракт остановил клеточный цикл в фазе G2 / M клеток рака молочной железы T-47D [28]. С другой стороны, ACF проявил наибольшую цитотоксичность против клеток RPMI-8226 (IC 50 : 18,26 ± 0,26 мкг / мл) и AEF против клеток NCI-H929 (IC 50 : 35.01 ± 0,94 мкг / мл). ACF подавлял рост клеток, способствовал некрозу и апоптозу (поздний апоптоз), который в основном был связан с генерацией ROS и индукцией остановки клеточного цикла в фазе суб-G0 / G1 в клеточных линиях NCI-H929, и в то же время незначительно влиял на G2 / Фаза М. Однако в предыдущих исследованиях сообщалось, что этанольный экстракт корня A. lappa проявлял сильную цитотоксическую активность против Т-клеточных лейкозных клеток Jurkat после лечения в течение 24 часов (IC 50 : 102,2 ± 42,4 мкг / мл) путем фрагментации ДНК и индукция внутреннего апоптоза, связанного с потерей ММП и активацией каспазы-3/7, без токсичности в отношении доброкачественных эмбриональных фибробластов 3T3 мыши [29]. A. lappa индуцировал остановку клеточного цикла G0 / G1 в клеточных линиях рака желудка, а также нарушение фазы G2 / M в клетках рака толстой кишки [30]. Наше исследование показало, что смерть клеток ферроптоза в дополнение к апоптозу участвует в подавляющей опухоль активности TCF и ACF. Насколько нам известно, это первое сообщение о ферроптозе этих двух растений. Ферроптоз — это новая форма гибели клеток, которая представляет собой запрограммированный некроз и впервые предложена в 2012 году Диксоном [31,32].Он играет важную роль в прекращении онкогенеза, устраняя клетки, поцарапанные инфекцией или испытывающие недостаток основных питательных веществ в окружающей среде. Несколько исследований показали, что основным причинным фактором в запуске ферроптоза является классический путь окислительного стресса. Эрастин был первым введенным агентом, индуцирующим ферроптоз, за ​​ним последовали цисплатин, темозоломид, артесунат, сульфасалазин [33]. Интересно, что культивирование клеток NCI-H929, обработанных TCF или ACF, показало активацию важных маркеров, связанных с аутофагией, таких как LC3B-II и Beclin-1, что указывает на способность обоих растений вызывать аутофагию.Beclin1, ортолог Atg6 дрожжей у млекопитающих, участвует в качестве каркаса на начальной стадии процесса аутофагии, который представляет собой конструирование комплекса фосфатидилинозитол-3 киназ (PI3K) и присутствует на хромосоме 17q21 человека. Сверхэкспрессия Beclin1 подавляет пролиферацию и снижает жизнеспособность клеток за счет запуска аутофагической гибели клеток посредством эволюционно консервативного домена и домена спиральной спирали, связывающегося с Vps34p и UVRAG, соответственно [34]. LC3B-II принадлежит к семейству ассоциированного с микротрубочками белка 1A / 1B-легкая цепь 3 (LC3) и накапливается, в частности, на формирующихся аутофагосомах.Цитозольно-ассоциированный белок легкой цепи 3 (LC3-I) превращается в мембраносвязанную форму LC3-II при образовании аутофагосом [35]. ACF обладал более высокой эффективностью по сравнению с TCF. Апигенин и нобилетин были идентифицированы в TCF, в то время как нобилетин, лупеол и урсоловая кислота были обнаружены в ACF. Доступная литература продемонстрировала, что флавоноиды и терпеноиды в изобилии содержатся в овощах, фруктах и ​​лекарственных травах, и выявила цитотоксичность по отношению к нескольким линиям раковых клеток человека и индуцировала гибель клеток с помощью различных механизмов [36].Недавнее исследование показало, что в клетках MM обработка апигенином сильно ингибировала развитие клеток в зависимости от концентрации путем индукции апоптоза, ферроптоза и аутофагии клеток, связанных с подавлением STAT1 и Akt с сопутствующей активацией каспаз, JNK, P -38 МАПК, Беклин-1 и LC3 II [37]. В клетках BCPAP папиллярной карциномы щитовидной железы человека апигенин индуцировал остановку клеточного цикла G2 / M и повреждение ДНК за счет подавления экспрессии Cdc25c и запуска накопления продукции ROS [38].Нобилетин подавлял развитие клеточных линий TMK-1 желудка человека (IC 50 : 134,8 мкМ) за счет индукции апоптоза и остановки клеточного цикла в фазе G0 / G1 [39], а также подавлял экспрессию критического фактора эндоплазматизма. ретикулум, такой как тиоредоксин-взаимодействующий белок (TXNIP), и, следовательно, приводит к апоптозу клеток нейробластомы человека [40]. Урсоловая кислота способствовала апоптотической гибели клеток MCF-7 рака молочной железы человека за счет подавления Bcl-2 и подавления экспрессии фактора транскрипции FoxM1 [41], в то время как в клетках MDA-MB-231 посредством гибели митохондрий и пути внешней смерти рецептора [42] .Другое исследование показало, что урсоловая кислота запускает гибель клеток аутофагии в клетках глиомы U87MG через образование кислых везикулярных органелл, развитие аутофаголизосом и накопление LC3-II [43]. Лупеол продемонстрировал цитотоксическую активность в отношении MM RPMI 8226 (IC 50 : 50 мкМ), карциномы легкого A-549 (IC 50 : 50 мкМ), карциномы груди MCF-7 (IC 50 : 50 мкМ), злокачественной опухоли. меланома G361 (IC 50 : 50 мкМ) и карцинома шейки матки HeLa (IC 50 : 37 мкМ) после 72 ч инкубации [44].Индукция апоптоза лупеола в клетках промиелотической лейкемии человека HL-60 проявляется в виде образования гиподиплоидных ядер и фрагментации ДНК в зависимости от концентрации и времени [45].

4. Материалы и методы

4.1. Химические вещества и реагенты

Растворители, такие как n -гексан, хлороформ, этилацетат, бутанол, ацетонитрил и метанол, были приобретены в Chem-Lab (Zedelgem, Бельгия). Пенициллин и стрептомицин были получены от Gibco (Дублин, Ирландия).Набор для обнаружения апоптоза аннексина V-FITC / PI был получен от Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США) и 5,5 ‘, 6,6′-тетрахлор-1,1′, 3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианина йодид (JC- 1) наборы от Biomol (Гамбург, Германия). h3DCFH-DA, H 2 O 2 , ферростатин-1, дефероксамин, валиномицин, PI, резазурин, тритон X-100, параформальдегид, твин-20, диметилсульфоксид (ДМСО), DAPI и доксорубицин) (чистота 98,0%) приобретена у Sigma-Aldrich (Тауфкирхен, Германия). Реагент для экстракции белка млекопитающих M-PER ® и ингибитор протеазы были получены от Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США).Антитела против Beclin-1 (D40C5), LC3B, β-актина (D6A8) и антитела против IgG кролика, связанные с HRP, были приобретены у Cell Signaling Technology (Danvers, MA, США), а субстрат Luminata ™ Classico Western HP был получен у Merck. Millipore (Дармштадт, Германия).

4.2. Приготовление экстрактов растений

Надземные части T. vulgaris и корни A. lappa были собраны в Курдистане, Ирак, в течение 2018–2019 гг. Растительные материалы были подтверждены доцентом Аль-Хаятом А.Х., а ваучеры (A-11 и A-12, соответственно) были сданы на хранение в отдел фармакогнозии Фармацевтического колледжа Медицинского университета Хавлера.Порошок растительного сырья (каждый по 500 г) последовательно экстрагировали в экстракторе Сокслета [46] метанолом в течение 36 ч. Экстракты концентрировали досуха с использованием роторной паровой машины при 40-50 ° C (Buchi Rotavator ® , Швейцария) и повторно растворяли в 10% метаноле с последующим жидкостно-жидкостным фракционированием с использованием (10 ×) с равным объем n растворителей гексана, хлороформа, этилацетата и бутанола. Полученные фракции HF, CF, EF и BF концентрировали в вакууме и затем измельчали ​​в сублимационной сушилке (Martin Christ Alpha 1-2 LD plus, Osterode am Harz, Германия) для получения фракций с различной полярностью.Все фракции хранили при 4 ° C для дальнейших исследований.

4.3. Условия культивирования клеток

Девять линий клеток множественной миеломы, MOLP-8, NCI-H929, RPMI-8226, KMS-12BM, KMS-11, L-363, JJN-3, AMO-I и OPM-2 были любезно предоставлены. Ellen Leich-Zbat (Институт патологии Вюрцбургского университета, Германия) [47]. Чувствительные CCRF-CEM и лейкозные клетки CEM / ADR5000 с множественной лекарственной устойчивостью были получены от профессора Axel Sauerbrey (кафедра педиатрии, Йенский университет, Германия). Фенотип множественной лекарственной устойчивости клеток CEM / ADR5000 был ранее охарактеризован [21,48].Клеточные линии культивировали в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) (Gibco, Дублин, Ирландия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Gibco, Дублин, Ирландия) и 1% пенициллина (100 Ед. / мл) -стрептомицин (100 мкг / мл) в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 при 37 ° C. Устойчивость клеточных линий CEM / ADR5000 поддерживалась добавлением 5000 нг / мл доксорубицина. PBMC были выделены и культивированы, как сообщалось ранее [49].

4.4. Анализ восстановления резазурина

Жизнеспособность клеток изучали с помощью проницаемого для клеток окислительно-восстановительного индикатора резазурина.Вкратце, 1 × 10 4 клеток / лунку ММ и лейкозных клеток суспендировали в 100 мкл ростовой среды, высевали в 96-луночные планшеты; затем объем увеличивали до 200 мкл / лунку, обрабатывая клетки 100 мкл среды, содержащей различные концентрации растительного экстракта (0,001–100 мкг / мл), предварительно растворенного в ДМСО (конечная концентрация 0,3%). Клетки, обработанные 0,3% ДМСО, считали отрицательным контролем [50]. Анализ резазурина также использовался для исследования влияния ингибиторов ферроптоза, таких как ферростатин-1 и хелаторов железа дефероксамин, на цитотоксичность различных фракций растений, как описано ранее [51].Кроме того, 1 × 10 4 клеток NCI-H929 на лунку культивировали с ферростатином-1 (50 мкМ) и дефероксамином (0,2 мкМ) в течение 1 ч перед воздействием на обработку. В дальнейшем клетки инкубировали с разными концентрациями фракций растений (0,001–100 мкг / мл) и контроля. После 72 часов инкубации в среде с 5% CO 2 при 37 ° C в каждую лунку добавляли 20 мкл 0,01% раствора w / v резазурина и инкубировали в темноте еще 4 часа. Флуоресценцию резазурина измеряли при длине волны возбуждения 544 нм и эмиссии при 590 нм с использованием планшет-ридера Infinite M2000 Pro TM (Tecan, Crailsheim, Германия).IC 50 различных клеточных линий вычисляли по калибровочной кривой экспоненциальной линейной регрессией с использованием программного обеспечения GraphPad Prism6 и выражали в виде среднего ± стандартное отклонение. Степень устойчивости определяли как значение IC 50 устойчивой клеточной линии по сравнению со значением IC 50 чувствительной клеточной линии [22]. Эксперименты повторяли трижды.

4.5. Проточная цитометрическая оценка апоптоза

Клетки

NCI-H929 (10 6 клеток / лунка) обрабатывали в течение 48 или 72 часов различными концентрациями TCF и ACF, затем инкубировали при 37 ° C и 5% CO 2 атмосфере.Клетки собирали и ресуспендировали в буфере для связывания аннексина V. Затем добавляли 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл PI и инкубировали в течение 15–20 мин в темном месте и при комнатной температуре [52]. Апоптоз и некроз клеток определяли с использованием проточного цитометра BD Accuri ™ C6 (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Результаты оценивались с использованием программного обеспечения FlowJo версии 7.0. и каждый эксперимент проводился трижды. Данные выражены как процент клеток в каждой популяции (жизнеспособные клетки аннексин V- / PI-; ранний апоптотический аннексин V + / PI-; поздний апоптотический аннексин и ранний некротический V + / PI +; поздний некротический V- / PI +).

4.6. Проточная цитометрическая оценка потенциала митохондриальной мембраны

Вкратце, через 24 часа после посева клеток NCI-H929 (10 6 клеток / лунку) с различными концентрациями TCF и ACF, 0,3% ДМСО (отрицательный контроль) и валиномицин (положительный контроль) , при 37 ° C и инкубации 5% CO 2 клетки затем инкубировали с JC-1 в течение 30 мин. Клетки анализировали с использованием анализатора LSR-Fortessa FACS (Becton-Dickinson, Heidelbeg, Германия), и отношение интенсивности красной / зеленой флуоресценции использовали для определения изменения целостности ММП и рассчитывали с использованием программного обеспечения FlowJo версии 7.0 [53,54]. Каждое наблюдение проводилось трижды.

4.7. Проточная цитометрическая оценка Реактивные виды кислорода

Клетки NCI-H929 (2 × 10 6 клеток / лунка) ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) (Gibco, Дублин, Ирландия) и подвергали воздействию 2 мкМ h3DCFH-DA для 30 минут. Впоследствии клетки обрабатывали различными концентрациями TCF и ACF, H 2 O 2 (положительный контроль) или DMSO (отрицательный контроль). После инкубации в течение 1 ч обработанные клетки дважды промывали для удаления внеклеточного соединения и суспендировали в PBS.Флуоресценцию 2 ‘, 7’-дихлорфлуоресцеина детектировали с помощью проточной цитометрии [55]. Достигнутое количество ROS было рассчитано с использованием программного обеспечения FlowJo версии 7.0. Каждый эксперимент проводился трижды.

4.8. Проточная цитометрическая оценка распределения клеточного цикла

Клетки NCI-H929 (10 6 клеток / лунка) инкубировали с различными концентрациями TCF и ACF в течение 24, 48 и 72 ч при 37 ° C и 5% CO 2 . ДМСО (0,3%) использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали и фиксировали, постепенно добавляя 1 мл холодного абсолютного этанола с встряхиванием к осадку клеток, и хранили при -20 ° C в течение 24 часов.Клетки собирали и промывали PBS, и ядра окрашивали PI до конечной концентрации 50 мкг / мл. Процентное содержание ДНК в каждой фазе (суб-G0 / G1, G0 / G1, S и G2 / M) измеряли с помощью проточного цитометра BD Accuri ™ C6 [56]. Каждый эксперимент проводился трижды.

4.9. Флуоресцентная микроскопия

После 48-часовой обработки клеток NCI-H929 (10 6 клеток / лунка) различными концентрациями TCF и ACF клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали PBS и заблокирован 5% FBS и 0.1% Triton X-100 в PBS в течение еще 1 часа при комнатной температуре. Ядерную морфологию апоптотических клеток контролировали путем окрашивания ядер клеток 1 мкг / мл DAPI [57] в темноте в течение 10 мин при 37 ° C и визуализировали под флуоресцентным микроскопом (EVOSs FL Cell Image System, Thermo Fisher Scientific ).

4.10. Вестерн-блоттинг

Клетки

NCI-H929 (10 6 клеток / лунку) обрабатывали различными концентрациями TCF и ACF или 0,3% ДМСО в качестве отрицательного контроля. После 24 ч инкубации клетки лизировали реагентом для экстракции белка млекопитающих M-PER ® и ингибитором протеазы в соотношении (1: 100) при 4 ° C в течение 30 минут.Концентрации белка определяли на спектрофотометре Nano-Drop1000 (Thermo Fisher Scientific). Выделенный белок смешивали с электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с загрузкой красителя и кипятили при 95 ° C в течение 10 мин. Равное количество белка (30 мкг) подвергали 10% SDS-PAGE и затем переносили на мембраны из поливинилидендифторида (RotiR PVDF, размер пор 0,45 мкм, Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия). Кроме того, 5% ( w / против ) бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0.5% твин-20 (BSA / TBST) использовали для блокирования неспецифических сайтов связывания в мембранах при комнатной температуре в течение 1 часа. Мембраны инкубировали с антителами против LC3B, Beclin-1 или β-актина (в качестве нормализующего контроля) в течение ночи при 4 ° C. После промывки TBST мембраны дополнительно инкубировали с HRP-связанным вторичным антикроличьим антителом в течение 1 ч при комнатной температуре. Обнаружение полосы белка проводили путем воздействия на мембрану субстрата Luminata ™ Classico Western HRP, а изображения мембран получали с помощью системы Alpha Innotech Fluor Chem Q (Biozym, Германия) [58].Программное обеспечение Image Studio Lite использовалось для определения относительной интенсивности полос.

4.11. Анализ LC-ESI / MS фракций

T. vulgaris и A. lappa.

TCF и ACF анализировали с помощью системы LC-ESI / MS. Система высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) была 1260 Infinity II (Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия). Для процесса разделения использовали обращенно-фазовый Eclipse Plus C 18 RRHP (50 × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм, от Agilent Technologies). Элюенты состояли из 2% ацетонитрила в H 2 O (фаза A) и 100% метанола (фаза B), и был использован следующий режим градиента: 0–1 мин, 15% B изократический; 1–24 мин, линейный градиент от 15% до 95% B; 24–29 мин, 95% B изократический; 29–30 мин, линейный градиент от 95% до 15% B; и повторное уравновешивание 30-50 мин, 15% B изократический.Температура колонки была установлена ​​на 30 ° C, скорость потока — 0,2 мл / мин, а вводимый объем — 5 мкл. ВЭЖХ в сочетании с квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром 6545 (Agilent Technologies), оборудованным интерфейсом ионизации электрораспылением Agilent Jet Stream, работающим в положительном режиме. В качестве небулайзера и вспомогательного газа использовали азот высокой чистоты, и условия были установлены при температуре сушильного газа 320 ° C, температуре газа оболочки 350 ° C и скорости потока 10 л / мин. Давление небулайзера установлено на 35 фунтов на квадратный дюйм, капиллярное напряжение 3.5 кВ, напряжение на сопле 1 кВ. Фрагмент был установлен на 175 (условные единицы). Полное сканирование MS от m / z 100–3000 Да было получено при скорости сканирования 1 спектр / с. Обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения mestrenova.

5. Выводы

Различные фракции T. vulgaris и A. lappa ингибировали пролиферацию и снижение жизнеспособности лейкозных и MM клеточных линий, а не нормальных человеческих PBMC, в зависимости от концентрации. Как следствие, наше исследование продемонстрировало, что оба растения обладают сильной цитотоксической активностью против гематологических злокачественных новообразований, результаты были подтверждены оценкой механизма их действия.Среди различных фракций TCF и ACF как сильнодействующие цитотоксические фракции индуцировали апоптоз (как показано во фракции суб-G0 / G1) и слегка задерживали развитие клеточного цикла в фазе G2 / M. TCF запускает поздний апоптоз и ранний некроз, в то время как ACF запускает поздний апоптоз и как ранний, так и поздний некроз, опосредованный нарушением MMP и повышенными внутриклеточными уровнями ROS, что дополнительно подчеркивается характерными морфологическими изменениями. Аутофагические эффекты ACF были сильнее, чем у TCF. В дополнение к упомянутым механизмам гибели клеток ферроптоза также способствовали TCF и ACF в клетках NCI-H929.Анализ LC-ESI / MS выявил различные химические компоненты в TCF и ACF, четыре из которых были идентифицированы как апигенин, нобилетин, лупеол и урсоловая кислота.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Институту молекулярной биологии gGmbH (IMB) (Майнц, Германия), где были выполнены эксперименты по проточной цитометрии для ММП. Авторы также выражают признательность основной лаборатории масс-спектрометрии на химическом факультете Университета Йоханнеса Гутенберга в Майнце за выполнение анализа LC-ESI / MS.

Вклад авторов

Концептуализация, A.M.N. и Т.Е .; методология, A.M.N., T.E. и M.E.F.H .; формальный анализ, T.E .; проверка, A.M.N. и Т.Е .; расследование, А.Н.А. и M.E.F.H .; ресурсы, A.M.N. и Т.Е .; письменная — подготовка оригинального черновика, A.N.A .; написание — просмотр и редактирование, A.M.N., T.E. и M.E.F.H .; визуализация, Т. и A.N.A .; надзор, А. и Т.Е .; администрация проекта, A.M.N. и Т.Е .; привлечение финансирования, A.M.N. и Т. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

A.N.A. благодарит Медицинский университет Хавлера за стипендию для посещения отделения T.E. Расходные материалы были в равной степени профинансированы Медицинским университетом Хавлера, Университетом Йоханнеса Гутенберга и пожертвованием Марка Штробеля из Франкфурта. M.E.F.H. благодарит за финансовую поддержку Фонда Александра фон Гумбольдта, Германия «Исследовательская стипендия Георга Форстера для опытных исследователей».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сноски

Наличие образца: Все образцы соединений доступны у авторов.

Примечание издателя: MDPI сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​филиалов организаций.

Список литературы

1. Тейлор Дж., Сяо В., Абдель-Вахаб О. Диагностика и классификация гематологических злокачественных новообразований на основе генетики. Кровь. 2017; 130: 410–423. DOI: 10.1182 / кровь-2017-02-734541. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4.Озенвер Н., Давуд М., Флейшер Э., Клингер А., Эфферт Т. Хемометрическое и транскриптомное профилирование, разрушение микротрубочек и индукция гибели клеток под действием секалоновой кислоты в опухолевых клетках. Молекулы. 2020; 25: 3224. DOI: 10,3390 / молекулы25143224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Кроуэлл Дж. А. Программа исследований по разработке химиопрофилактических агентов в отделе профилактики рака Национального института рака США: обзор. Евро. J. Рак. 2005; 41: 1889–1910. DOI: 10.1016 / j.ejca.2005.04.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Максимович З., Стоянович Д., Шоштарич И., Дайич З., Ристич М. Состав и улавливающая радикалы активность эфирного масла Thymus glabrescens wild (Lamiaceae). J. Sci. Продовольственное сельское хозяйство. 2008; 88: 2036–2041. [Google Scholar] 7. Ахмед Х. Этнофармакоботаническое исследование лекарственных растений, используемых травниками в провинции Сулеймания, Курдистан, Ирак. J. Ethnobiol. Этномед. 2016; 12: 8. DOI: 10.1186 / s13002-016-0081-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8.Бердовска И., Зелински Б., Фека И., Кульбака Ю., Сачко Ю., Гамиан А. Цитотоксическое воздействие фенольных соединений из видов Lamiaceae на клетки рака груди человека. Food Chem. 2013; 141: 1313–1321. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2013.03.090. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Николич М., Гламоцлия Дж., Феррейра И.К., Калхельха Р.К., Фернандес Э., Маркович Т., Маркович Д., Гивели А., Сокович М. Химический состав, антимикробная, антиоксидантная и противоопухолевая активность Thymus serpyllum L., Thymus algeriensis Boiss.и эфирные масла Reut и Thymus vulgaris L. Ind. Crops Prod. 2014; 52: 183–190. [Google Scholar] 10. Греспан Р., Агиар Р.П., Джубилей Ф.Н., Фусо Р.Р., Дамиау М.Дж., Сильва Е.Л., Микча Дж.Г., Эрнандес Л., Берсани Амадо К., Куман Р.К.Н. Гепатопротекторный эффект предварительной обработки эфирным маслом Thymus vulgaris на экспериментальной модели повреждения, вызванного ацетаминофеном. Evid. На основе дополнения. Альтернат. Med. 2014; 2014: 954136. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Айеш Б.М., Абед А.А., Доаа М.Ф. Ингибирование клеток ТНР-1 лейкемии человека in vitro экстрактами Origanum syriacum L. и Thymus vulgaris L. BMC Res. Примечания. 2014; 7: 612. DOI: 10.1186 / 1756-0500-7-612. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Цзу Ю., Ю Х., Лян Л., Фу Й., Эфферт Т., Лю X., Ву Н. Активность десяти эфирных масел в отношении Propionibacterium acnes и раковых клеток PC-3, A-549 и MCF-7. Молекулы. 2010. 15: 3200–3210. DOI: 10,3390 / молекулы15053200.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Аль-Менхали А., Аль-Румаихи А., Аль-Мохаммед Х., Аль-Мазруей Х., Аль-Шамлан М., Аль-Джассим М., Аль-Корби Н., Ид AH Thymus vulgaris (тимьян) подавляет пролиферация, адгезия, миграция и инвазия клеток колоректального рака человека. J. Med. Еда. 2015; 18: 54–59. DOI: 10.1089 / jmf.2013.3121. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Ахмад С.А., Аскари А.А. Этноботаника региона Хавраман Курдистана, Ирак. Harv. Пап. Бот. 2015; 20: 85–89.DOI: 10.3100 / hpib.v20iss1.2015.n8. [CrossRef] [Google Scholar] 15. Цзянь Фэн К., Пэн Ин З., Чэн Вэй Х., Тао Тао Х., Юн Гуи Б., Као Шань С. Влияние водного экстракта корней Arctium lappa L. (лопуха) на половое поведение самцов крыс. BMC Дополнение. Альтерн. Med. 2012; 12: 8. DOI: 10.1186 / 1472-6882-12-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Бадарау А.С., Ван Д., Свами М.К., Шоу С., Магги Ф., Да Силва Л.Э., Лопес В., Йунг А.В.К., Мокан А., Атанасов А.Г. Arctium видов вторичных метаболитов, химическое разнообразие и биоактивность.Передний. Plant Sci. 2019; 10: 834. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Лу К., Чжу З., Чжао Ю., Чжу Р., Чжао Х. Арктигенин, лигнан из Arctium lappa L., подавляет метастазирование клеток рака молочной железы человека за счет подавления MMP-2 / -9 и гепараназы. в клетках MDA-MB-231. Онкол. Отчет 2017; 37: 179–184. DOI: 10.3892 / or.2016.5269. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Тиан Х., Го Л.-П., Ху Х.-Л., Хуанг Дж., Фань Й.-Х., Рен Т.-С., Чжао Ц.-К. Защитные эффекты Arctium lappa L.корни против повреждения клеток, вызванного перекисью водорода, и потенциальные механизмы в клетках SH-SY5Y. Клетка. Мол. Neurobiol. 2015; 35: 335–344. DOI: 10.1007 / s10571-014-0129-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Predes F.S., Ruiz A.L., Carvalho J.E., Foglio M.A., Dolder H. Антиоксидантная и антипролиферативная активность экстрактов корня Arctium lappa in vitro. BMC Complement Altern. Med. 2011; 11:25. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Накишбанди А. Растения, используемые в иракской традиционной медицине в регионе Эрбиль-Курдистан.Zanco J. Med. Sci. 2014; 18: 811–815. DOI: 10.15218 / zjms.2014.0038. [CrossRef] [Google Scholar] 21. Эфферт Т., Конкималла В.Б., Ван Ю.-Ф., Зауэрбрей А., Мейнхардт С., Цинтл Ф., Маттерн Дж., Волм М. Прогнозирование устойчивости опухолей широкого спектра к противораковым препаратам. Clin. Cancer Res. 2008. 14: 2405–2412. DOI: 10.1158 / 1078-0432.CCR-07-4525. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Мбавенг А.Т., Дамен Ф., Симо Мпетга Дж. Д., Авуафак М. Д., Тане П., Куэте В., Эфферт Т. Цитотоксичность неочищенного экстракта и изолированных компонентов коры Dichrostachys cinerea по отношению к многофакторным лекарственно-устойчивым раковым клеткам.Evid. На основе дополнения. Альтернат. Med. 2019; 2019: 8450158. DOI: 10.1155 / 2019/8450158. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Мотана Р.А., Линдеквист У., Грюнерт Р., Беднарски П.Дж.Изучение противоопухолевого, антимикробного и антиоксидантного потенциала in vitro выбранных йеменских лекарственных растений с острова Сокотра. BMC Complement Altern. Med. 2009; 9: 7. DOI: 10.1186 / 1472-6882-9-7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Радованович А. Оценка потенциальных цитотоксических эффектов растительных экстрактов.Сербский J. Exp. Clin. Res. 2015; 16: 333–342. DOI: 10.1515 / sjecr-2015-0041. [CrossRef] [Google Scholar] 25. Turner JG, Dawson JL, Grant S., Shain KH, Dalton WS, Dai Y., Meads M., Baz R., Kauffman M., Shacham S. Лечение приобретенной лекарственной устойчивости множественной миеломы с помощью комбинированной терапии с XPO1 и топоизомеразой II ингибиторы. J. Hematol. Онкол. 2016; 9: 1–11. DOI: 10.1186 / s13045-016-0304-z. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Перейра С.Е., Дантас Р.Ф., Феррейра С.Б., Гомес Л.П., Сильва-младший Ф.П. Разнообразные механизмы и противораковый потенциал нафтохинонов. Cancer Cell Int. 2019; 19: 1–20. DOI: 10.1186 / s12935-019-0925-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Pacifico S., Piccolella S., Papale F., Nocera P., Lettieri A., Catauro M. Комплекс полифенолов из Thymus vulgaris L., культивируемых в регионе Кампания (Италия): новые перспективы против нейробластомы. J. Funct. Еда. 2016; 20: 253–266. DOI: 10.1016 / j.jff.2015.11.008. [CrossRef] [Google Scholar] 28. Аль-сераджи И.М., Харат К.Р., Дабе А.С. Остановка клеточного цикла и индукция апоптоза в клетках рака молочной железы человека (T-47D) с помощью этанольного экстракта Annona squamosa L. и Thymus vulgaris L. J. Biol. Active Prod. Nat. 2019; 9: 47–56. DOI: 10.1080 / 22311866.2018.1554452. [CrossRef] [Google Scholar] 29. Дон Р.А.С.Г., Яп М.К.К. Arctium lappa L. экстракт корня вызывает гибель клеток посредством митохондриально-опосредованного каспазозависимого апоптоза в лейкозных Т-клетках человека Jurkat.Биомед. Фармакотер. 2019; 110: 918–929. [PubMed] [Google Scholar] 30. Jeong J.B., Hong S.C., Jeong H.J., Koo J.S. Арктигенин вызывает остановку клеточного цикла, блокируя фосфорилирование Rb посредством модуляции белков, регулирующих клеточный цикл, в клетках рака желудка человека. Int. Иммунофармакол. 2011; 11: 1573–1577. DOI: 10.1016 / j.intimp.2011.05.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Ян Г., Эльбадави М., Эфферт Т. Множественные способы гибели клеток и их ключевые особенности. Мировая Акад. Sci. J. 2020; 2: 39–48.DOI: 10.3892 / wasj.2020.40. [CrossRef] [Google Scholar] 33. Ooko E., Saeed M.E., Kadioglu O., Sarvi S., Colak M., Elmasaoudi K., Janah R., Greten H.J., Efferth T. Производные артемизинина вызывают железозависимую гибель клеток (ферроптоз) в опухолевых клетках. Фитомедицина. 2015; 22: 1045–1054. DOI: 10.1016 / j.phymed.2015.08.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 34. Park J.M., Tougeron D., Huang S., Okamoto K., Sinicrope F.A. Beclin 1 и UVRAG обеспечивают защиту от радиационно-индуцированного повреждения ДНК и поддерживают стабильность центросом в клетках колоректального рака.PLoS ONE. 2014; 9: e100819. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35. Kabeya Y., Mizushima N., Ueno T., Yamamoto A., Kirisako T., Noda T., Kominami E., Ohsumi Y., Yoshimori T. LC3, гомолог дрожжевого Apg8p у млекопитающих, локализуется в мембранах аутофагосом после обработка. EMBO J. 2000; 19: 5720–5728. DOI: 10,1093 / emboj / 19.21.5720. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Баррека Д., Мандалари Г., Кальдераро А., Смериглио А., Тромбетта Д., Феличе М. Р., Гаттузо Г. Флавоны цитрусовых: обновленная информация об источниках, биологических функциях и свойствах, способствующих укреплению здоровья.Растения. 2020; 9: 288. DOI: 10.3390 / растения88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Адхам А.Н., Абдельфатах С., Накишбанди А.М., Махмуд Н., Эфферт Т. Цитотоксичность апигенина по отношению к клеточным линиям множественной миеломы и подавление экспрессии iNOS и COX-2 в клетках HEK293, трансфицированных STAT1. Фитомедицина. 2020; 80: 153371. DOI: 10.1016 / j.phymed.2020.153371. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 38. Zhang L., Cheng X., Gao Y., Zheng J., Xu Q., Sun Y., Guan H., Yu H., Sun Z. Апигенин вызывает гибель аутофагических клеток в клетках BCPAP папиллярной карциномы щитовидной железы человека.Food Funct. 2015; 6: 3464–3472. DOI: 10.1039 / C5FO00671F. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Yoshimizu N., Otani Y., Saikawa Y., Kubota T., Yoshida M., Furukawa T., Kumai K., Kameyama K., Fujii M., Yano M. Противоопухолевые эффекты нобилетина, флавоноида цитрусовых, на рак желудка включают: антипролиферативные эффекты, индукцию апоптоза и нарушение регуляции клеточного цикла. Алимент. Pharmacol. Ther. 2004. 20: 95–101. DOI: 10.1111 / j.1365-2036.2004.02082.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Икеда А., Немото К., Yoshida C., Miyata S., Mori J., Soejima S., Yokosuka A., Mimaki Y., Ohizumi Y., Degawa M. Подавляющее действие нобилетина, полиметоксифлавоноида цитрусовых, который подавляет экспрессию взаимодействующего с тиоредоксином белка, на туникамицин -индуцированный апоптоз в клетках нейробластомы человека SK- N -SH. Neurosci. Lett. 2013; 549: 135–139. DOI: 10.1016 / j.neulet.2013.06.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 41. Wang J.-S., Ren T.-N., Xi T. Урсоловая кислота индуцирует апоптоз, подавляя экспрессию FoxM1 в клетках рака груди человека MCF-7.Med. Онкол. 2012; 29: 10–15. DOI: 10.1007 / s12032-010-9777-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42. Ким К.Х., Со Х.С., Чой Х.С., Чой И., Шин Ю.С., Ко С.-Г. Индукция апоптотической гибели клеток урсоловой кислотой через путь митохондриальной гибели и путь внешнего рецептора смерти в клетках MDA-MB-231. Arch. Pharmacol. Res. 2011; 34: 1363. DOI: 10.1007 / s12272-011-0817-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 43. Шен С., Чжан Ю., Чжан Р., Ту X., Гонг X. Урсоловая кислота индуцирует аутофагию в клетках U87MG посредством стресса эндоплазматического ретикулума, зависимого от АФК.Chem. Биол. Взаимодействовать. 2014; 218: 28–41. DOI: 10.1016 / j.cbi.2014.04.017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 44. Cmoch P., Pakulski Z., Swaczynová J., Strnad M. Синтез сапонинов лупанового типа, содержащих маннозильные и 3,6-разветвленные триманнозильные остатки, и их оценка в качестве противораковых агентов. Углеводы. Res. 2008; 343: 995–1003. DOI: 10.1016 / j.carres.2008.02.011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 45. Aratanechemuge Y., Hibasami H., Sanpin K., Katsuzaki H., Imai K., Komiya T. Индукция апоптоза лупеолом, выделенным из мокумена ( Gossampinus malabarica L.Merr) в клетках промиелотического лейкоза человека HL-60. Онкол. Rep. 2004; 11: 289–292. doi: 10.3892 / или 11.2.289. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 46. Редферн Дж., Киннинмонт М., Бурдасс Д., Верран Дж. Использование экстракции этанолом Сокслета для производства и тестирования растительного материала (эфирных масел) на их антимикробные свойства. J. Microbiol. Биол. Educ. 2014; 15:45. DOI: 10.1128 / jmbe.v15i1.656. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 47. Leich E., Weissbach S., Klein H., Grieb T., Pischimarov J., Stühmer T., Chatterjee M., Steinbrunn T., Langer C., Eilers M. На множественную миелому влияют множественные и гетерогенные соматические мутации в сигнальных молекулах адгезии и рецепторной тирозинкиназы. Рак крови J. 2013; 3: e102. DOI: 10.1038 / bcj.2012.47. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 48. Efferth T., Sauerbrey A., Olbrich A., Gebhart E., Rauch P., Weber H.O., Hengstler J.G., Halatsch M.-E., Volm M., Tew K.D. Молекулярные механизмы действия артесуната в линиях опухолевых клеток. Мол. Pharmacol.2003. 64: 382–394. DOI: 10,1124 / моль. 64.2.382. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 50. Хегази М.-Э.Ф., Абдельфатах С., Хамед А.Р., Мохамед Т.А., Эльшами А.А., Салех И.А., Реда Э.Х., Абдель-Азим Н.С., Шамс К.А., Сакр М. Цитотоксичность 40 экстрактов египетских растений, воздействующих на механизмы, воздействующие на устойчивые к лекарствам раковые клетки . Фитомедицина. 2019; 59: 152771. DOI: 10.1016 / j.phymed.2018.11.031. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 51. Мбавенг А.Т., Битчагно Г.Т., Куэте В., Тане П., Эфферт Т. Цитотоксичность унгеремина в отношении многофакторных лекарственных устойчивых раковых клеток и индукция апоптоза, ферроптоза, некроптоза и аутофагии.Фитомедицина. 2019; 60: 152832. DOI: 10.1016 / j.phymed.2019.152832. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 52. Абдельфатах С., Бёкерс М., Асенсио М., Кадиоглу О., Клингер А., Флейшер Э., Эфферт Т. Изопетазин и S-изопетазин в качестве новых ингибиторов Р-гликопротеина против раковых клеток с множественной лекарственной устойчивостью. Фитомедицина. 2020: 153196. DOI: 10.1016 / j.phymed.2020.153196. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 53. Куэте В., Мбавенг А.Т., Санджо Л.П., Зейно М., Эфферт Т. Цитотоксичность и механизм действия природного нафтохинона, 2-ацетил-7-метоксинафто [2, 3-b] фуран-4, 9-хинона по отношению к многофакторные лекарственно-устойчивые раковые клетки.Фитомедицина. 2017; 33: 62–68. DOI: 10.1016 / j.phymed.2017.07.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 54. Мбавенг А.Т., Фотсо Г.В., Нгнинтедо Д., Куэте В., Нгаджуи Б.Т., Кеумеджио Ф., Андраэ-Маробела К., Эфферт Т. Цитотоксичность эпунктанона и четырех других фитохимических веществ, выделенных из лекарственных растений Garcinia epunctata и Portolobium contortolobium в отношении многофакторных лекарственных устойчивых раковых клеток. Фитомедицина. 2018; 48: 112–119. DOI: 10.1016 / j.phymed.2017.12.016.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 55. Adem F.A., Mbaveng A.T., Kuete V., Heydenreich M., Ndakala A., Irungu B., Yenesew A., Efferth T. Цитотоксичность изофлавонов и бифлавоноидов из Ormocarpum kirkii в отношении многофакторного лекарственно-устойчивого рака. Фитомедицина. 2019; 58: 152853. DOI: 10.1016 / j.phymed.2019.152853. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 56. Наката С., Йошида Т., Хоринака М., Шираиши Т., Вакада М., Сакаи Т. Ингибиторы гистон-деацетилазы активируют рецептор смерти 5 / TRAIL-R2 и повышают чувствительность апоптоза, индуцированного TRAIL / APO2-L в клетках злокачественных опухолей человека.Онкоген. 2004. 23: 6261–6271. DOI: 10.1038 / sj.onc.1207830. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 57. Папи А., Фарабеголи Ф., Иори Р., Орланди М., Де Никола Г.Р., Багатта М., Анджелино Д., Дженнари Л., Нинфали П. Витексин-2- О -ксилозид, рафазатин и (-) -эпигаллокатехин-3-галлат синергетически влияет на рост клеток и апоптоз клеток рака толстой кишки. Food Chem. 2013; 138: 1521–1530. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2012.11.112. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 58. Чжао К., Кречмер Н., Бауэр Р., Эфферт Т. Шиконин и его производные подавляют передачу сигналов рецептора эпидермального фактора роста и синергетически убивают клетки глиобластомы в сочетании с эрлотинибом. Int. J. Рак. 2015; 137: 1446–1456. DOI: 10.1002 / ijc.29483. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Легенда о Боге совершенствования — v2 Chapter 3813

Сяо Хуа и другие ясно слышали слова Чэнь И. Сяо Хуа слегка покачал головой и сказал по одному слову за раз: «Некоторые люди могут прощать, некоторые — нет.Простите хороших людей, которые на время делают ошибки, могут собрать хорошие плоды и простить их на мгновение. Нечестивые могут только пожинать плоды! »

«Я… я…» Чэнь И все еще хочет что-то спорить. Волшебная пушка конца света принесена в жертву. «Эй…» Призраки призраков и волков несутся, и они будут окутаны на расстоянии, но это пальцы. В мгновение ока все задыхается, все заговоры, все обиды, все расчеты превращаются в пустое место.

Было собрано похожее на дракона волшебное ружье, и тысяча волшебных духов также была собрана в волшебное ружье. Под магическим духом раскрылся ужас паники.

Стиль этого ружья их уже шокировал. Они никогда не думали, что в мире есть такие могущественные монахи, но они два мастера Юань Инь, десятки монахов Цзиндань и Чжуцзи, по сравнению с обычным боевым искусством. Более могущественный! Это как выстрел, все пропало.

«Эй, пусть тебе идет кровь!» Сяо Хуа посмотрел на Юаня, взял волшебный пистолет и снова подавил царство, вздохнул Сяохуа.«Если ты работаешь на учителя, ты не можешь получить это для учителя». рука.»

«Хозяин добр, не любит крови, и их сила слишком слаба. Как Учитель может позволить этому работать? Пусть ученики сделают это за вас! » Юань Я не обеспокоен. «Такое убийство также полезно для развития учеников!»

«Ну, поймите за учителя!» Сяо Хуа сказал, еще раз запечатав силу Юань Я в царстве Цзинь Дань.

«Настоящие люди! Это действительно Сяо Чжэньжэнь! В мире нет аналогов, Сяочжэн! » В отличие от паники текстов и других людей, Yu Yu более уважаем, он не мог не плакать: «С реальными людьми я буду миром.«Самая большая ……»

Сказав это, Юй внезапно понял, что это неуместно, поспешно заткнулся и посмотрел на это ощущение немного смущенно.

Сяо Хуа нахмурился, глядя на Юй Юй: «Что ты имеешь в виду? Могли бы вы быть шедевром боевого искусства, посланным Ю Лейцзуну? »

Юй Юй поспешил вниз и сказал: «Настоящие люди, молодое поколение действительно является учеником Ю Лэйцзуна, а не учеником творения. Однако семья молодого поколения обладает благодатью настоящего человека, а семья молодого поколения считает настоящего человека Святым Духом в этом мире.В дверь за дверью, но молодое поколение, как и многие монахи, считает себя учеником! »

«Шелк…» Сяо Хуа внезапно понял, кто он такой, и вдохнул холодный воздух. Он уже понимал, почему Чэнь Имин знал, что он Сяо Хуа, и у него не было особого контроля. Ему приходилось делать это самому, даже если он не мог этого выдержать. Убить!

Сунь Цянь рядом с «предшественником…» поспешно сказал: «Вы не вините перья. Так обстоит дело в даосских сектах Трех Королевств.Нет, даже у фехтовальщиков Шуго Цзяньси много таких ситуаций. После всего. Милость настоящего человека … во всем мире! »

«Ну…» Сяо Хуа кивнул и сказал: «Старик понимает, что если не так много голосов других, практика старика будет чем-то особенным …»

Говоря об этом, Сяо Хуа внезапно почувствовал себя некомфортно и поспешно улыбнулся: «Сунь Цянь, тебе не нужно звонить предшественнику Сяо, просто звони Сяочжэньжэнь!»

«Да, Сяо Чжэньжэнь!» Красивое лицо Сунь Цяня показывает стыд, но рука, которую держат вместе с лирикой, не расслабляет.Это доспехи на всю жизнь, и от них сложно защитить себя. Женщина, разрывая маску, больше других стремится просто получить привязанность.

«Учитель… старший брат…» Он сказал что-то неловкое. «Ты … ты слишком сдержанный? Я думал, что ты монах в среднем и позднем юанях, в лучшем случае… но я не ожидал, что ты станешь учеником ». Все они настолько сбиты с толку, что я не знаю, из какого он царства. Какое ваше царство? »

Сяо Хуа улыбнулся, посмотрел на него и сказал: «Что такое царство брата? Или, что важно, меня не волнует, из какого царства твой брат? »

«Эй, это мне нравится…» Он улыбнулся и сказал: «Если это…»

К сожалению, я только что сказал два слова, взгляд моих глаз изменился, и я больше не сказал этого.Вместо этого я обернулся и сказал: «Если старший брат дает мне еще какие-то льготы, то я бы хотел больше!»

«Ой, разве не все так просто?» Сяо Хуа, не колеблясь, достал сумку для хранения вещей и протянул ее быстрой дороге. «Это тебе!»

«Брат, я говорю об игре!» Он сказал, что играет естественно. Ей хотелось скрыть слова, которые она почти сказала, но она могла серьезно относиться к Сяохуа. Она была смущена.

Сяо Хуа улыбнулся и сказал: «Вы не говорите, я должен отдать его своему брату.Если я не виделись столько лет, как я могу встретиться? »

«О, тогда спасибо, брат!» Он и Сяо Хуа пережили вместе, естественно знают характер Сяо Хуа, но также были не очень вежливы, взяли сумку для хранения, не посмотрели на нее и закрыли ее.

Сяо Хуа также смотрит на тексты, которые никогда не произносились. Я подумал об этом: «Ши Бо, Гун Фа Цзинь Дань и им подобные, молодое поколение пока не даст вам, дадут вам какие-то духовные вещи, чтобы восполнить жизненный предел! В ожидании восполнения своего жизненного лимита подрастающее поколение поможет беременным, после малыша все хорошо… »

Сказал, Сяо Хуа достал несколько Сяньтао, врученных текстам песен, Сунь Цянь и даже Ю и Юй Юй.

«Настоящий мужчина, что это?» Ян Юй взял Сяньтао, некоторые озадаченно спросили: «Может ли эта штука заполнить предел жизни?»

«Это Сяньтао!» Сяо Хуа объяснил. «Это может составлять некоторые жизненные ограничения, но это варьируется от человека к человеку. Конечно, сейчас он вам не нужен. Вы можете закрыть его и подождать позже. Теперь твоя задача — захватить город Тонглу ». Сумки для хранения и летающие лодки монаха были упакованы и переданы сенсационному учителю! »

«Ну!» Yu Yu выслушал большую радость, собрал сказочный персик и радостно пошел убирать беспорядок.

«Я оставлю его себе?» Я подумал на мгновение и сказал: «Я уже принимал Huichun Dan раньше».

«Ешь!» — прошептала Сяо Хуа. «Это очень много для братьев. Это ранний последователь! »

Слова Сяо Хуа внезапно напомнили мне некоторые воспоминания. Она сдержала глаза и сказала: «Да, брат!»

Затем откусите персик, позвольте сладкому соку и радости воссоединения проникнуть в сердце.

Лирические глаза смотрели на Сяо Хуа сложными глазами.В том же году он впервые обнаружил, что Сяо Хуа безымянный. Вид шока, которого не было сотни лет, а теперь он встречается с Сяо Хуа, — это шок, который в сто раз сильнее, чем раньше. Он не знает, как противостоять этому уважающему себя высокопоставленному монаху! Ученики Сяо Хуа могут легко убить Юань Ин Чен И, силу Сяо Хуа… Боюсь, что Ю Лэйцзуну трудно оглянуться назад.

Конечно, ощущение шока, и больше сердца все еще смущает смерть Чэнь Ичжи.Лирик — человек нерешительный, а также отзывчивый. Из-за этого он задержался и задержал Сунь Цяня. Теперь Чен И настолько мертва перед ней, что в одно мгновение все воспоминания о Чэнь И и моей жизни остались в моем сердце.

Зная, что любовник не Сунь Цянь, Сунь Цянь ничего не сказал, только молча наблюдая за ощущением, так называемой любовью с глубокими обидами, это не так.

Выпив полчашки чая, Юй вернулся, почтительно передал несколько пакетов для хранения и сказал: «Шизу…»

«О…» Ощущение вернулось к Богу.Он спросил, глядя на сумку для хранения вещей, и спросил: «Эй, трупы монахов в городе Тонглу? Почему нет?»

«禀 师祖…» — поспешно ответил Юй. «Ученики не видели трупов, только мешки для хранения вещей, инвентарь и летающие лодки!»

«Ши Бо уверен!» Сяо Хуа поспешно объяснил: «Хотя труп не видно, конец света — только убить их, а не стереть богов, души этих монахов вошли в реинкарнацию…»

«О, хорошо, плохая дорога понимает…» — вздохнули и сказали Юй Юдао: «Это люди Сяочжэня, пусть Сяочжэнь заберет их!»

Сяо Хуа улыбнулся и сказал: «Ши Бо, так называемый узел, — это просто предмет хаоса и хаоса.В таком случае лучше отложить это в сторону. Об этом просто бесполезно думать! Что касается этих пошлых вещей, в то время учитель сыновней почтительности молодого поколения, Ши Бо Хи, позволил Ю Ю взять их первым и вернуть ученику Ши Бо ».

«Ну, это то, что сказал настоящий человек!» Сунь Цянь больше не мог этого выносить. Он пожал ему руку и сказал: «Сначала соберем перья».

«Да, молодое поколение понимает!» Юй послушал и с радостью забрал сумку для хранения вещей.

Рядом с тараканом убеждал: «Ши Бо, скорей, этот сказочный персик очень хорош!»

По его словам, он наугад посмотрел на сумку для хранения, присланную Сяо Хуа, и это не имело значения. Маленький ротик был почти потрясен.

Сяо Хуа знал об этом, повернулся, чтобы посмотреть на него, и слегка кивнул. Я тоже улыбнулся и бережно хранил сумку для хранения.

Я не хочу есть Сяньтао, но Сунь Цянь точно не станет его есть. Хотя настроение не очень хорошее, я все же могу аккомпанировать сказочному персику.Лирический ремонт неглубокий, и я не могу заметить дополнения к пределу жизни. Тепло от прикосновений разлилось по всему телу, и чувство тепла исходило из его сердца.

«Сенсация…» — воскликнул Сунь Цянь. «Ты … твои волосы …»

«Что случилось?» Я не мог думать о фруктовом эффекте Сяньтао. Некоторое время он не отвечал. Это было очень странно.

«У Бога есть глаза!» Сунь Цянь была так счастлива, что заплакала и поспешно махнула правой рукой, появилось зеркало, но внутри зеркала сенсационные белые волосы почернели невооруженным глазом, а морщинки между лбами тоже были немного спокойными.

Конечно, после процентной ставки волосы перестали чернеть, и это был тот вид белого цветка, который был знаком с предыдущим исчезновением. Тем не менее, Сяо Хуа также понимал, что лирический предел жизни сильно пополнился, только ощущения на сотню.В остальное время года, когда вы наступите на Юань Инь, прожить еще тысячу не составит труда. годы.

Ps: Вам нравится эта книга, перейдите к начальной точке, чтобы подписаться на поддержку, проголосовать за месяц, проголосовать за рекомендацию, сбор, вознаграждение, спасибо за все формы поддержки! ! (Продолжение следует.)

Читать Очаровательный принц балует свою жену Гений Доктор Недобросовестная супруга Глава 1908

Доступно множество разновидностей статей Lorem Ipsum, однако львиная доля претерпела изменения в некоторой структуре, благодаря добавленному юмору или случайным словам, которые даже не выглядят в некоторой степени заслуживающий доверия. Если вы будете использовать запись Lorem Ipsum, вы должны убедиться, что в центре текста нет ничего унизительного. Все генераторы Lorem Ipsum в Интернете, как правило, перефразируют заранее определенные глыбы как необходимые, что делает его основным подлинным генератором в Интернете.Он использует словосочетание из более чем 200 латинских слов, соединенных с небольшим набором модельных структур предложений, чтобы создать Lorem Ipsum, который выглядит разумным. Таким образом, произведенный Lorem Ipsum в каждом случае свободен от повторений, добавленного юмора, слов, не являющихся товарными знаками, и т. Д.

Запомните [wuxiaworld.online] на одну секунду, обновляйте быстро, без всплывающих окон, можно читать!

Я заметил, что Сяо Хэй и Сяо Бай смотрели своими глазами. Белый лев покачал головой, и выражение его лица все еще было очень гордым.

Тот, кто делает продажи Сяохэй и Сяобайс, вошел в привычку, всегда имел обыкновение выступать перед другими с самой маленькой внешностью.

Знаете, когда Сяо Хэй и Сяо Бай находятся в пустынном мире, цифра действительно небольшая.

Тот, кто позволил ему вырасти, теперь не имеет возможности ходить с хозяйкой, Сяохэ и Сяобай все еще могут сидеть на плече хозяина, по сравнению с его сердцем, также очень неуравновешенным.

Однако, кажется, всегда есть свои преимущества.

После того, как он увидел зверя с вековой красной косметикой, у И Ифаня также появился непонятный цвет в глазах.

Когда он узнал, что представляет собой красный макияж Бейли, его сердце было полно сюрпризов, но после внимательного рассмотрения он почувствовал, что красный макияж был настолько хорош. Неудивительно, что у меня такая личность.

Возможно, этот тож действительно уместен.

По контракту зверя И Фань тоже полон тоски, но он также знает, что слишком сложно получить монстра, который ему подходит.

Даже во всем Обетовании практикующих, у которых есть контрактные звери, не так много.

Янь Ифань медленно подошла к переднему краю с красным макияжем, красивым лицом и хитрой улыбкой.

«Барри, девочка, это твое контрактное животное?» — спросил И Ифань голосом.

У него не было идеи играть в черное и белое, но ему всегда было любопытно узнать о практикующем, у которого был контрактный зверь.

В глубине души он никогда не отказывался от своего собственного контрактного зверя, поэтому, когда он видит, что у других практикующих есть контрактное животное, он не может не захотеть узнать несколько моментов.

Таким образом, когда у него будет шанс в будущем, он сможет найти контрактного зверя, который ему больше подходит.

Сто миль красной косметики смотрели на любопытство и зависть в глазах И Фанфаня, но И Ифань не показал цвет его глаз.

Так же, как целостность личности Yi Fans может быть отражена в любое время.

Красный макияж Байли слегка кивнул и улыбнулся: «Да, это мой контрактный зверь».

Услышав ответ сотенкильного красного грима, И Фань не удивился, но его глаза посмотрели на трех монстров, а затем спросил: «Я не знаю, кто из них ваш контрактный зверь?»

Но глаза трех зверей упали на тело И Ифань.У тех, кто внезапно появлялся и спрашивал о них, было очень сложное настроение.

Однако кажется, что отношения с владельцем должны быть хорошими, поэтому они не враждебны.

«Все они мои звери». Красный макияж медленно выходит.

Я не хотел рассказывать другим, что у нее было три заразившихся зверя, потому что в то время она была слишком слаба.

Если новость известна другим, это неизбежно повысит ее точку зрения.

Ее сила теперь намного сильнее, чем была вначале, и нет необходимости продолжать ее скрывать.

Когда прозвучал голос сотенкильного красного макияжа, глаза И Ифань наполнились густым печальным цветом.

Он был шокирован, увидев красный макияж, и задался вопросом, не ошибся ли он?

Нанял трех монстров?

Это просто невозможно.

Просто, глядя на лицо в сто-мильном красном гриме, это не шутка.

Практикующие вокруг очень обеспокоены ситуацией с тремя закрученными зверями гримасы Байлихонг.Поэтому, когда Ифань попросила макияж Bailihong, все они внимательно выслушали ответ макияжа Bailihong.

Читающий будет занят понятным содержанием страницы, глядя на ее формат. Цель использования Lorem Ipsum заключается в том, что он имеет довольно типичное присвоение букв вместо использования «Контент здесь, контент здесь», что делает его похожим на многозначительный английский. Многочисленные рабочие области, распространяющие пакеты и редакторы страниц, в настоящее время используют Lorem Ipsum в качестве содержимого модели по умолчанию, и поиск «lorem ipsum» откроет для себя многие сайты, все еще находящиеся в начальной стадии.В течение длительного периода времени развивались различные варианты, в некоторых случаях непреднамеренно, иногда намеренно (с добавлением юмора и т. Д.).

Прочитать Чарующий принц балует свою жену Гений Доктор Беспринципный консорт Глава 1

Доступно множество разновидностей статей Lorem Ipsum, но львиная доля их структур претерпела изменения в той или иной структуре из-за добавленного юмора или случайных слов, которые не выглядят даже несколько заслуживающий доверия. Если вы будете использовать запись Lorem Ipsum, вы должны убедиться, что в центре текста нет ничего унизительного.Все генераторы Lorem Ipsum в Интернете, как правило, перефразируют заранее определенные глыбы как необходимые, что делает его основным подлинным генератором в Интернете. Он использует словосочетание из более чем 200 латинских слов, соединенных с небольшим набором модельных структур предложений, чтобы создать Lorem Ipsum, который выглядит разумным. Таким образом, производимый Lorem Ipsum в каждом случае свободен от повторений, приправленного юмором, слов, не являющихся товарными знаками, и так далее.

Pain.
Ее голова взорвалась от боли, как будто ее тело сбила машина.Спазмы боли сотрясали ее тело, чрезвычайно мучительно.

Байли Хуанчжуан изо всех сил пыталась открыть глаза, но когда она мельком увидела странные вещи вокруг себя, она полностью проснулась.

Где это место?

Ее глаза были темными и бездонными, как колодец, сверкающими мудростью. Она хорошо помнила, когда нашла таинственное кольцо в гнезде фениксов, и как ее кровь случайно капала на его поверхность.

Затем внезапно подул ветер, и мир вокруг нее стал ярким, прямо перед тем, как она проснулась в этом странном месте.

Ссс!

Байли Хуанчжуан нахмурился. Ее руки схватились за голову, когда бесчисленные воспоминания, одни незнакомые, другие знакомые, возникли в ее голове, почти перегружая ее.

Несколько мгновений спустя ее головная боль медленно утихла. Смятение в глазах Байли Хуанчжуан исчезло, но потрясение в ее сердце не могло быть более сильным.

Я действительно пересекал миры? Байли Хуанчжуан посмотрела на себя с изумлением. Кроме того, я прошла через тысячелетие на континенте Шэнсюэ?

Изначально она была самой молодой главой аристократической семьи на континенте Шэнсюэ, обладала несравненным талантом и своей репутацией, известной во всем мире.

Но она не ожидала, что из-за кольца ее душа пройдет через тысячу лет на континенте Шэнсюэ в тело дочери генеральского мусора!

По совпадению, эту девушку также звали Байли Хуанчжуан!

Жаль, но юная мисс генерала не имела отцовской любви, а ее биологическая мать умерла рано. К счастью, у нее была помолвка с наследным принцем, и тем самым она сохранила свой статус.

Но юная мисс никогда бы не предсказала, что она внезапно ослепнет 3 месяца назад, потеряв право стать императрицей.

Когда император вчера объявил, что брак будет отменен, Байли Хуанчжуан просто не смог этого принять и решил покончить жизнь самоубийством, проглотив золото.

Кстати, часть заслуги в этом самоубийстве также принадлежит хорошей старшей сестре Байли Хуанчжуан, Байли Юян.

Вчера, пытаясь утешить ее, Байли Юян произнес злые слова, рассердив Байли Хуанчжуан еще больше.

Очень вероятно, что ее собственная слепота была связана с Байли Юян!

Какое кольцо сломано ?! Байли Хуанчжуан сердито выругался.

От потрясающе талантливого молодого главы семьи до бесполезной дочери генерала — разрыв действительно не мал, а!

Байли Хуанчжуан вздохнула и опустила голову. Внезапно ее глаза расширились — Таинственное черное кольцо было прямо там, в ее руке!

Как. Как это могло произойти?

Байли Хуанчжуан был ошеломлен и осторожно прикоснулся к кольцу. Неужели она и кольцо прошли вместе?

В этот момент за дверью послышались череда прекрасных шагов, за которыми последовала фигура мужчины и женщины, обнимающихся вместе, когда они вошли в поле зрения Байли Хуанчжуана.

Эта пара, мужчина и женщина, были не кем иным, как Байли Юян и наследным принцем Сюаньюань Хуанем!

Баили Юян отличался от Байли Хуанчжуан, это пустая трата времени. Ее врожденный талант был выдающимся, что принесло ей известность, несмотря на то, что она была так молода.

Таким образом, генерал Мустве уже давно планировал позволить Байли Юян заменить ее в качестве будущей императрицы!

Когда эти двое увидели живого Байли Хуанчжуана сидящим на кровати, на их лицах вспыхнуло удивление.

Они ясно слышали, как горничная сообщила, что Байли Хуанчжуан больше не дышит, так почему же она не умерла?
Хорошая сестренка, как ты могла так волноваться из-за таких мелочей? Самоубийство, вы на самом деле пытались покончить жизнь самоубийством!

Байли Юян бросился на сторону Баили Хуанчжуана.Хотя ее лицо было полно тепла и нежной заботы, на самом деле ее глаза были полны глубокого отвращения.

Вчера она так много сказала, чтобы заставить ее покончить жизнь самоубийством. Когда она услышала отчет сегодня утром, ее сердце было в восторге. Но она не ожидала, что этот мусор еще не умер!

Хлам действительно мусор! Байли Хуанчжуан даже не может убить себя должным образом, в следующий раз, ракушка, протяни ей руку!

Читающий будет занят понятным содержанием страницы, глядя на ее формат.Цель использования Lorem Ipsum заключается в том, что он имеет довольно типичное присвоение букв вместо использования «Контент здесь, контент здесь», что делает его похожим на многозначительный английский. Многочисленные рабочие области, распространяющие пакеты и редакторы страниц, в настоящее время используют Lorem Ipsum в качестве содержимого модели по умолчанию, и поиск «lorem ipsum» откроет для себя многие сайты, все еще находящиеся в начальной стадии. В течение длительного периода времени развивались различные варианты, в некоторых случаях непреднамеренно, иногда намеренно (с добавлением юмора и т.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.